a criação de uma parcela de contorno a partir de dados experimentais directos requer a utilização de um método viável de alto rendimento e de um número considerável de amostras. O ensaio deve, por conseguinte, ser adequado para utilização em placas com 96 alvéolos., As vantagens gerais desta miniaturização de tubos de reação simples para placas de 96 poços já foram mostradas para a DNSA e outros ensaios colorimétricos . Todos os ensaios utilizados neste estudo foram adequados para o formato das placas de 96 alvéolos. Para produzir uma parcela de contorno, as misturas de enzima e substrato foram incubadas a oito níveis de pH diferentes. Esses oito níveis de pH foram incubados a 12 temperaturas diferentes usando um ciclador PCR gradiente, resultando em 96 condições de reação únicas. Um leitor de placas foi usado para obter os dados., Os resultados foram transformados em atividades relativas, com a maior atividade em cada placa sendo ajustada para 100%. A medição foi realizada em triplicado e os valores médios foram subsequentemente transformados numa parcela de contorno utilizando SigmaPlot, conforme descrito na secção de materiais e métodos. A atividade (eixo z) é representada como cor de roxo para vermelho, em vez de um eixo normal para melhorar a vista da trama contorno.,
sistema tampão
um pré-requisito para a determinação fiável do pH e da temperatura óptima é um sistema tampão estável que é adequado em relação à actividade enzimática e quase resistente a uma mudança de pH com o aumento da temperatura. Em alternativa, este efeito pode ser considerado na parcela do contorno. A influência da temperatura sobre o pKa dos tampões de choque e, por conseguinte, o pH é um facto que deve ser considerado, especialmente no caso dos tampões alcalinos, como o Tris ., Como requisito para o ensaio, todas as variações de pH do nosso sistema tampão citrato–fosfato foram testadas para Alteração do pH entre 35 °C e 80 °C (ver ficheiro adicional 4). Todos os tampões apresentam uma ligeira diminuição do pH com aumento da temperatura, com os tampões a valores de pH mais elevados a revelarem desvios mais elevados. A dependência da temperatura aumenta com a quantidade de fosfato, que se correlaciona com os coeficientes de temperatura do fosfato (− 0, 0028) e citrato (0)., Uma vez que as variações de pH dependentes da temperatura de todos os buffers eram apenas menores, elas poderiam ser negligenciadas na compilação das parcelas de contorno dentro da Gama de valores utilizados aqui. No entanto, se outro sistema tampão com um coeficiente de temperatura mais elevado deve ser utilizado, é facilmente possível adaptar o gráfico de contorno para a mudança de pH, atribuindo a cada buffer um pH individual a cada temperatura., Estes valores são determinados experimentalmente como descrito na respectiva secção de materiais e métodos ou derivados dos coeficientes de temperatura e podem então ser utilizados para adaptar o eixo x (pH) do ficheiro Sigmaplot fornecido.o quadro 1 apresenta uma panorâmica das diferentes enzimas, substratos e ensaios utilizados neste estudo para a criação das respectivas parcelas de contorno.,
Cel8A é uma celulase, mais especificamente uma endo-glucanase, do C. thermocellum e foi a primeira enzima do glicosídeo hydrolase família 8 com uma resolvido estrutura cristalina . Neste estudo, a enzima foi incubada com BBG para validar o método proposto utilizando o ensaio DNSA. A Cel8A tem sido relatada como tendo a sua temperatura óptima a 75 ° C e pH óptimo entre 5,5 e 6,5 ., Estes valores estão de acordo com os resultados da nossa parcela de contorno, uma vez que estão na região de > 90% de actividade (Fig. 1). A nossa parcela de contorno, no entanto, mostra que a enzima é altamente activa sob uma vasta gama de condições diferentes. A enzima apresenta actividades aceitáveis a valores de pH inferiores quando se situa entre 60 °C e 65 °C e também actua com mais de 60% da sua actividade máxima quando se encontra a valores de pH inferiores a 4, 5. Nosso método fornece os meios de visualizar tais efeitos e avaliar o desempenho de uma enzima em qualquer ponto dentro dos parâmetros testados de uma só vez.,
Contorno de terreno de Cel8A usando a DNSA ensaio com cevada-β-glucano como substrato
Para testar se o nosso método é adequado para diferentes hydrolase de métodos de ensaio, produzimos um contorno enredo usando Cel8A com Azo-CM-celulose como substrato e o respectivo ensaio (Fig. 2). O gráfico mostra optima semelhante a 75 ° C e pH 5.5. No entanto, a utilização de Azo-CM-celulose como substrato resultou numa gama de actividade ligeiramente menor., As pequenas diferenças entre os dois ensaios podem ser devidas às estruturas e tipos de ligação diferentes de ambos os substratos, diferindo assim nas suas propriedades de ligação à enzima. A Azo-CM-celulose é um substrato não natural com grupos de Corante adicionados, o que pode aumentar ainda mais este efeito. Utilizando o Cel8A, podemos mostrar que o nosso método fornece dados válidos e é adequado para utilização em dois ensaios diferentes estabelecidos para as hidrolases: DNSA e Azo-CM-celulose.
Contorno de terreno de Cel8A usando Azo-CM-celulose
a Atividade gama determinação para Celluclast®
além de uma única enzima, uma enzima, a mistura foi estudado. Celluclast® é um produto de celulase comercial amplamente utilizado derivado de Trichoderma reesei. É constituída principalmente por celobiohidrolases e endo-1,4-β-glucanases, mas também apresenta xilanases e pelo menos uma β-xilosidase . O manual de produtos indica que as actividades óptimas se situam entre 50 °C e 60 °C e pH 4.,5 e 6.0 . Neste trabalho, produzimos pela primeira vez um gráfico de contorno para Celluclast® com BBG como substrato utilizando o método DNSA (Fig. 3). O gráfico do contorno de BBG foi verificado por uma curva de temperatura padrão (Fig. 4). Os resultados da curva de temperatura a pH 5.5 estão de acordo com os resultados do gráfico do contorno, mostrando a mesma gama de actividade. No entanto, a medição de curvas separadas é inadequada para descrever a atividade do Celluclast® em BBG. O intervalo de pH na qual a mistura enzimática mostra alta atividade é fortemente dependente da temperatura., Quanto maior a temperatura, menor o pH tem que ser para alcançar uma atividade elevada. Em torno de 45 °C, Celluclast® é altamente ativa (> 60%) até um pH de 6,5, enquanto a 65 °C, é altamente ativa somente até um pH de 5.0. A descrição da atividade com duas curvas separadas é, portanto, estritamente dependente do valor escolhido como parâmetro estático. Grafos de temperatura, por exemplo, aqueles tomados nos dois extremos da faixa de pH indicada (4.5 e 6.0) devem dar resultados significativamente diferentes. O mesmo vale para os grafos de pH tomados em diferentes temperaturas., Para tornar este efeito evidente, produzimos gráficos de pH padrão a 45 ° C, 55 ° C, e 65 °C (Fig. 5). Estas três curvas de pH mostram que, com o aumento da temperatura, o limite de pH para alta atividade muda para valores de pH mais ácidos. As três curvas verificam assim os resultados observados no gráfico do contorno. Além disso, mostram as limitações da determinação da atividade separada convencional, que pelo menos para Celluclast® é, no caso das curvas de pH, dependente da temperatura escolhida., O uso do nosso método de gráfico de contorno contorna completamente este problema, medindo o efeito da temperatura e do pH em um passo.
Contorno de terreno de Celluclast® utilizando a DNSA ensaio com cevada-β-glucano como substrato
temperatura convencional determinação óptima de Celluclast® a pH 5.0., A temperatura óptima de Celuclast® em β-glucano de cevada foi determinada a pH 5,0. A abordagem convencional mostra o máximo de atividade em torno de 55 °C e está em conformidade com os resultados observados no respectivo contorno enredo
pH convencional determinação óptima do Celluclast® a três temperaturas. O pH óptimo de Celuclast® em β-glucano de cevada foi determinado a 45 ° C, 55 °C e 65 ° C., A temperaturas mais baixas, a enzima pode tolerar valores de pH mais elevados. Isto está de acordo com o correspondente do contorno trama e mostra o forte impacto dos escolhidos parâmetro fixo, ao determinar o pH ou a temperatura ideal separadamente
A atividade gama de Celluclast® (arabinoxilanos (AX) (Fig. 6) difere daquele com BBG como substrato. A atividade é notavelmente deslocada para temperaturas mais baixas, sem altas atividades observadas acima de 60 ° C., Como Celluclast® é uma mistura de várias enzimas, é mais provável que estas diferentes enzimas tenham características diferentes. No entanto, o padrão de actividade é semelhante ao do BBG; por exemplo, a pH 4.5, a mistura enzimática é altamente activa até quase 60 °C, enquanto que a pH 6.5, é apenas altamente activa até 50 °C. na literatura, o óptimo de Celuclast® no Machado solúvel em trigo foi determinado por um modelo de superfície de resposta (RSM) e verificou-se ser em torno de pH 4.4 e 39 °C., Nosso gráfico de contorno mostra a maior atividade na mesma faixa de temperatura e em um pH ligeiramente mais elevado, que ainda está dentro do ótimo determinado pela RSM. Embora o ideal seja quase o mesmo para ambos os métodos, o nosso gráfico de contorno mostra de forma impressionante a actividade exacta do Celluclast® no AX dentro de toda a gama de condições testadas e apresenta uma disposição mais detalhada do que o RSM. Com as nossas parcelas de contorno de Celluclast® em BBG e AX, podemos mostrar que misturas enzimáticas complexas podem ser analisadas com o método proposto.
Contorno de terreno de Celluclast® utilizando a DNSA ensaio com (arabinoxilanos como substrato
Para demonstrar ainda mais a versatilidade da nossa actividade gama determinação, avaliou-se o seu uso com outros substratos e ensaios. A actividade do Celluclast® em p-NP-β-d-glucopiranósido foi testada e a parcela de contorno é apresentada na Fig. 7. A elevada actividade neste substrato limita-se a um intervalo bastante estreito entre pH 4,0 a 5,5 °c e 55 °C a 70 ° C., Isto sugere que apenas uma ou algumas enzimas na mistura enzimática Celuclast® provavelmente mostram actividade em direcção ao P-NP-β-d-glucopiranósido. os glicósidos p-NP podem ser utilizados como substratos para a preparação de parcelas de contorno. No entanto, nem todos os glicosídeos p-NP são substratos adequados no ensaio, uma vez que vários deles mostram um fundo elevado devido à instabilidade (ver ficheiro adicional 5), especialmente quando as altas temperaturas são combinadas com valores de pH elevados.
Contorno de terreno de Celluclast® utilizando p-NP-β-d-glucopyranoside
Para testar a aplicação de nosso método natural de biomassa exemplo, optou-se por utilizar uma palha baseado no substrato. A libertação de glucose pelo Celluclast® foi detectada através do ensaio Comercial d-glucose HK (Megazyme). O principal componente da parede celular da palha é a celulose , que é a principal fonte de glicose libertada enzimaticamente. The contour plot (Fig., 8), Portanto, mostra predominantemente a atividade do Celluclast® em celulose cristalina, que é recalcitrante para a degradação enzimática . A libertação mais elevada de glucose foi observada a aproximadamente pH 4,0 a 5,5 °c e 40 °C a 60 ° C. A gama com elevada actividade é, portanto, menos larga do que a determinada para o BBG, o que deve ser tido em conta para um processo destinado principalmente a degradar a celulose., Com a utilização de D-glucose HK e p-NP-β-d-glucopiranósido como ensaios alternativos, pudemos demonstrar a adaptabilidade do nosso método a um total de quatro ensaios diferentes e habitualmente utilizados de hidrolase de glicósido. O uso de palha mostrou que nosso método também é adequado para substratos naturais de relevância industrial, e pode ser usado para a avaliação de processos complexos e substratos. Celluclast® apresenta diferentes perfis de actividade em diferentes substratos., Coletivamente para todos os métodos, é, portanto, crucial determinar os dados de pH e faixa de temperatura de uma enzima com o substrato de interesse.
Contorno de terreno de Celluclast® usando o d-glicose HK ensaio com uma palha natural baseado em substrato
Considerações ao usar o método
Quando um contorno enredo é produzido com o método proposto, existem várias considerações que devem ser levadas em conta., O substrato tem de ser estável e o fundo medido reprodutível ao longo de toda a gama de condições na placa de 96 alvéolos. Este é um pré-requisito, porque o controlo do substrato tem de ser subtraído de todos os valores antes da conversão em actividades relativas, mas não pode ser medido directamente na placa para cada uma das 96 condições. Vários substratos de glicosídeo p-NP, por exemplo, não podem ser usados, uma vez que mostram um fundo altamente dependente de temperatura e pH. É necessária uma pipeta muito precisa para obter níveis aceitáveis de desvio-padrão em relação aos triplicados., Recomenda-se vivamente a utilização de pipetas de 96 cabeças e 8 Canais, uma vez que melhoram significativamente a precisão e aceleram o procedimento. Além disso, leitor de placas e ciclador de PCR gradiente são requisitos técnicos para executar o método corretamente. A gama de temperaturas em que o método pode ser executado pode ser adaptada de acordo com as propriedades técnicas do ciclador PCR gradiente, que é normalmente limitado a 30 ° C ou 40 °C e muitas vezes não pode incluir valores abaixo de 20 ° C., Convertemos diretamente a absorvância em atividade relativa de uma enzima, porque os valores estão todos em uma curva de calibração linear (dados não mostrados). No entanto, se não for esse o caso, a actividade tem de ser calculada em primeiro lugar, por exemplo, em U/mg, e estes valores podem então ser utilizados para produzir a parcela do contorno. Quando se pretende produzir uma parcela de contorno para uma enzima fortemente dependente de iões metálicos divalentes, tem de ser utilizado um sistema tampão diferente, uma vez que os tampões à base de citrato–fosfato complexos esses iões.,
enquanto as abordagens RSM são uma ferramenta indiscutivelmente poderosa para avaliar relações complexas, por exemplo, variáveis diversas que afetam múltiplos fatores, determinando o efeito de apenas pH e temperatura na atividade não é muito complexo para ser alcançado por medição direta. A determinação dos valores de fronteira corretos do modelo pode ter várias abordagens e pode influenciar o modelo resultante. O modelo RSM é derivado de apenas um pequeno número de medições em torno do ponto central da atividade da enzima e a precisão em relação aos valores experimentais reais tem de ser testada posteriormente., A resolução Global da RSM é, portanto, mais baixa do que a obtida com o nosso método, o que torna difícil ver os efeitos de atividade como mostrado para Celluclast® a temperaturas e/ou valores de pH mais elevados. Nosso método não requer a capacidade de projetar modelos estatísticos complexos e pode ser realizado com requisitos técnicos mínimos e relativamente padronizados. Uma desvantagem tanto do nosso método como da partilha RSM é que a visualização direta do desvio padrão dentro do gráfico tridimensional não é possível., No entanto, nosso método permite o cálculo do desvio padrão para cada ponto de dados individuais. A maioria dos modelos RSM determinam o desvio padrão para todo o modelo apenas a partir dos dados do ponto central de dados do modelo, enquanto os outros pontos de dados são medidos apenas uma vez . Os desvios-padrão são naturalmente mais elevados nas fronteiras da atividade de uma enzima e ilustram um forte impacto na atividade dentro de uma ligeira mudança de condições. Em torno do ideal e dentro de áreas de nenhuma ou baixa atividade, os desvios são significativamente mais baixos., Uma vez que o método proposto resulta num conjunto completo de dados factoriais, seria possível calcular um modelo estatístico se necessário para uma análise mais aprofundada. O modelo estatístico derivado se basearia diretamente em dados experimentais, mas é um passo adicional que não deve ser necessário para aplicações padrão do método.
em resumo, a fácil avaliação da adequação de uma enzima ou mistura enzimática para uma combinação de Parâmetros de Processo é de importância crucial na concepção de processos biotecnológicos em escala laboratorial ou industrial., Temperatura e pH são dois dos fatores de processo mais importantes que influenciam a atividade enzimática. Abordagens convencionais para testar o efeito desses fatores nas enzimas são baseadas no pressuposto de que existe uma correlação bidimensional entre temperatura e atividade, bem como pH e atividade. Em contraste, novas abordagens determinam a relação em matéria tridimensional, mas são baseadas em estatísticas, complexas para projetar e sua precisão para os dados reais podem variar., O método aqui introduzido permite, por outro lado, uma determinação rápida e fácil do efeito que a temperatura e o pH têm na actividade da enzima, utilizando simultaneamente placas de 96 alvéolos, pipetas multicanais e um ciclador PCR gradiente. Com este equipamento técnico básico, é possível produzir parcelas de contorno de pH, temperatura e atividade que se baseiam diretamente em dados experimentais. O método foi testado para vários ensaios generalizados de hidrolase de glicosídeo, bem como substratos de modelos e complexos.