objectos de Estudo
As mulheres foram recrutadas a partir de uma fábrica no interior comunitária de Cuernavaca, 89 km ao sul da Cidade do México., A concentração de hemoglobina em todas as mulheres da fábrica foi determinada a partir de amostras de sangue da picada do dedo, seguido de uma amostra de sangue venoso para determinar a ferritina sérica entre as mulheres não anêmicas. Um total de 20 não-anêmicos mulheres com baixas reservas de ferro foram recrutados com base na concentração da hemoglobina ⩾125 g/l e concentração de ferritina sérica <25 µg/l. Foram critérios de exclusão: gravidez e lactação, gastrointestinal ou distúrbios metabólicos (doença inflamatória intestinal, diarréia crônica, fibrose cística), outras doenças crônicas e aqueles que tomam suplementos de ferro., No total, foram recrutados 20 lactentes aparentemente saudáveis (com idades entre os 6 e os 24 meses) e 20 crianças aparentemente saudáveis (com idades entre os 2 e os 5 anos) de mães com níveis adequados de hemoglobina. Os sujeitos e os pais das crianças foram plenamente informados sobre os objetivos e procedimentos do estudo, e foi obtido o consentimento por escrito. O Comitê de Ética do Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca, México e do Instituto Federal Suíço de tecnologia, Zurique, Suíça, revisaram e aprovaram o protocolo.,
dimensão da amostra
os cálculos da dimensão da amostra basearam-se em variações interindividuais e intra-individuais na absorção de ferro, tal como observado em estudos anteriores de biodisponibilidade do ferro em lactentes e crianças jovens (Davidsson et al., 1994, 1997, 2000, 2004). Estima-se que 20 crianças seriam um tamanho mínimo de amostra para detectar uma diferença de 50% significativa na absorção média logarítmica de Ferro a partir de uma média aritmética de absorção inicial de ferro de 7%, com 90% de potência, um nível de significância de 0,05 (teste t não emparelhado) e uma taxa de erro de tipo I de 5%., Antecipando uma taxa de desistência de 10%, estas estimativas indicaram que seriam necessários pelo menos 20 indivíduos em cada grupo para completar os estudos.Mulheres, lactentes e crianças foram aleatoriamente designados para receber a refeição de ensaio com sulfato ferroso ou fumarato ferroso em dias consecutivos. A refeição de teste foi administrada como pequeno-almoço após um jejum nocturno. A aceitabilidade da refeição de teste foi confirmada com cada criança e criança antes do ingresso no estudo. Não foi permitida a ingestão de alimentos ou bebidas durante 3 horas após a ingestão completa da refeição marcada., Os lactentes e as crianças permaneceram sob estreita vigilância durante e após a ingestão da refeição de teste.ao todo, 5 ml de sangue venoso foram depositados em tubos tratados com EDTA imediatamente antes da primeira refeição de teste e novamente 14 dias depois. Foram analisadas amostras de sangue para os indicadores de Estado do ferro (hemoglobina e ferritina sérica) e composição isotópica do ferro. O peso corporal e a altura foram medidos em cada ponto de colheita de sangue.a refeição de teste foi uma bebida açucarada à base de leite de milho com base na bebida local de papas de farinha de milho mexicana “atole”. Foi feito de farinha de milho degermed (24.,7%), leite em pó inteiro (11,7%), “piloncillo” (uma forma sólida de açúcar castanho não refinado; 63,5%) e água purificada (200 ml) sem adição de ferro ou ácido ascórbico. Foram preparadas refeições de teste padronizadas especialmente para o estudo a partir de alimentos disponíveis localmente comprados a granel, exceto para a farinha de milho degermed que não estava disponível no México e foi obtida na Suíça (Fábrica Suíça, Zurique, Suíça). A farinha de milho degermado foi utilizada para minimizar o teor de ácido fítico da farinha, o que, de outro modo, reduziria a biodisponibilidade do ferro a partir da farinha de ensaio (Hurrell et al., 2002)., A refeição de teste foi cozinhada em uma instalação de cozinha e transportada quente para o centro de alimentação da fábrica, onde uma porção de 220 g por mulher e 60 g por criança e criança foi preparada como um café da manhã e foi seguida pela ingestão de água. Todas as refeições de ensaio foram idênticas, com excepção da adição de 4 mg Fe (mulheres) ou 2, 5 mg Fe (lactentes e crianças) como sulfato de fumarato ferroso ou ferroso, que foram adicionados à refeição de ensaio imediatamente antes de servir. O pó de fumarato ferroso foi adicionado directamente à refeição de ensaio e o sulfato ferroso foi adicionado como solução.,
de isótopos Estáveis etiquetas
Isotopicamente rotulados-fumarato ferroso foi produzida pelo Dr. Paulo Lohmann GmbH (Emmerthal, Alemanha) a partir enriquecido com ferro elementar utilizando um reduzido procedimento de seus equivalentes comerciais, processo de fabricação. O mesmo procedimento foi utilizado em estudos anteriores (Davidsson et al., 2000, 2001, 2002; Fidler et al., 2003; Sarker et al., 2004). As doses individuais de fumarato ferroso foram previamente pesadas em tubos de polietileno, pelo que a quantidade exacta adicionada foi determinada pelo peso do tubo e foi então armazenada., – o sulfato ferroso foi preparado a partir de ferro elementar isotopicamente enriquecido (Chemgas, Boulogne, França), que foi dissolvido em 0,1 mol H2SO4/l E constituído até à concentração apropriada. A solução foi mantida em atmosfera de árgon num frasco de polietileno até ser necessária e pesada em doses individuais antes da alimentação.,
A composição isotópica de ambos os rótulos foi medida em triplicado por espectrometria de massa de ionização térmica negativa usando um espectrômetro de massa de campo magnético (MAT262; Finnigan MAT, Bremen, Alemanha) equipado com um sistema multi-coletor de copos de Faraday para detecção de íons. A concentração de ferro de cada rótulo foi medida em triplicado por análise de diluição isotópica inversa (Walczyk, 1997). O fumarato ferroso foi dissolvido em ácido nítrico concentrado antes da diluição isotópica., O padrão de ferro da composição isotópica natural foi preparado gravimetricamente a partir de um material de referência isotópico (IMMR-014; E. U. Institute of Reference Materials and Measurements, Geel, Bélgica). As razões isotópicas foram medidas por espectrometria de massa de ionização térmica negativa (Walczyk, 1997).
composição isotópica das amostras de sangue
amostras de sangue inteiro enriquecidas foram mineralizadas por digestão por micro-ondas utilizando uma mistura de HNO3 concentrado e H2O2 (30%) como agentes oxidantes., O ferro foi separado da matriz por cromatografia de troca de aniões e um passo de extração líquido–líquido em éter dietílico (Walczyk et al., 1997). Cartuchos químicos foram processados durante todo o procedimento. A composição isotópica do ferro separado foi medida por espectrometria de massa de ionização térmica negativa.
Estado do ferro
amostras de sangue total recentemente colhidas foram aliquotadas para a medição da concentração de hemoglobina usando um fotómetro portátil de hemoglobina (Hemocue Inc., Angelholm, Suécia) e técnicas padronizadas., O material correspondente de controle de qualidade foi analisado no início de cada dia de amostragem (Hemocue Inc., Angelholm, Suécia). Um alíquota de sangue total foi separado para medição da ferritina sérica por imunoensaio automatizado (Immulite One; DPC, Los Angeles, CA, EUA) em ETH, Zurique, e o sangue inteiro restante foi congelado para análise posterior da composição isotópica.,o cálculo da absorção de Ferro
as quantidades de rótulos isotópicos de 57Fe e 58Fe no sangue, 14 dias após a administração, foram calculadas com base no desvio das razões isotópicas de Fe e na quantidade estimada de ferro circulante no organismo. Os cálculos basearam-se nos princípios da diluição isotópica, tendo em conta que os rótulos isotópicos de ferro não eram monossotópicos. O ferro circulante foi calculado com base no volume sanguíneo e na concentração de hemoglobina. Os cálculos do volume sanguíneo basearam-se no peso corporal e na altura, de acordo com Brown et al. (1962) for women and Linderkamp et al., (1977) para crianças. Para cálculos da absorção fraccionada de ferro, assumiu-se para as mulheres a incorporação de 80% do ferro absorvido nos eritrócitos (Hosein et al., 1967) e 90% para as crianças (9). O VBR de fumarato ferroso foi calculado para cada conjunto de dados.todos os ensaios estatísticos foram alimentados a 80% e realizados com um intervalo de confiança de 95% nos dados log-transformados, uma vez que os valores de absorção de ferro não são normalmente distribuídos., O teste t emparelhado do aluno foi usado para comparar os dados dentro de cada faixa etária. O RBV de fumarato ferroso entre grupos etários foi comparado usando o teste T não emparelhado do Estudante. A análise estatística de energia foi realizada usando software comercial (StatMate 2; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). A regressão Linear foi utilizada para avaliar a relação entre a absorção de ferro e as reservas de ferro (representadas pela ferritina sérica) e a correlação de Pearson foi utilizada para examinar a relação entre a ferritina sérica e a RBV.