tillväxt och näringsdynamik av Ochromonas sp., stam BG-1
Phagotrophy av phototrophic flagellater tros ge betydande ekologiska fördelar sig på alger som uppvisar beteendet (Flynn och Mitra, 2009), men det verkar också finnas begränsningar (även om i stort sett uncharacterized) för att genomföra blandad kost samtidigt i en enda cell (Korpen, 1997). Dessa begränsningar kan innebära kostnader eller kompromisser för att upprätthålla dubbla cellulära maskinerier (jämfört med specialiserade konkurrenter), eller kanske cross-talk mellan anabola och kataboliska biokemiska vägar som förvirrar utförandet av båda aktiviteterna samtidigt., Tyvärr finns det praktiskt taget ingen kvantitativ information om kostnaderna och fördelarna med mixotrofiskt beteende, och inte heller om båda processerna utförs sekventiellt eller samtidigt av dessa arter. Temporal partitionering kan vara en mekanism för att upprätthålla båda förmågorna i minutceller (om än att sätta en process ”på is” vid varje given tidpunkt)., Att bedöma om båda beteenden förekommer samtidigt är de specifika fysiologiska fördelarna för heterotrofisk näring i mixotrofisk alger och responsen för detta beteende till abiotiska och biotiska variabler aspekter av mixotrofisk näring som har varit svåra att fastställa med traditionella metoder och metoder.
Vi studerade mixotrophic chrysophyte Ochromonas sp., stam BG-1 eftersom den kan odlas i axenkultur (bakteriefri) och det har tidigare rapporterats vara en övervägande heterotrofisk organism som uppnår hög tillväxttakt endast i närvaro av bakterier (Sanders et al., 2001). Tillväxten i axenkulturen förhindrade potentiellt försvårande biologiska interaktioner och elementströmmar till följd av andra levande mikroorganismers verksamhet i kulturerna, vilket möjliggjorde en jämförelse mellan nanosimer och IRMS-mätningar i bulk och en bättre förståelse av de specifika kol-och kvävekällor som används för tillväxt av algen.,
dessutom förenklade användningen av en enda oorganisk kvävekälla vår experimentella design så att de enda kvävekällorna i mediet var ammonium eller HKB. Alger i allmänhet har mekanismer för upptag och assimilering av både ammonium och nitrat, men transcriptomic data tyder på att vissa chrysophytes, inklusive Ochromonas sp. stam BG-1, kan saknas den genetiska förmågan för nitratassimilering (Terrado et al. År 2015; Lie et al., 2017)., Dessutom tillsattes inte MES-bufferten till mediet i våra experiment eftersom detta kunde ha gett en alternativ kvävekälla. MES kan också ha utgjort en källa till organiskt kol för algen (Sanders et al., 2001), och dess eliminering säkerställde att de enda kolkällorna i mediet var antingen bikarbonat eller HKB. Transkriptomisk analys från experiment utförda på samma sätt som de som presenteras i detta manuskript visar att fotosyntetiska maskiner av Ochromonas sp. stam BG-1 uttrycks och uppregleras i närvaro av ljus (Lie et al., 2017)., Detta förenklade tillvägagångssätt, kombinerat med stabil isotopmärkning, gjorde det möjligt för oss att bestämma vilken källa(er) av kväve och kol som användes för tillväxt av algen.
signifikant tillväxt av Ochromonas i denna studie uppnåddes endast medan HKB var rikligt som byte (Figur 1a). CHL a-dynamiken i kulturen återspeglade också de höga tillväxttakten på grund av bete på HKB, eftersom koncentrationen av Chl a-cell-1 minskade med en storleksordning under den första 48 h av inkubation för kulturer som odlas i ljuset samt i kontinuerligt mörker (figur 1D)., Dessa förändringar i cellulär klorofyll kan vara relaterade till en utspädning av Chl a inuti cellerna på grund av de höga tillväxttakten hos algen (Hansen et al., 2000), så att minskningen av CHL en cell-1 var en följd av snabbväxande hastigheter av algen och inte en direkt minskning av klorofyll biosyntes hastighet. Ändå är det också möjligt att det fanns viss reglering av klorofyllbiosyntes när HKB var närvarande som transkriptomisk analys på denna alga föreslår uppreglering av gener relaterade till klorofyllsyntes i närvaro av ljus när HKB var utarmad (Lie et al., 2017)., I vilket fall som helst är dessa observationer överens med tidigare studier av Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) som observerade en välutvecklad heterotrofisk förmåga, vilket tyder på att kolfixering och kanske andra cellulära strukturer och processer som är involverade i fotosyntes reduceras vid odling av mixotrofiskt, vilket observerades för vissa andra alger (Wan et al., 2011).
upplöst ammonium, såväl som fosfat, ackumulerat i Ochromonas-kulturerna under de första 48 timmarna av experimenten, när HKB aktivt betades (Figur 2)., Detta resultat indikerar att överskott av kväve och fosfor från betat HKB utsöndrades av algen. Massbalansberäkningar baserade på förändringar i prey / algal abundances och deras cellulära kväveinnehåll visade att upp till 50% av det kväve som ingår i konsumerad HKB assimilerades av algen, medan en betydande mängd av det överskjutande kvävet huvudsakligen släpptes som ammonium under perioden med aktiv bakteriebete (Figur 2)., Dessa värden för kväveassimilering (och utsöndring) överensstämmer med assimileringseffektivitet hos heterotrofa protister av liknande storlek (Taylor, 1982; Caron och Goldman, 1990), i överensstämmelse med slutsatsen att Ochromonas växte övervägande som en heterotroph när byten var rikliga. Vidare har transkriptomiska analyser visat att olika ammoniumtransportörer uttrycks av Ochromonas sp. stam BG-1 växer på HKB jämfört med tillväxt efter bakterier har betats till mycket låga abundances (Lie et al., 2017)., Det förefaller därför som om transportörer för export av ammonium ur cellen kan skilja sig från dem som används för ammoniumupptag, vilket har observerats för andra organismer (Shnaiderman et al., 2013).
intressant minskade koncentrationerna av ammonium, men inte fosfat, i mediet när HKB hade avlägsnats genom bete (det vill säga efter 48 h; Figur 2) när Ochromonas odlades i ljuset., Detta resultat verkar indikera att algen aktivt tog upp ammonium (men inte fosfat) från mediet när bakterier inte längre var tillgängliga och fotosyntes inducerades (figur 1D). Däremot fortsatte både ammonium och fosfat i de kulturer som odlades i mörkret att stiga under hela experimentet (prickade linjer i Figur 2). Ingen signifikant nettoalgal befolkningstillväxt inträffade efter utarmning av byten även i ljuset, och förklaringen till dikotomin i upptaget av dessa två element är oklart., Vi spekulerar om att ammonium togs upp eftersom det var särskilt nödvändigt för att återuppbygga cellens fotosyntetiska maskiner.
det fortsatta utseendet av fosfat i odlingsmediet under den senare delen av experimenten kontrasterar med studier av några andra Ochromonas-arter som har rapporterat ett upptag av fosfat när algen växer autotrofiskt (Rothhaupt, 1996)., Bristen på fosfatupptag från stam BG-1 kan tyda på att denna Ochromonas inte var kapabel till effektivt fosfatupptag (vilket delvis kan förklara den dåliga fototrofa tillväxtkapaciteten hos denna stam), eller att fosfor inte behövdes i betydande mängder för cellulär omorganisation i samband med förändringen av fototrofisk tillväxt, och därför stimulerades inte upptagningen av förändringen till fototrofi., Det är osannolikt att de fortsatta ökningarna av koncentrationen av fosfat berodde på sönderdelning av upplösta organiska fosforföreningar i mediet eftersom kulturerna inte hade några levande bakterier.
slutsatser från stabila isotopprobingsexperiment
stabil isotopanalys (nanosimer och bulkanalys-IRMS) visade att både oorganiska (13C-bikarbonat och 15N-ammonium) substrat och 13C / 15N-märkta HKB assimilerades av Ochromonas, vilket bidrog till 15N och 13C cellulär anrikning efter 48 h inkubation (Figur 4)., Storleken på anrikning från oorganiska substrat eller HKB indikerade emellertid att de primära källorna till kol och kväve under mixotrofisk tillväxt härleddes från fagotrofi. Isotop massbalans indikerade att 88-95% av kväve och 84-99% av kolet härleddes från HKB när Ochromonas växte mixotrofiskt i ljuset. En anrikning av 13C observerades hos alger som odlades i ljuset jämfört med mörkret (Experiment 1 vs Experiment 3) när 13C-bikarbonat var tillgängligt (Figur 4)., Det beräknade bidraget från fotosyntetisk kolfixering var dock endast 1-10% av det kol som assimilerades till biomassa. Den större effektiviteten av kväveinkorporering från byte som observerats i ljuset i förhållande till kontinuerligt mörker (Figur 3; experiment 1, 2 vs Experiment 3) tyder på att ljus spelade en roll, om än en mindre, i fagotrofisk effektivitet av algen., Trots att Ochromonas fotosyntetiska maskineri ökade fagotrofiskt på HKB (vilket framgår av låga cellkvoter för Chl a; figur 1D), hade ljuset därför en liten och positiv inverkan på algnäringen. Eftersom mängden kol som fixeras av fotosyntes representerade en liten del av kol som assimileras av algen när den växer på HKB, spekulerar vi att fotosyntetiska apparaten kan ge energi snarare än kol för cellulärt material, eftersom det har hypoterats för Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
våra isotopiska massbalansberäkningar har två varningar. För det första kontrollerade vi inte pH-utvecklingen inom kulturerna, vilket skulle ha gett bättre insikter om karbonatjämvikten som kan ha påverkats av andning och kolfixering och utbyte med atmosfären. Som sådan kan vår uppskattning baserad på experimenten med märkt oorganiskt kol ha underskattat mängden oorganiskt kol som fastställts av Ochromonas sp. BG-1 (1% enligt isotopmassbalansen)., I vilket fall som helst bör experimentet med märkt HKB inte ha påverkats av denna varning, och uppskattningen av 10% kol härrörande från oorganiskt substrat är sannolikt realistisk. För det andra anses Ochromonas vara en ineffektiv kolfixare på grund av saknade kolkoncentrationsmekanismer (Maberly et al. 2009) som ökar CO2-koncentration via transport av CO2 och/eller bikarbonat till enzymet RubisCO (Raven et al., 2008). Å andra sidan har transkriptomisk analys visat att fotosyntetiska maskiner av stam BG-1 är funktionell (Lie et al.,, 2017), och våra experiment med märkt bikarbonat visade en signifikant anrikning av 13C fraktionerad överflöd i Ochromonas( figurerna 4 och 5); Därför Ochromonas sp. stam BG – 1 har viss förmåga att använda oorganiskt kol, om än ineffektivt.
den starka heterotrofa aktiviteten hos Ochromonas samtidigt som den växer mixotrofiskt ökar sannolikt den intracellulära CO2-poolen såväl som dess flöde. Som tumregel anses det att heterotrofa protester assimilerar 40% av intagat organiskt material, medan de släpper ut 30% och andas ytterligare 30% (släde, 1989)., Baserat på detta kan den totala mängden kol som frigörs av Ochromonas som CO2 under exponentiell tillväxt vara så hög som det totala bikarbonat som tillsätts i början av inkubationen, vilket har konsekvenser för den isotopmassabalans vi har presenterat. Om vi antar att den isotopiskt anrikade CO2 som härrör från HKB-andningen är tillgänglig på samma nivåer som det upplösta oorganiska kolet, indikerade inkubationen utförd med Ochromonas och märkt HKB att ~84% kol härleddes från HKB., Upp till 20% av det assimilerade kolet som härrör från HKB skulle faktiskt kunna motsvara kol som ursprungligen respirerades och sedan fixerades av Ochromonas. Om det är korrekt, skulle andning som härrör från fagotrofisk aktivitet fungera som en kolkoncentrationsmekanism av slag för denna Ochromonas. Medan den primära kolkällan för Ochromonas växande mixotrofiskt härleddes från HKB, kan en icke-försumbar mängd ha härletts från andningen och sedan CO2-fixering av bakteriell biomassa.,
Ochromonas skiftade sin metabolism mot autotrofi när den inkuberades i ljuset, men först efter att den hade utarmat HKB i kulturerna (48 h av tillväxt). Denna förändring återspeglades i bulk IRMS 13C fraktionerad överflöd för behandling med märkt HKB där en minskning observerades mellan 48 h och 145 h (Experiment 2 i Figur 5), vilket indikerar införlivandet av omärkt kol i algbiomassa via ljusprocesser. Chrysophytes anses generellt vara dåliga autotrofa kolfixare på grund av dåliga kolkoncentrationsmekanismer (Maberly et al., 2009)., Dessa resultat tyder dock på att det fanns en betydande nivå av oorganisk koldioxidassimilering. En jämförelse av kulturer som odlas i ljus (Experiment 1 i Figur 5) och kontinuerlig mörker (Experiment 3 i Figur 5) visade att 15N relativ förekomst av mörka kulturer hade inte ändras efter 95 h medan kulturer i ljuset fortsatte att berika i 15N, vilket tyder på att Ochromonas fortsatte att tillgodogöra sig kväve för att behålla sin metabolism när HKB var slut., Dessa resultat överensstämde med observerade minskningar i koncentrationen av ammonium i mediet under denna tidsperiod (figur 3a), även om det fortsatta utseendet av fosfat i mediet under denna period är oförklarligt.
vi erhöll en god övergripande överenskommelse mellan massisotopmätningarna och nanosimmmätningarna för kväve, i överensstämmelse med observationer i tidigare studier (Popa et al., 2007; Anonyma och Hus, 2009; Kopf et al. År 2015; Figur 4c)., Bulkmätningarna var dock något lägre när det gäller fraktionella abundansvärden för kol, särskilt för mycket berikade prov (figur 4D). Vi spekulerar i att skillnaderna mellan nanosimer och bulkisotopmätningarna för KOL kan relateras till det faktum att NanoSIM-prover bevarades med glutaraldehyd, medan proverna för bulkanalys inte var det. Fixering har visat sig påverka cellulärt kol (Musat et al., 2014), även om vi kunde ha förväntat oss att detta skulle späda 13C i nanoSIMS-mätningarna i förhållande till bulkvärdena., En mer trolig förklaring är att encellsmätningarna inte påverkas av cellulärt skräp i kulturen som kan vara mindre berikad. Bulkvärdet 13C kan spädas med dessa komponenter i förhållande till nanoSIMS-mätningarna, vilket innebär att nanoSIMS-data mer exakt kan återspegla algernas kol-och kväveupptag. Cell – till-cellsvariabilitet kan emellertid också ha bidragit till de mindre skillnaderna mellan massmätningarna och nanosimsmätningarna.,
användningen av NanoSIM i denna studie representerar dess första tillämpning mot studier av kol-och näringsflöden i en mixotrofisk alga, och har möjliggjort en bättre förståelse av kol-och energiförvärv av denna art och cellulär metabolism. Våra resultat utökar information tillgänglig från traditionella analyser av Ochromonas sp. stam BG-1 vuxit under olika förhållanden av ljus och byte tillgänglighet (Sanders et al., 2001), bekräftar att det mesta av kväve och kol som används för tillväxt erhålls genom sitt bakteriebyte., Även om resultaten inte kan extrapoleras direkt till alla arter längs kontinuum av alger med olika mixotrofa strategier, validerar vårt arbete användningen av stabila isotopprobingförsök och nanosimer för att bättre förstå de metaboliska underbyggnaderna av mixotrofi hos en art. Dessutom ger det ett tillvägagångssätt för att bedöma mixotrofisk näring i miljöprover. Ochromonas sp. stam BG-1 gav ett idealiskt modellsystem för att jämföra isotopanalys med nanosimer eftersom bakterier snabbt avlägsnades genom bete inom de första 48 timmarna av experimenten., Överenskommelsen mellan dessa två mätningar visar att nanoSIMS noggrant fångade dynamiken i kol-och näringsförvärv i denna mixotroph, och kan därför tillämpas mer allmänt för att utforska mixotrofi i komplexa blandade samhällen där bulkåtgärder skulle vara otillräckliga för att fånga dessa dynamik. Dessa och framtida detaljerade studier kommer att fortsätta att ge förbättringar i vår förståelse av näring av mixotrofa alger.