recolha de Sangue e de processamento
Todos os procedimentos que envolvem a coleta de sangue humano, de voluntários saudáveis foram, em conformidade com os Humanos, Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Sydney (aprovação HREC 2014/244) e o consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos., Todos os procedimentos que envolviam a colheita de sangue humano de pacientes ECMO estavam em conformidade com a ética do Hospital Alfred, o Comité Permanente da Universidade de Monash para a investigação em humanos (aprovação 388/13) e o consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos. Todos os procedimentos estavam em conformidade com a Declaração de Helsínquia de 1983. O sangue foi colhido por venesecção usando uma agulha Terumo de 21 g de borboleta de 10 dadores saudáveis sem medicação (quatro homens, seis mulheres, 22-58 anos de idade)., Os primeiros 5 mL de sangue foram descartados para evitar qualquer trombina que possa ter sido gerada em torno do local de inserção da agulha e depois injectada em tubos contendo 3, 2% de citrato de sódio v/V. O sangue de oito pacientes em um único centro que tinha suporte de ECMO (quatro homens, quatro mulheres, 34-67 anos de idade) foi puxado para tubos ACD-A (BD Vacutainer)., Os doentes com suporte ao ECMO receberam medicamentos anti-coagulação e/ou anti-plaquetários com base no critério do clínico ou orientações institucionais em que os doentes começaram normalmente a tomar varfarina, o rácio normalizado internacional alvo (INR) 2-3, com infusão de heparina de ponte e terapêutica com aspirina, bem como dipiridamol para aqueles que são considerados de alto risco de trombose. O Plasma foi preparado por centrifugação duas vezes a 800 × g durante 20 minutos à temperatura ambiente., Em algumas ocasiões, o plasma dador saudável foi cortado a taxas de 2000 s – 1 ou 10000 s−1 durante 5 minutos à temperatura ambiente utilizando um reómetro Kinexus pro+.a linha celular de cancro do fígado humano HepG2 (ATCC, HB-8065) foi cultivada em DMEM, soro de 10% para o feto e glutamax a 5% CO2 e 37 ° C. As células a 80-90% de confluência foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, incubadas durante 18 h em DMEM sem soro a 5% CO2 e 37 °C ou numa câmara hipóxica a 1% O2, 5% CO2 e 37 ° C., O meio condicionado foi recolhido (1 mL por 4 × 106 células) e o fibrinogénio secretado foi imediatamente processado como descrito abaixo.as amostras plasmáticas de fibrinogénio e fibrina não foram tratadas ou incubadas com trombina e/ou inibidor da polimerização da fibrina, GPRP (Sigma). A fibrina foi preparada em 1 mL de plasma por adição de 50 unidades de trombina bovina (Sigma) e 10 mM de CaCl2 e MgCl2 durante 40 minutos a 22 °C. Os polímeros de fibrina foram recolhidos utilizando uma vareta de plástico., Num ensaio, o plasma (2 mL) foi incubado com 27 Unidades/mL de trombina e 10 mM de CaCl2 e MgCl2 durante 40 minutos a 22 °C, e o polímero de fibrina recolhido numa haste de plástico e removido. O plasma empobrecido foi incubado com outra alíquota de 27 Unidades/mL de trombina e o novo polímero de fibrina recolhido e removido. Uma alíquota de plasma (0,2 mL) amostragem foi realizada antes e após a adição de ambos os lotes de trombina, 150 µM de d-phenylalanyl-prolyl-arginyl chloromethyl cetona (PPACK, Sigma), além de inibir a atividade da trombina e as amostras incubadas por 16 h às 22 °C., O teor de fibrinogénio das amostras de plasma foi estimado recolhendo a proteína em esferas revestidas por anticorpos anti-fibrinogénio policlonais (ver secção seguinte), resolvendo o fibrinogénio na página SDS e colorindo Com Coomassie coloidal. Em outro experimento, o plasma foi incubado com 8 mM GPRP (Sigma) por 5 min a 22 °C, antes da adição de 50 unidades/mL de trombina por 60 min a 22 °C. A reação foi saciada com 150 µM de PPACK por 10 min às 22 °C. Purificada fibrinogens foram isolados a partir de doador saudável fresco congelado plasma por β-alanina precipitation32 ou obtido comercialmente (Sigma F4883).,as Dynabeads (2 mg, tecnologias de vida) foram revestidas com 16 µg de anticorpos policlonais anti-fibrinogénio (Dako, Cat A0080, lote 00015063) em 1 mL de solução salina de tampão fosfato numa roda rotativa durante 1 h a 22 °C e o anticorpo em excesso removido por lavagem três vezes com 1 mL de solução salina de tampão fosfato. Incubou-se o meio condicionado pelo plasma (0, 7 mL) ou pelo HepG2 (4, 5 mL) com 2 mg de esferas revestidas numa roda rotativa durante 1 h a 22 °C., As esferas foram coletados por meio de um ímã, o excesso de plasma aspirada para reduzir o volume, e incubadas em 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA, em fosfato-salino contendo 10% de DMSO por 1 h a 22 °C, no escuro, para alkylate ímpar Cys thiols em proteínas. Os sobrenadantes foram aspirados e as contas incubadas com tampão de amostra NUPAGE LDS (Life Technologies) contendo mais 5 mM 12C-IPA durante 30 minutos a 60 °C. Os sobrenadantes foram resolvidos na SPS-PAGE., Os polímeros de fibrina gerados no plasma foram recolhidos numa vareta de plástico e imediatamente submergidos em 1 mL de 5 mm 12C-IPA em solução salina tampão fosfato contendo 10% de DMSO durante 1 h a 22 ° C no escuro. A fibrina foi lavada 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato antes de dissolver o polímero em 1 mL de ácido acético de 20 mM durante 24 h a 22 °C. vinte microlitros da solução foram incubados com tampão de amostras LDS NuPAGE (Life Technologies) contendo 5 mM 12C-IPA durante 30 minutos a 60 °C e as proteínas resolvidas na página SDS., O fibrinogénio purificado (12 µg) foi incubado com 5 mM 12C-IPA em solução salina com tampão fosfato contendo 10% de DMSO para 1 h a 22 °C no escuro e a proteína resolveu-se na página SDS.
As géis de página SDS estavam manchadas com coomassie coloidal (Sigma) e as bandas de fibrina(ogen) excisadas, dessentadas, secas, incubadas com ditiotreitol de 40 mM e lavadas14. As fatias de gel foram incubadas com 5 mM 13C-IPA (isótopos de Cambridge) por 1 h a 22 °C no escuro para alquilar o Dis de ligação dissulfeto, lavado e seco antes da digestão de proteínas com 12.,5 ng / µL de tripsina (Promega) em 25 mM NH4CO2 durante a noite a 25 °C. os peptídeos foram eluídos das fatias com 5% de ácido fórmico, 50% de acetonitrilo. A cromatografia Nano-líquida (nano-LC) foi realizada utilizando um sistema Ultimate 3000 HPLC e autosampler (Dionex). As amostras foram injectadas numa coluna nano-LC sem frituras (75 µm x ~12 cm) contendo meios C18 (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) e aquecidas a 45 °C para todas as corridas. Os peptídeos foram eluídos utilizando um gradiente linear superior a 52 minutos, a um caudal de 0,2 µL/min. A fase móvel a consistia em 0.,1% de ácido fórmico em H2O, enquanto a fase móvel B consiste em acetonitrilo: H2O (8:2) com 0,1% de ácido fórmico. O gradiente foi: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B E 52 min 2% B. Alta tensão (2000 V) foi aplicada a um tee de baixo volume (Upchurch Scientific) e a ponta da coluna posicionada ~0,5 cm do capilar aquecido (T = 275 °C) de um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap (termo Electrão). Iões positivos foram gerados pela ionização de eletrospray e o espectrômetro de massa operado no modo de aquisição dependente de dados., Spectra scan completo foi adquirido (m/z 350-1750) pela Orbitrap em uma resolução de 30.000. Os 15 íons mais abundantes (>5000 contagens) com estados de carga ≥ +2 foram sequencialmente isolados e fragmentados dentro da armadilha de íons lineares usando dissociação induzida collisionalmente com uma ativação q = 0.25 e tempo de ativação de 10 ms com um valor alvo de 30.000 íons. As razões M / z seleccionadas para MS / MS foram excluídas dinamicamente para 35 S. alvo Zoom de armadilha iónica AGC: 3000.00. Ion Trap Full AGC alvo: 30000.00. Ion Trap SIM AGC alvo: 10000.00. Alvo MSn AGC: 10000.00., Os dados foram analisados usando o mascote Daemon (versão 2.5.0, Matrix Science) contra a base de dados Swisssprot. Parâmetros de pesquisa foram precursores de tolerância, de 6 ppm e produto de iões de tolerâncias de ±0.6 Da, e iodoacetanilide derivados (Cys), iodoacetanilide 13C derivados (Cys), oxidação (Met) selecionado como variável de modificações com total tríptico clivagem de até três faltou clivagens. Com a lista de peptídeos contendo cisteína identificados com Mascote, a sua razão monoisotópica massa/carga (m/z) de +2, +3 e +4 é calculada utilizando MS-produto (Versão v 6.2.2, Ferramentas de prospecção proteica)., Cys etiquetado com 12C-IPA ou 13C-IPA tem uma massa de 133.05276 ou 139.07289, respectivamente. Foram analisados trinta peptídeos contendo Cys (tabelas suplementares 1 e 2). As diferentes formas redox dos resíduos do Cys foram quantificadas a partir da abundância relativa de íons de peptídeos rotulados com 12C-IPA e / ou 13C-IPA. Para calcular a abundância iônica de peptídeos, os cromatogramas iônicos extraídos foram gerados usando Xcalibur Qual Browser (v2.1.0; termo científico). A área foi calculada usando a função automatizada de detecção de pico incorporada no software., Os dados foram pesquisados rotineiramente por peptídeos contendo tióis de Cys livres e estes não foram detectados, o que indica que a alquilação de resíduos de Cys não emparelhados por 12C-IPA ou 13C-IPA estava completa na proteína.
Fibrinogênio bissulfeto-vinculado peptídeo análise
plasma de doadores Saudáveis (0.7 mL) foi incubado com anticorpo policlonal anti-fibrinogênio revestidos com anticorpos Dynabeads em uma roda girando por 1 h a 22 °C. As esferas foram coletados, o excesso de plasma aspirado e 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA, em fosfato-salino contendo 10% de DMSO foi adicionado e incubado por 1 h a 22 °C, no escuro., Depois, aspirou-se o sobrenadante, incubam-se as contas com tampão de amostra NUPAGE LDS durante 30 minutos a 60 °C e resolvem-se os sobrenadantes na página SDS. As fatias de Gel contendo o fibrinogénio foram lavadas e secas antes da digestão com 12 ng/µL de tripsina (Promega) durante 4 h a 37 °C. As reacções foram interrompidas adicionando 5% de ácido fórmico (v/v) e peptídeos eluídos das fatias de gel com 5% de ácido fórmico e 50% de acetonitrilo (v/v). Peptídeos em 0.,1% de ácido fórmico (volume final 12 µL) foi resolvido numa coluna analítica de 35 cm × 75 µm C18 de fase reversa utilizando um gradiente acetonitrilo de 2-35% acima de 22 minutos a uma taxa de fluxo de 300 nL/min (termo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) e analisado num espectrómetro de massa LTQ Orbitrap Velos, tal como descrito acima. Os peptídeos ligados a dissulfetos foram pesquisados contra a sequência de fibrinogénio humano usando software de análise Byónica (Versão 3.9-7, métricas proteicas) com uma taxa de descoberta falsa de 1%. Todos os peptídeos ligados a dissulfetos foram inspeccionados manualmente para verificar a sua exactidão., A tolerância de massa precursora e a tolerância de fragmento foram fixadas em 10 ppm e 0,6 Da, respectivamente. As modificações variáveis foram definidas como Met oxidado, Cys oxidados (mono, di e tri) e Cys glutationilados com clivagem completa de tripsina de até três clivagens falhadas.
Fibrinogênio funcionalidade de composição
Purificada fibrinogênio (0,2 mL 10 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 5 mM 12C-IPA, por 1 h a 22 °C, no escuro, para alkylate ímpar Cys thiols na proteína., O IPA não reagido foi removido usando uma coluna de dessalinização de 7 kDa MWCO Zeba spin (termo Fisher). O fibrinogênio ou fibrinogênio-IPA (1,1 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma) por 5 h a 22 °C, em um total de volume de 0,2 mL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Os polímeros de fibrina foram granulados a 13 000 × g durante 15 minutos e a concentração de fibrinogénio remanescente no sobrenadante foi medida. A funcionalidade é expressa em % do fibrinogénio consumido na formação de polímeros de fibrina.,a formação de polímero de fibrina purificado (1 mg/mL em Hepes 50 mM, 0, 14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7, 4) foi incubada com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma). O aumento da absorvância a 350 nm foi registado a cada 30 s durante 15 minutos.
de polímero de Fibrina estrutura medido por microscopia eletrônica de varredura (SEM)
o Fibrinogênio ou fibrinogênio-IPA (1 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma) por 2 h a 22 °C, em um total de volume de 0,2 mL., Os polímeros de fibrina foram enxaguados duas vezes com solução salina de tampão fosfato (PBS) de 0,1 M, fixada com 2,5% de glutaraldeído em PBS durante a noite a 4 °C, após fixação com 1% de OsO4 em PBS, desidratada com uma série de etanol classificada, e o ponto crítico seguinte seco com um em CPD300 de Leica. Amostras foram revestidas com ouro de 15 nm (K550X, Emitech) e fotografadas com um microscópio eletrônico de varredura de campo Zeiss SigmaHD. Os micrografos SEM foram gravados a 5 kV de tensão de aceleração e uma distância de trabalho de 5 mm. diâmetros de fibra foram medidos usando ImageJ.,
de polímero de Fibrina permeação composição
o Fibrinogênio ou fibrinogênio-IPA (1 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma) por 2 h a 22 °C, em um total de volume de 0,2 mL em polipropileno cromatografia em colunas com diâmetro interno de 4,6 mm. As colunas foram sobrepostas com 0,8 mL de tampão Hepes e de fluxo (J) foi calculada a partir do peso das gotas de percolados em 20 min., A permeação (Darcy) constant33 foi calculado a partir da relação, Ks = JƞA/LP, onde J é o fluxo (cm3/s), ƞ é a viscosidade do buffer (0.01 equilíbrio à temperatura ambiente), A é a seção transversal do coágulo (de 0,17 cm2), L é o comprimento do coágulo (1.1 cm), e P é a pressão hidrostática (1,018,218 dyne/cm2).
Fibrina polímero de compactação do ensaio
o Fibrinogênio ou fibrinogênio-IPA (1 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma), por 16 h a 22 °C, em um total de volume de 0,5 mL em 1.,Tubos de microcentrifugação de 5 mL previamente revestidos com 10 mg/mL de PEG-20000 em água e ar secos. Os polímeros de fibrina foram centrifugados a 13.000 × g durante 5 a 2400 s e o volume do fluido extrudido a partir do polímero foi medido.
Fibrinólise composição
o Fibrinogênio ou fibrinogênio-IPA (1,8 mg/mL em 50 mM de Hepes, De 0,14 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4) foi incubado com 1 unidade/mL de trombina bovina (Sigma) por 2 h a 22 °C, em um total de volume de 0,5 mL em 24 placas de poços (15,6 mm de diâmetro) por 2 h a 22 °C. Uma alíquota de plasma (5 µL de 0.,59 µM) foi adicionado ao centro dos poços e as placas incubadas por 18 h a 37 °C em um ambiente úmido. As áreas de lise foram determinadas a partir da média de dois diâmetros medidos em ângulos retos.
quantificação dos Estados redox das ligações dissulfureto de α2-macroglobulina
os 10 plasmas dadores saudáveis acima descritos para a análise do fibrinogénio foram utilizados para a análise da α2-macroglobulina utilizando os mesmos procedimentos. Plasma (0.,7 mL) foi incubado com anticorpo policlonal anti-α2-macroglobulin de anticorpos (Dako, Gato Q0102, Muito 20068567)-revestido Dynabeads (Life Technologies) em uma roda girando por 1 h a 22 °C. As esferas foram coletados, o excesso de plasma aspirado, e incubadas em 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA, em fosfato-salino contendo 10% de DMSO por 1 h a 22 °C, no escuro, para alkylate ímpar Cys thiols em proteínas. Os sobrenadantes foram aspirados e as contas incubadas com tampão de amostra NUPAGE LDS (Life Technologies) contendo mais 5 mM 12C-IPA durante 30 minutos a 60 °C. Os sobrenadantes foram resolvidos na SPS-PAGE., Os géis de página SDS estavam manchados com coomassie coloidal (Sigma) e a banda de α2-macroglobulina excisada, dessetada, seca, incubada com ditiotreitol de 40 mM e lavada14. O gel fatias foram incubadas com 5 mM de 13C-IPA (Cambridge Isótopos) por 1 h a 22 °C, no escuro, para alkylate o bissulfeto de bond Cys, lavados e secos antes de digestão das proteínas com 12,5 ng/µl de tripsina (Promega) em 25 mM NH4CO2 pernoite em 25 °C. Peptídeos foram eluídas de fatias com 5% de ácido fórmico, 50% de acetonitrilo., A cromatografia líquida, espectrometria de massa e análise de dados foram realizadas como descrito para fibrinogen34. Foram analisados 17 péptidos contendo Cys (tabelas suplementares 2 e 4). As diferentes formas redox dos resíduos do Cys foram quantificadas a partir da abundância relativa de íons de peptídeos rotulados com 12C-IPA e / ou 13C-IPA.o resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção da investigação.