Blod insamling och bearbetning
Alla förfaranden som innefattar insamling av blod från friska frivilliga var i enlighet med de Mänskliga forskningsetisk Kommitté av University of Sydney (godkännande HREC 2014/244) och informerat samtycke erhölls från alla individer., Alla förfaranden som innefattar insamling av blod från ECMO-patienter var i enlighet med Alfred Hospital Etik, Monash University Ständiga Kommittén för Forskning på Människor (godkännande 388/13) och informerat samtycke erhölls från alla individer. Alla förfaranden var förenliga med Helsingforsförklaringen från 1983. Blod samlades genom venesection med hjälp av en 21 g fjäril Terumo nål från 10 friska donatorer på inga mediciner (fyra män, sex kvinnor, 22-58 år)., De första 5 mL blod kasserades för att undvika trombin som kan ha genererats runt injektionsstället och drogs sedan in i rör innehållande 3, 2% v / v natriumcitrat. Blod från åtta patienter vid ett enda centrum som hade ECMO-stöd (fyra män, fyra kvinnor, 34-67 år) drogs in i ACD-a-rör (BD Vacutainer)., Patienter med ECMO-stöd fick anti-koagulations-och/eller trombocythämmande läkemedel baserat på klinikernas eget gottfinnande eller institutionella riktlinjer där patienter vanligtvis påbörjade warfarin, target international normalized ratio (INR) 2-3, med överbryggande heparininfusion och aspirinbehandling, liksom dipyridamol för dem som anses vara hög risk för trombos. Plasma framställdes genom två gånger centrifugering vid 800 × g under 20 min vid rumstemperatur., Vid vissa tillfällen klipptes frisk donatorplasma med en hastighet av 2000 s-1 eller 10000 s−1 i 5 min vid rumstemperatur med hjälp av en Kinexus Pro+ rheometer.
hepatocyt fibrinogen samling
den humana levercancercelllinjen HepG2 (ATCC, HB-8065) odlades i DMEM, 10% fetal kalv serum och glutamax vid 5% CO2 och 37 ° C. celler vid 80-90% sammanflödet tvättades med fosfatbuffrad saltlösning, inkuberades under 18 h i DMEM utan serum vid 5% CO2 och 37 °C eller i en hypoxisk kammare vid 1% O2, 5% CO2 och 37 °C., Det konditionerade mediet uppsamlades (1 mL per 4 × 106 celler) och det utsöndrade fibrinogenet behandlades omedelbart enligt beskrivningen nedan.
Fibrinogen-och fibrin-analyser
plasmaprover var obehandlade eller inkuberade med trombin och / eller fibrinpolymerisationshämmaren GPRP (Sigma). Fibrin framställdes i 1 mL plasma genom tillsats av 50 enheter bovint trombin (Sigma) och 10 mM CaCl2 och MgCl2 i 40 min vid 22 °C. fibrinpolymererna samlades med en plaststav., I ett experiment inkuberades plasma (2 mL) med 27 enheter/mL trombin och 10 mM CaCl2 och MgCl2 i 40 min vid 22 °C och fibrinpolymeren uppsamlades på en plaststav och avlägsnades. Den utarmade plasman inkuberades med en annan alikvot på 27 enheter / mL trombin och den nya fibrin-polymeren uppsamlades och avlägsnades. En alikvot av plasma (0, 2 mL) samlades före och efter tillsats av båda partierna trombin, 150 µM d-fenylalanyl-prolyl-arginylklormetylketon (Ppack, Sigma) tillsatt för att hämma trombinaktiviteten och proverna inkuberades under 16 timmar vid 22 ° C., Fibrinogenhalten i plasmaproverna uppskattades genom att proteinet samlades på polyklonala antifibrinogenantikroppsbelagda pärlor (se följande avsnitt), vilket löste fibrinogen på SDS-sida och färgning med kolloidal Coomassie. I ett annat experiment, plasma var inkuberas med 8 mM GPRP (Sigma) i 5 min vid 22 °C före tillsats av 50 enheter/mL av trombin 60 min vid 22 °C. reaktionen var härdas med 150 µM av PPACK för 10 min vid 22 °C. Renat fibrinogens var isolerade från friska givare färskfryst plasma av β-alanin precipitation32 eller köpa i handeln (Sigma F4883).,
kvantifiering av redoxtillstånd för fibrinogen-och fibrindisulfidbindningar
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) var belagda med 16 µg polyklonala antifibrinogenantikroppar (dako, Cat A0080, Lot 00015063) i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning på ett roterande hjul för 1 timme vid 22 °C och den överskjutande antikroppen avlägsnades genom tvättning tre gånger med 1 mL fosfatbuffrad saltlösning. Plasma (0, 7 mL) eller HepG2-konditionerat medium (4, 5 mL) inkuberades med 2 mg belagda pärlor på ett roterande hjul för 1 h vid 22 °C., Pärlorna samlades med en magnet, överskott plasma aspireras för att minska volymen, och inkuberades i 0,3 mL av 5 mM 12C-IPA i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 10% DMSO för 1 h vid 22 ° C i mörkret till alkylat oparade Cys tioler i proteinerna. Supernatanterna aspirerades och pärlorna inkuberades med NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies) innehållande ytterligare 5 mM 12C-IPA i 30 min vid 60 °C. supernatanterna löstes på SDS-sida., Fibrinpolymerer som alstras i plasma uppsamlades på en plaststav och nedsänktes omedelbart i 1 mL 5 mM 12C-IPA i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 10% DMSO för 1 h vid 22 ° C i mörkret. Fibrin tvättades 3 gånger med fosfatbuffrad saltlösning innan polymeren upplöstes i 1 mL 20 mm ättiksyra i 24 timmar vid 22 ° C. tjugo mikroliter av lösningen inkuberades med NuPAGE LDS sample buffert (Life Technologies) innehållande 5 mM 12C-IPA i 30 min vid 60 °C och proteinerna upplöstes på SDS-sida., Renad fibrinogen (12 µg) inkuberades med 5 mM 12C-IPA i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 10% DMSO för 1 h vid 22 °C i mörkret och proteinet löst på SDS-sida.
SDS-SIDGELERNA målades med kolloidal coomassie (Sigma)och fibrin(ogen) banden skars ut, destained, torkades, inkuberades med 40 mM ditiotreitol och tvättades14. Gelskivorna inkuberades med 5 mM 13C-IPA (Cambridge isotoper) för 1 h vid 22 °C i mörkret till alkylat disulfidbindningscysna, tvättades och torkades före uppslutning av proteiner med 12.,5 ng/µL trypsin (Promega) i 25 mM NH4CO2 över natten vid 25 °C. peptider eluerades från skivorna med 5% myrsyra, 50% acetonitril. Nano-vätskekromatografi (nano-LC) utfördes med hjälp av en Ultimat 3000 HPLC och autosampler system (Dionex). Prov injicerades i en fritless nano-LC kolumn (75 µm x ~12 cm) som innehåller C18 media (1.9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) och uppvärmd till 45 °C för alla körningar. Peptider eluerades med en linjär gradient över 52 min, med en flödeshastighet av 0,2 µL / min. Mobil fas a bestod av 0.,1% myrsyra i H2O, medan mobil fas B bestod av acetonitril: H2O (8:2) med 0,1% myrsyra. Gradienten var: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B och 52 min 2% B. högspänning (2000 V) applicerades på en låg volym tee (Upchurch Scientific) och kolonnspetsen placerad ~0,5 cm från den uppvärmda kapillären (T = 275 °C) av en LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) masspektrometer. Positiva joner genererades genom elektrospray jonisering och masspektrometern som drivs i databeroende förvärvsläge., Full scan MS-spektra har förvärvats (m/z 350-1750) av Orbitrap med en upplösning på 30.000. De 15 mest rikliga jonerna (>5000 tal) med laddtillstånd ≥ +2 isolerades sekventiellt och fragmenterades i den linjära jonfällan med hjälp av kollisionsinducerad dissociation med en aktivering q = 0,25 och aktiveringstid på 10 ms vid ett målvärde på 30 000 joner. M/z nyckeltal valts för MS/MS dynamiskt uteslutas för 35 s. Ion Trap Zoom AGC Mål: 3000.00. Ion Trap Full AGC Mål: 30000.00. Ion Trap SIM-AGC Mål: 10000.00. Ion Trap MSn AGC Mål: 10000.00., Data analyserades med hjälp av maskot Daemon (version 2.5.0, Matrix Science) mot Swissprot databas. Sökparametrar var prekursortolerans av 6 ppm och produktjontoleranser av ±0.6 Da, och jodacetanilidderivat (Cys), jodacetanilid 13C derivat (Cys), oxidation (Met) väljs som variabla modifieringar med full tryptisk klyvning av upp till tre missade klyvningar. Med listan över cysteininnehållande peptider som identifieras med hjälp av maskot beräknas deras monoisotopiska mass/laddningsförhållande (m/z) på +2, +3 och +4 med hjälp av MS-Product (Version v 6.2.2, Protein Prospector Tools)., Cys märkt med 12C-IPA eller 13C-IPA har en massa 133.05276 eller 139.07289, respektive. Trettio Cysinnehållande peptider analyserades (kompletterande tabeller 1 och 2). De olika redoxformerna av Cys-resthalterna kvantifierades från den relativa jonhalten av peptider märkta med 12C-IPA och/eller 13C-ipa. För att beräkna Jon överflöd av peptider, extraherade jonkromatogram genererades med hjälp av Xcalibur Qual Browser (v2.1.0; Thermo Scientific). Området beräknades med hjälp av den automatiska toppdetekteringsfunktionen inbyggd i programvaran., Data sökte rutinmässigt efter peptider innehållande fria Cys-tioler och dessa detekterades inte, vilket indikerar att alkylering av oparade Cysrester med 12C – IPA eller 13C-IPA var komplett i proteinet.
Fibrinogendisulfidbunden peptidanalys
friska donatorplasma (0, 7 mL) inkuberades med polyklonala Anti-fibrinogen antikroppsbelagda Dynabeads på ett roterande hjul för 1 h vid 22 °C. pärlorna samlades in, överskott plasma aspireras och 0, 3 mL av 5 mM 12C-IPA i fosfatbuffrad saltlösning innehållande 10% DMSO tillsattes och inkuberades för 1 h vid 22 °C i mörker., Därefter aspirerades supernatanten, pärlorna inkuberades med NuPAGE LDS provbuffert i 30 min vid 60 ° C och supernatanterna löstes på SDS-sida. Gelskivor innehållande fibrinogen tvättades och torkades före matsmältning med 12 ng / µL trypsin (Promega) för 4 h vid 37 °C. reaktionerna stoppades genom tillsats av 5% (v/v) myrsyra och peptider eluerade från gelskivorna med 5% myrsyra och 50% (v/v) acetonitril. Peptider i 0.,1% myrsyra (sista volym 12 µL) löstes på ett 35 cm × 75 µm C18 omvänd fas analytiska kolonnen med en 2-35% acetonitril lutning under 22 min på ett flöde av 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimata 3000 HPLC) och analyseras på ett LTQ Orbitrap Velos masspektrometer som beskrivs ovan. Disulfidlänkade peptider söktes mot Human fibrinogensekvens med hjälp av Byonic analysprogram (version 3.9-7, protein Metrics) med en falsk upptäckt hastighet av 1%. Alla disulfidbundna peptider inspekterades manuellt för noggrannhet., Masstolerans och fragmenttolerans för prekursorer fastställdes till 10 ppm respektive 0,6 Da. Variabla modifieringar definierades som oxiderade Met, oxiderade Cys (mono, di och tri) och glutationylerade Cys med full trypsin klyvning av upp till tre missade klyvningar.
funktionstest för Fibrinogen
renad fibrinogen (0,2 mL av 10 mg/mL i 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) inkuberades med 5 mM 12C-IPA för 1 h vid 22 °C i mörkret till alkylat oparade Cys tioler i proteinet., Den oreagerade IPA-togs bort med hjälp av en 7 kDa MWCO Zeba spin avsaltning av kolumn (Thermo Fisher). Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1,1 mg/mL 50 mM Hepes På 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2 pH 7.4) var inkuberas med 1 enhet/mL bovint trombin (Sigma) för 5 timmar vid 22 °C i en total volym av 0,2 mL 1,5 mL mikrocentrifug-rör. Fibrinpolymererna pelleterades vid 13 000 × g i 15 min och koncentrationen av fibrinogen kvar i supernatanten uppmätt. Funktionalitet uttrycks vid % av fibrinogen konsumeras i fibrin polymerbildning.,
fibrin polymerbildning mätt genom ljusspridning
renad fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mm Hepes, 0.14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuberades med 1 enhet/mL bovint trombin (Sigma). Ökningen i absorbansen vid 350 nm registrerades varje 30 s för 15 min.
fibrinpolymerstruktur mätt med scanningelektronmikroskopi (SEM)
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mm Hepes, 0.14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuberades med 1 enhet/mL bovint trombin (Sigma) för 2 h vid 22 °C i en total volym på 0.2 mL., Fibrinpolymererna sköljdes två gånger med 0,1 m fosfatbuffertlösning (PBS), fixerad med 2,5% glutaraldehyd i PBS över natten vid 4 °c, post-fixerad med 1% OsO4 i PBS, dehydrerad med graderad serie etanol och nästa kritiska punkt torkad med en Leica em CPD300. Proverna var sputter belagda med 15 nm guld (k550x, Emitech) och avbildade med ett Zeiss SigmaHD-Fältutsläppsavsökningselektronmikroskop. Sem-mikrograferna registrerades vid 5 kv accelerationsspänning och ett arbetsavstånd på 5 mm. fiberdiametrar mättes med ImageJ. ,
Fibrin polymer permeationstest
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) inkuberades med 1 enhet / mL bovint trombin (Sigma) för 2 h vid 22 °C i en total volym av 0,2 mL i polypropylen kromatografikolonner med en inre diameter 4,6 mm. kolumnerna överlagrades med 0,8 mL av hepes bufferten och fluss (J) beräknades utifrån vikten av av de droppar som percolated i 20 min. , Permeation (Darcy) constant33 beräknades från förhållandet, Ks = ja / LP, där J är flödet (cm3 / s), är buffertens viskositet (0,01 poise vid rumstemperatur), A är blodproppens tvärsnitt (0,17 cm2), L är längden på blodproppen (1,1 cm) och P är det hydrostatiska trycket (1,018,218 dyne/cm2).
Fibrin polymer packning analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes På 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2 pH 7.4) var inkuberas med 1 enhet/mL bovint trombin (Sigma) för 16 timmar vid 22 °C i en total volym på 0,5 mL i 1.,5 mL mikrocentrifugrör som tidigare belagts med 10 mg/mL PEG-20000 i vatten och lufttorkad. Fibrinpolymererna centrifugerades vid 13 000 × g för 5 till 2400 s och volymen av den vätska som extruderades från polymeren mättes.
Fibrinolys analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1,8 mg/mL 50 mM Hepes På 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2 pH 7.4) var inkuberas med 1 enhet/mL bovint trombin (Sigma) för 2 h vid 22 °C i en total volym på 0,5 mL i 24-brunnars plattor (15.6 mm diameter) för 2 h vid 22 °C. En alikvot av plasmin (5 µL av 0.,59 µM) sattes till mitten av brunnarna och plattorna inkuberades under 18 h vid 37 ° C i en fuktig miljö. Lysytor bestämdes från medelvärdet av två diametrar uppmätta i rät vinkel.
kvantifiering av redoxtillstånd för α2-makroglobulindisulfidbindningar
de 10 friska donatorplasma som beskrivs ovan för analys av fibrinogen användes för analys av α2-makroglobulin med samma förfaranden. Plasma – (0.,7 mL) var inkuberas med polyklonala anti-α2-macroglobulin-antikropp (Dako, Katt Q0102, Mycket 20068567)-belagda Dynabeads (Life Technologies) på en roterande hjul för 1 h vid 22 °C. pärlor samlades in, utöver plasma-aspirerade, och inkuberas i 0,3 mL av 5 mM 12C-IPA i fosfat-buffrad saltlösning innehållande 10% DMSO för 1 h vid 22 °C i mörker för att alkylat oparade Cys tioler i proteiner. Supernatanterna aspirerades och pärlorna inkuberades med NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies) innehållande ytterligare 5 mM 12C-IPA i 30 min vid 60 °C. supernatanterna löstes på SDS-sida., SDS-SIDGELERNA färgades med kolloidal coomassie (Sigma)och α2-makroglobulinbandet skars, destained, torkades, inkuberades med 40 mM ditiotreitol och tvättades14. Gelskivorna inkuberades med 5 mM 13C-IPA (Cambridge isotoper) för 1 h vid 22 ° C i mörkret till alkylat disulfidbindningscysna, tvättades och torkades före uppslutning av proteiner med 12,5 ng / µl trypsin (Promega) i 25 mM nh4co2 över natten vid 25 °C. peptider eluerades från skivorna med 5% myrsyra, 50% acetonitril., Vätskekromatografi, masspektrometri och dataanalys utfördes enligt beskrivningen för fibrinogen34. 17 Cys-innehållande peptider analyserades (kompletterande tabeller 2 och 4). De olika redoxformerna av Cys-resthalterna kvantifierades från den relativa jonhalten av peptider märkta med 12C-IPA och/eller 13C-ipa.
rapporteringssammanfattning
ytterligare information om forskningsdesign finns i Naturforskningsrapporteringssammanfattningen kopplad till denna artikel.