skapandet av en konturplot från direkta experimentella data kräver användning av en genomförbar hög genomströmningsmetod och ett stort antal prover. Analysen måste därför vara lämplig för användning i en 96-brunnsplatta design., De allmänna fördelarna med denna miniatyrisering från enkla reaktionsrör till 96-brunnsplattor har redan visats för DNSA och andra kolorimetriska analyser . Alla analyser användes i denna studie var lämpliga för 96 brunnar format. För att producera en konturplot inkuberades enzymet och substratblandningarna vid åtta olika pH-nivåer. Dessa åtta pH-nivåer inkuberades vid 12 olika temperaturer med hjälp av en gradient PCR-cykler, vilket resulterade i 96 unika reaktionsförhållanden. En plattläsare användes för att erhålla data., Resultaten omvandlades till relativa aktiviteter med den högsta aktiviteten på varje platta som sattes till 100%. Mätningen utfördes i tre exemplar och de genomsnittliga värdena omvandlades därefter till en konturplot med SigmaPlot, som beskrivs i avsnittet material och metoder. Aktiviteten (Z-axeln) representeras som färg från lila till rött istället för en normal axel för att förbättra konturplottens syn.,
buffertsystem
en förutsättning för tillförlitlig bestämning av pH och temperatur optima är ett stabilt buffertsystem som är lämpligt när det gäller enzymaktiviteten och nästan resistent mot ett pH-SKIFT med ökande temperatur. Alternativt kan denna effekt övervägas i konturplotten. Påverkan av temperaturen på buffertens PKA och därmed pH är ett faktum som bör beaktas, särskilt för alkaliska buffertar som Tris ., Som ett krav för analysen testades alla pH–variationer i vårt citratfosfatbuffertsystem för förändring i pH mellan 35 ° C och 80 ° C (se ytterligare fil 4). Alla buffertar visar en liten minskning av pH med stigande temperatur, med buffertarna vid högre pH-värden som visar högre avvikelser. Temperaturberoendet ökar med mängden fosfat, vilket korrelerar med temperaturkoefficienterna för fosfat (- 0,0028) och citrat (0)., Eftersom de temperaturberoende pH-variationerna hos alla buffertar endast var mindre, kunde de försummas vid sammanställningen av konturytorna inom det värdeområde som används här. Om ett annat buffertsystem med en högre temperaturkoefficient ska användas är det dock lätt att anpassa konturplotten för förändringen i pH genom att tilldela varje buffert ett individuellt pH vid varje temperatur., Dessa värden är antingen experimentellt bestämda enligt beskrivningen i respektive material – och metodavsnitt eller härledda från temperaturkoefficienterna och kan därefter användas för att anpassa x-axeln (pH) i den medföljande Sigmaplot-filen.
bestämning av Aktivitetsintervallet för Cel8A
en översikt över de olika enzymer, substrat och analyser som används i denna studie för att skapa respektive konturdiagram ges i Tabell 1.,
Cel8A är en cellulas, mer specifikt en endo-glukanas, från C. thermocellum och var det första enzymet av glykosidhydrolasfamilj 8 med en löst kristallstruktur . I denna studie inkuberades enzymet med BBG för att validera vår föreslagna metod med hjälp av dnsa-analysen. Cel8A har rapporterats ha sin temperatur optimal vid 75 ° C och pH optimal mellan 5, 5 och 6, 5 ., Dessa värden överensstämmer med resultaten av vår konturplot eftersom de ligger inom området > 90% aktivitet (Fig. 1). Vår konturplot visar dock att enzymet är mycket aktivt under ett brett spektrum av olika förhållanden. Enzymet uppvisar acceptabla aktiviteter vid lägre pH-värden när mellan 60 ° C och 65 ° C och utför även med mer än 60% av sin maximala aktivitet vid pH-värden under 4.5. Vår metod ger möjlighet att visualisera sådana effekter och utvärdera ett enzym prestanda när som helst inom de testade parametrarna i korthet.,
Contour plot of Cel8A using the dnsa assay with barley-β-glucan as substrate
för att testa om vår metod är lämplig för olika hydrolastestmetoder, producerade vi en konturplot med Cel8A med hjälp av azo-cm-cellulosa som substrat och respektive test (fig. 2). Handlingen visar liknande optima vid 75 °C och pH 5.5. Användningen av Azo-CM-cellulosa som substrat resulterade emellertid i ett något mindre aktivitetsområde., De mindre skillnaderna mellan de två analyserna kan bero på de olika strukturerna och kopplingstyperna av båda substraten, vilket skiljer sig åt i deras bindningsegenskaper till enzymet. Azo-CM-cellulosa är ett icke-naturligt substrat med tillsatta färgämnesgrupper, vilket kan lägga till ytterligare denna effekt. Med hjälp av Cel8A, kunde vi visa att vår metod ger giltiga data och är lämplig för användning i två olika etablerade analyser för hydrolases: DNSA och Azo-CM-cellulosa.
contour plot of Cel8A using Azo-CM-cellulosa
Activity range determination for Celluclast®
förutom ett enda enzym studerades en enzymblandning. Celluclast® är en allmänt använd kommersiell cellulasprodukt härrörande från Trichoderma reesei. Den består huvudsakligen av cellobiohydrolaser och endo-1,4-β-glukanaser, men har även xylanaser och minst en β-xylosidas . I produkthandboken anges att de optimala aktiviteterna är mellan 50 ° C och 60 ° C och pH 4.,5 och 6.0 . I detta arbete producerade vi först en konturplot för Celluclast® med BBG som substrat med hjälp av dnsa-metoden (Fig. 3). BBG contour plot verifierades med en standardtemperaturkurva (Fig. 4). Resultaten av temperaturkurvan vid pH 5.5 överensstämmer med resultaten av konturplotten, som visar samma aktivitetsområde. Mätningen av separata kurvor är emellertid otillräcklig för att beskriva Celluclasts aktivitet® på BBG. Intervallet av pH i vilket enzymblandningen visar hög aktivitet är starkt temperaturberoende., Ju högre temperatur desto lägre pH måste vara för att uppnå en hög aktivitet. Omkring 45 °C är Celluclast® mycket aktiv (> 60%) upp till ett pH på 6,5, medan det vid 65 °C är mycket aktivt endast upp till ett pH på 5,0. Att beskriva aktiviteten med två separata kurvor är därför strikt beroende av det värde som valts som den statiska parametern. Temperaturgrafer, till exempel de som tas vid de två ytterligheterna i det angivna pH-intervallet (4.5 och 6.0) bör ge signifikant olika resultat. Detsamma gäller för pH-grafer som tas vid olika temperaturer., För att göra denna effekt tydlig, vi producerade standard pH grafer vid 45 ° C, 55 ° C, och 65 °C (Fig. 5). Dessa tre pH-kurvor visar att pH-gränsen för hög aktivitet med ökande temperatur skiftar till mer sura pH-värden. De tre kurvorna verifierar därmed de resultat som ses i konturplotten. Dessutom visar de begränsningarna för den konventionella separata aktivitetsbestämningen, som åtminstone för Celluclast® är, när det gäller pH-kurvorna, beroende av den valda temperaturen., Användningen av vår konturplotmetod kringgår detta problem helt genom att mäta effekten av temperatur och pH i ett steg.
contour plot of Celluclast® using the dnsa assay with barley-β-glucan as substrate
konventionell temperatur optimal bestämning av Celluclast® vid pH 5,0., Den optimala temperaturen för Celluclast® på korn-β-glukan bestämdes vid pH 5,0. Det konventionella tillvägagångssättet visar den maximala aktiviteten runt 55 °C och överensstämmer med resultaten som ses i motsvarande konturplot
konventionellt pH optimal bestämning av Celluclast® vid tre temperaturer. PH optimalt för Celluclast® på korn-β-glukan bestämdes vid 45 ° C, 55 °C och 65 ° C., Vid lägre temperaturer kan enzymet tolerera högre pH-värden. Detta överensstämmer med motsvarande konturplot och visar den starka effekten av den valda fasta parametern vid bestämning av pH eller temperatur optimalt separat
celluclasts aktivitetsområde® på arabinoxylan (AX) (Fig. 6) skiljer sig från det med BBG som substrat. Aktiviteten skiftas särskilt mot lägre temperaturer, utan höga aktiviteter som observeras över 60 ° C., Eftersom Celluclast® är en blandning av flera enzymer är det mest sannolikt att dessa olika enzymer har olika egenskaper. Aktivitetsmönstret liknar emellertid det hos BBG. till exempel vid pH 4.5 är enzymblandningen högaktiv upp till nästan 60 °C, medan vid pH 6.5 är den endast högaktiv upp till 50 °C. I litteraturen bestämdes det optimala av Celluclast® på vetelöslig yxa av en responsytmodell (RSM) och befanns vara runt pH 4.4 och 39 °C ., Vår konturplot visar den högsta aktiviteten i samma temperaturområde och vid ett något högre pH, vilket fortfarande ligger inom det optimala som bestäms av RSM. Medan det optimala är nästan detsamma för båda metoderna, visar vår konturplot påfallande den exakta aktiviteten hos Celluclast® på AX inom hela intervallet av de testade förhållandena och uppvisar en mer detaljerad disposition än RSM. Med våra kontur plottar av Celluclast® på BBG och AX kan vi visa att komplexa enzymblandningar kan analyseras med den föreslagna metoden.
Contour plot of Celluclast® using the dnsa assay with arabinoxylan as substrate
för att ytterligare demonstrera mångsidigheten hos vårt verksamhetsområde, utvärderade vi dess användning med ytterligare substrat och analyser. Celluclasts aktivitet® på p-NP-β-d-glukopyranosid testades och konturplotten visas i Fig. 7. Hög aktivitet på detta substrat är begränsat till ett ganska smalt område mellan pH 4,0 till 5,5 och 55 °C till 70 ° C., Detta tyder på att endast en eller ett fåtal enzymer inom celluclast® enzymblandningen förmodligen visar aktivitet mot p-NP-β-d-glukopyranosid. P-NP-glykosider kan användas som substrat för framställning av konturplaner. Emellertid är inte alla P-NP-glykosider lämpliga substrat i analysen, eftersom flera av dem visar hög bakgrund på grund av instabilitet (se ytterligare fil 5), speciellt när höga temperaturer kombineras med höga pH-värden.
contour plot of Celluclast® using P-NP-β-d-glukopyranosid
för att testa tillämpningen av vår metod på ett naturligt biomassprov valde vi att använda ett halmbaserat substrat. Frigöring av glukos med Celluclast® detekterades med hjälp av den kommersiella d-glucose HK-analysen (Megazyme). Huvudkomponenten i cellväggen av halm är cellulosa, som är den huvudsakliga källan till enzymatiskt befriad glukos. Konturen tomt (Fig., 8) visar därför övervägande Celluclasts aktivitet® på kristallin cellulosa, som är rekalcitrant mot enzymatisk nedbrytning . Den högsta frisättningen av glukos observerades vid ungefär pH 4,0 till 5,5 och 40 ° C till 60 ° C. intervallet med hög aktivitet är därför mindre brett än bestämt för BBG, vilket bör beaktas för en process som huvudsakligen syftar till att försämra cellulosa., Med användning av D-glukos HK och p-NP-β-d-glukopyranosid som alternativa analyser kunde vi visa anpassningsförmågan hos vår metod till totalt fyra olika och vanligen använda glykosidhydrolastester. Användningen av halm visade att vår metod också är lämplig för naturliga substrat av industriell relevans och kan användas för utvärdering av komplexa processer och substrat. Celluclast ® visar varierande aktivitetsprofiler på olika substrat., Kollektivt för alla metoder är det därför viktigt att bestämma pH-och temperaturområdet för ett enzym med substratet av intresse.
Contour plot of Celluclast® using the d-glucose HK assay with a straw-based natural substrate
Contores when using the method
When a contour plot is produced with the proposed method, det finns flera överväganden som bör beaktas., Substratet måste vara stabilt och den uppmätta bakgrunden reproducerbar över hela intervallet av förhållanden i 96-brunnsplattan. Detta är en förutsättning, eftersom substratkontrollen måste subtraheras från alla värden före omvandlingen till relativa aktiviteter, men kan inte mätas direkt på plattan för var och en av 96-förhållandena. Flera P – NP-glykosidsubstrat kan till exempel inte användas, eftersom de visar en hög temperatur-och pH-beroende bakgrund. Mycket exakt pipettering är nödvändig för att ge acceptabla nivåer av standardavvikelse från tre exemplar., Användningen av 96-huvud och 8-kanals pipetter rekommenderas starkt eftersom de förbättrar noggrannheten avsevärt och påskyndar proceduren. Dessutom är plattläsare och gradient PCR-cykler tekniska krav för att utföra metoden korrekt. Det temperaturområde där metoden kan utföras kan anpassas i enlighet med de tekniska egenskaperna hos gradient PCR-cyklaren, som vanligtvis är begränsad till 30 ° C eller 40 °C och ofta inte kan innehålla värden under 20 ° C., Vi omvandlade direkt absorbansen till relativ aktivitet hos ett enzym, eftersom värdena är alla på en linjär kalibreringskurva (data visas inte). Om så inte är fallet måste aktiviteten beräknas först, till exempel i U / mg, och dessa värden kan sedan användas för att producera konturplotten. När man vill producera en konturplot för ett enzym som är starkt beroende av divalenta metalljoner, måste ett annat buffertsystem användas, eftersom citratfosfatbaserade buffertar komplexa dessa joner.,
medan RSM-tillvägagångssätt är ett otvivelaktigt kraftfullt verktyg för att bedöma komplexa relationer, till exempel olika variabler som påverkar flera faktorer, är det inte alltför komplicerat att bestämma effekten av endast pH och temperatur på aktiviteten för att uppnås genom direkt mätning. Bestämning av modellens korrekta gränsvärden kan ta flera tillvägagångssätt och kan påverka den resulterande modellen. RSM-modellen är härledd från endast ett litet antal mätningar runt den centrala punkten i enzymets aktivitet och noggrannheten mot de faktiska experimentella värdena måste testas efteråt., Den övergripande upplösningen av RSM är därför lägre än den som erhålls med vår metod, vilket gör det svårt att se aktivitetseffekter som visas för Celluclast® vid högre temperaturer och/eller pH-värden. Vår metod kräver inte förmåga att utforma komplexa statistiska modeller och kan utföras med minimala och relativt standard tekniska krav. En nackdel både vår metod och RSM-andel är att direkt visualisering av standardavvikelsen inom den tredimensionella tomten inte är möjlig., Vår metod möjliggör dock beräkning av standardavvikelsen för varje enskild datapunkt. De flesta RSM-modeller bestämmer standardavvikelsen för hela modellen endast från data från modellens centrala datapunkt, medan de andra datapunkterna endast mäts en gång . Standardavvikelserna är naturligtvis högre vid gränserna för en enzyms aktivitet och illustrerar en stark inverkan på aktiviteten inom en liten förändring av förhållandena. Runt det optimala och inom områden med ingen eller låg aktivitet är avvikelser betydligt lägre., Eftersom den föreslagna metoden resulterar i en fullständig faktoriell datamängd, skulle det vara möjligt att beräkna en statistisk modell om det behövs för ytterligare analys. Den härledda statistiska modellen skulle baseras direkt på experimentella data, men är ett ytterligare steg som inte bör vara nödvändigt för standardapplikationer av metoden.
Sammanfattningsvis är enkel bedömning av ett enzym eller en enzymblandnings lämplighet för en kombination av processparametrar av avgörande betydelse vid utformningen av biotekniska processer i laboratorie-eller industriell skala., Temperatur och pH är två av de viktigaste processfaktorerna som påverkar enzymaktiviteten. Konventionella metoder för att testa effekten av dessa faktorer på enzymer bygger på antagandet att det finns en tvådimensionell korrelation mellan temperatur och aktivitet samt pH och aktivitet. Däremot bestämmer nya tillvägagångssätt förhållandet i tredimensionell materia, men är statistikbaserade, komplexa att utforma och deras noggrannhet för de faktiska uppgifterna kan variera., Metoden som införs här å andra sidan möjliggör snabb och enkel bestämning av effekten som temperaturen och pH har på enzymets aktivitet samtidigt med 96-brunnsplattor, flerkanaliga pipetter och en gradient PCR-cykler. Med denna grundläggande tekniska utrustning är det möjligt att producera konturytor av pH, temperatur och aktivitet som är baserade direkt på experimentella data. Metoden testades för flera utbredda glykosidhydrolasanalyser samt modell-och komplexa substrat.