o Crescimento e a dinâmica de nutrientes de Ochromonas sp.,, tensão BG-1
Phagotrophy por phototrophic flagelados, acredita-se conferir ecológicos significativos vantagens de algas que exibem o comportamento (Flynn e Mitra, 2009), mas há também parecem estar limitações (apesar de bastante descaracterizada) para a realização misto de nutrição simultaneamente em uma única célula (Raven, 1997). Estas restrições podem envolver custos ou benefícios para a manutenção de máquinas celulares duais (em comparação com concorrentes especializados), ou talvez conversas cruzadas entre vias bioquímicas anabólicas e catabólicas que confundem o desempenho de ambas as atividades simultaneamente., Infelizmente, não existe praticamente nenhuma informação quantitativa sobre os custos e benefícios do comportamento mixotrófico, nem se ambos os processos são realizados sequencialmente ou simultaneamente por estas espécies. Particionamento Temporal pode ser um mecanismo para manter ambas as habilidades em células minúsculas (embora colocando um processo “em espera” em qualquer momento)., Avaliando se ambos os comportamentos estão ocorrendo simultaneamente, o(s) benefício (s) fisiológico (s) específico (s) para a nutrição heterotrófica em algas mixotróficas, e a capacidade de resposta deste comportamento a variáveis abióticas e bióticas são aspectos da nutrição mixotrófica que têm sido difíceis de estabelecer usando abordagens e métodos tradicionais.
estudámos a crisofita mixotrófica Ocromonas sp., tensão BG-1, pois pode ser cultivada em axênico cultura (livre de bactérias) e foi relatado anteriormente para ser um modelo de heterotróficos organismo, que atinge elevadas taxas de crescimento apenas na presença de bactérias (Sanders et al., 2001). O crescimento em axênico cultura impedido potencialmente complicando as interações biológicas e elementar fluxos resultantes das atividades de outros microorganismos vivos nas culturas, permitindo, assim, uma comparação entre nanoSIMS em massa e IRMS medidas e uma melhor compreensão das fontes específicas de carbono e nitrogênio utilizado para o crescimento da alga.,além disso, o uso de uma única fonte inorgânica de nitrogênio simplificou nosso projeto experimental de modo que as únicas fontes de nitrogênio no meio eram o amônio ou HKB. As algas geralmente possuem mecanismos para a absorção e assimilação tanto de amónio como de nitrato, mas dados transcriptômicos indicam que alguns crisófitos, incluindo Ochromonas sp. estirpe BG-1, pode faltar a capacidade genética para a assimilação de nitratos (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Além disso, o tampão MES não foi adicionado ao meio em nossas experiências porque isso poderia ter fornecido uma fonte alternativa de nitrogênio. MES também pode ter constituído uma fonte de carbono orgânico para a alga (Sanders et al., 2001), e sua eliminação garantiu que as únicas fontes de carbono no meio eram bicarbonato ou HKB. A análise transcriptômica a partir de experimentos realizados da mesma forma que os apresentados neste manuscrito mostram que a máquina fotossintética de Ochromonas sp. a estirpe BG-1 é expressa e enregelada na presença de luz (Lie et al., 2017)., Esta abordagem simplificada, combinada com a rotulagem estável de isótopos, permitiu-nos determinar que Fonte(s) de nitrogênio e carbono foram usados para o crescimento pela alga.as taxas de crescimento significativas de Ocromonas no presente estudo foram atingidas apenas enquanto o HKB era abundante como presa (figura 1a). Chl a dinâmica na cultura também refletiu as altas taxas de crescimento devido ao pastoreio em HKB, como a concentração de Chl a célula−1 diminuiu em uma ordem de magnitude durante os primeiros 48 h de incubação para culturas cultivadas na luz, bem como na escuridão contínua (figura 1d)., Estas alterações na clorofila celular podem estar relacionadas com uma diluição da CLA no interior das células devido às altas taxas de crescimento da alga (Hansen et al., 2000), de modo que a redução da Cl A cell−1 foi uma consequência de taxas de crescimento rápido da alga e não uma redução direta da taxa de biossíntese da clorofila. No entanto, também é possível que houve alguma regulação da biossíntese de clorofila quando HKB estavam presentes como análise transcriptômica sobre esta alga sugere a regulação de genes relacionados à síntese de clorofila na presença de luz quando HKB foram esgotados (Lie et al., 2017)., Em qualquer caso, estas observações estão de acordo com estudos anteriores de Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) que observou uma capacidade heterotrófica bem desenvolvida, sugerindo que a fixação de carbono e talvez outras estruturas celulares e processos envolvidos na fotossíntese são reduzidos ao crescer mixotropicamente, como observado para algumas outras algas (Wan et al., 2011).
amónio dissolvido, bem como fosfato, Acumulados nas culturas de Ocromonas durante os primeiros 48 h dos experimentos, quando HKB foram ativamente raspados (Figura 2)., Este resultado indica que o excesso de azoto e fósforo do HKB de raspão foram excretados pela alga. Cálculos do balanço de massas baseados em alterações na abundância de presas/algas e no seu teor de azoto celular indicaram que até 50% do azoto contido no HKB consumido foi assimilado pela alga, enquanto uma quantidade considerável do excesso de azoto foi libertada principalmente como amónio durante o período de pastagem bacteriana activa (Figura 2)., Estes valores para a assimilação de nitrogênio (e excreção) são consistentes com a assimilação eficiências de heterotróficos protists de tamanho semelhante (Taylor, 1982; Caron e Goldman, 1990), consistente com a conclusão de que Ochromonas foi crescendo, predominantemente, como um heterotroph quando presas foram abundantes. Além disso, análises transcriptómicas demonstraram que diferentes transportadores de amónio são expressos por Ochromonas sp. estirpe BG-1 a crescer em HKB em comparação com o crescimento após as bactérias terem sido raspadas para quantidades muito baixas (Lie et al., 2017)., Por conseguinte, parece que os transportadores para a exportação de amónio para fora da célula podem ser diferentes dos utilizados para a absorção de amónio, como tem sido observado para outros organismos (Shnaiderman et al., 2013).curiosamente, as concentrações de amónio, mas não de fosfato, diminuíram no meio quando o HKB foi removido por pastoreio (ou seja, após 48 h; Figura 2) quando o Ocromonas foi cultivado à luz., Este resultado parece indicar que a alga absorveu activamente o amónio (mas não o fosfato) do meio quando as bactérias deixaram de estar disponíveis e a fotossíntese foi induzida (figura 1d). Em contraste, tanto o amónio como o fosfato nas culturas cultivadas no escuro continuaram a aumentar ao longo do ensaio (linhas pontilhadas na Figura 2). Não ocorreu crescimento significativo da população líquida de algas após o esgotamento da presa mesmo à luz, e a explicação para a dicotomia na absorção destes dois elementos não é clara., Nós especulamos que o amônio foi tomado porque era especificamente necessário para reconstruir a máquina fotossintética da célula.
O contínuo aparecimento de fosfato no meio de cultura durante a parte posterior das experiências contrasta com estudos de alguns outros Ochromonas espécies que têm relatado uma absorção de fosfato quando a alga é crescente autotrophically (Rothhaupt, 1996)., A falta de absorção de fosfato pela tensão BG-1 podem indicar que este Ochromonas era incapaz de efetivo fosfato de absorção (que também pode explicar, em parte, os pobres phototrophic capacidade de crescimento desta estirpe), ou que o fósforo não foi necessário em quantidades significativas para celular reorganização associado com a alteração para phototrophic crescimento, e, portanto, a absorção não foi estimulado pela mudança para phototrophy., É improvável que os aumentos contínuos na concentração de fosfato se devessem à decomposição de compostos orgânicos de fósforo dissolvidos no meio porque as culturas não tinham bactérias vivas.
Inferências a partir de isótopos estáveis de sondagem experimentos
análise de isótopos Estáveis (nanoSIMS em massa e análise elementar-IRMS) revelou que tanto inorgânica (13C-bicarbonato e 15N-amônio) substratos e 13C/15N-rotulado HKB foram assimilados por Ochromonas, contribuindo para 15N e 13C celular enriquecimento após 48 h de incubação (Figura 4)., No entanto, a magnitude do enriquecimento com substratos inorgânicos ou HKB indicava que, durante o crescimento mixotrófico, as fontes primárias de carbono e azoto eram derivadas da fagotrofia. O balanço de massa isotópico indicou que 88-95% do nitrogênio e 84-99% do carbono foram derivados de HKB quando Ochromonas estava crescendo mixotropicamente na luz. Observou-se um enriquecimento de 13C em algas cultivadas à luz em comparação com as escuras (Experiência 1 vs experiência 3) quando estava disponível bicarbonato de 13C (Figura 4)., No entanto, a contribuição calculada da fixação fotossintética do carbono foi de apenas 1-10% do carbono assimilado à biomassa. A maior eficiência da incorporação de nitrogênio da presa observada na luz em relação à escuridão contínua (Figura 3; experimentos 1, 2 vs experimento 3) sugere que a luz desempenhou um papel, embora menor, na eficiência fagotrófica da alga., Portanto, apesar das reduções putativas nas máquinas fotossintéticas de Ocromonas crescendo fagotrophicamente em HKB (como evidenciado por baixas quotas celulares de Chl a; figura 1d), a luz teve um impacto menor e positivo na nutrição das algas. Como a quantidade de carbono fixada pela fotossíntese representava uma pequena fração de carbono assimilado pela alga ao crescer em HKB, especula-se que o aparelho fotossintético pode estar fornecendo energia ao invés de carbono para o material celular, como tem sido hipotetizado para Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,os nossos cálculos de balanço de massa isotópico têm duas ressalvas. Em primeiro lugar, não controlamos a evolução do pH dentro das culturas, o que teria dado melhores percepções sobre o equilíbrio carbonatado que poderia ter sido afetado pela respiração e fixação de carbono, e troca com a atmosfera. Como tal, nossa estimativa baseada nos experimentos usando carbono inorgânico rotulado pode ter subestimado a quantidade de carbono inorgânico fixada por Ochromonas sp. BG – 1 (1% de acordo com o balanço de massa isotópico)., Em qualquer caso, o experimento usando HKB rotulado não deve ter sido afetado por esta advertência, e a estimativa de 10% de carbono derivado de substrato inorgânico é provavelmente realista. Em segundo lugar, Ochromonas é considerado um fixador de carbono ineficiente devido à falta de mecanismos de concentração de carbono (Maberly et al. 2009) que aumentam a concentração de CO2 através do transporte de CO2 e/ou bicarbonato para a enzima RubisCO (Raven et al., 2008). Por outro lado, a análise transcriptômica mostrou que a máquina fotossintética da estirpe BG-1 é funcional (Lie et al.,, 2017), e nossos experimentos usando bicarbonato rotulado mostraram um enriquecimento significativo da abundância fraccional 13C em Ocromonas (Figuras 4 e 5); Portanto, Ochromonas sp. a estirpe BG-1 tem alguma capacidade de utilizar carbono inorgânico, embora ineficientemente.
no entanto, a forte actividade heterotrófica de Ocromonas durante o crescimento mixotrófico é susceptível de aumentar a massa intracelular de CO2, bem como o seu fluxo. Como regra geral, considera-se que os protistas heterotróficos assimilam 40% da matéria orgânica ingerida, enquanto libertam 30% e respiram outros 30% (Sleigh, 1989)., Com base nisso, a quantidade total de carbono liberado pelo Ocromonas como CO2 durante o crescimento exponencial pode ser tão alta quanto o bicarbonato total adicionado no início da incubação, o que tem consequências para o balanço de massa isotópico que temos apresentado. Se assumirmos que o CO2 enriquecido isotopicamente derivado da respiração HKB está disponível nos mesmos níveis que o carbono inorgânico dissolvido, a incubação realizada com Ochromonas e rotulado HKB indicou que ~84% do carbono foi derivado do HKB., Até 20% do carbono assimilado derivado de HKB poderia realmente corresponder ao carbono que foi inicialmente respired e, em seguida, fixado por Ochromonas. Se correto, a respiração derivada da atividade fagotrófica atuaria como um mecanismo de concentração de carbono para este Ocromonas. Embora a principal fonte de carbono para o crescimento mixotrófico de Ocromonas tenha sido derivada do HKB, uma quantidade não negligenciável pode ter sido derivada da respiração e, em seguida, fixação de CO2 da biomassa bacteriana.,
Ochromonas deslocou o seu metabolismo para a autotrofia quando incubado à luz, mas apenas depois de ter esgotado o HKB nas culturas (≈ 48 h de crescimento). Esta mudança reflectiu-se na abundância fraccionada do IRMS 13C para o tratamento utilizando HKB rotulado, onde foi observada uma redução entre 48 h e 145 h (Experiência 2 Na Figura 5), indicativa da incorporação de carbono não marcado na biomassa de algas através de processos de luz. Os crisófitos são geralmente considerados fixadores de carbono autotróficos pobres devido a mecanismos pobres de concentração de carbono (Maberly et al., 2009)., No entanto, estes resultados indicam que houve um nível significativo de assimilação de carbono inorgânico. Uma comparação de culturas cultivadas na luz (Experimento 1 (Figura 5) e a contínua escuridão (Experimento 3 (Figura 5) revelou que o 15N fracionário abundância do escuro culturas não mudar depois de 95 h, enquanto culturas em que a luz continuou a enriquecer em 15N, indicando que Ochromonas continuou a assimilar nitrogênio para manter o seu metabolismo, uma vez HKB estavam esgotados., Estes resultados foram consistentes com as diminuições observadas na concentração de amónio no meio durante este período de tempo (figura 3a), embora o aparecimento continuado de fosfato no meio durante este período Seja inexplicável.obtivemos um bom acordo global entre as medições de isótopos a granel e as medições de nanossimes para o azoto, consistente com observações em estudos anteriores (Popa et al., 2007; Orphan and House, 2009; Kopf et al., 2015; figura 4c)., No entanto, as medições a granel foram um pouco mais baixas em termos de valores de abundância fracionada para o carbono, particularmente para amostras altamente enriquecidas (figura 4d). Especula-se que as diferenças entre os nanoSIMS e as medições de isótopos em massa para o carbono podem estar relacionadas com o fato de que as amostras de nanoSIMS foram preservadas com glutaraldeído, enquanto as amostras para análise em massa não foram. A fixação tem mostrado influenciar o carbono celular (Musat et al., 2014), embora pudéssemos esperar que isso diluísse o 13C nas medições dos nanossims em relação aos valores de massa., Uma explicação mais provável é que as medições de células únicas não são influenciadas por detritos celulares na cultura que podem ser menos enriquecidos. O valor de 13C a granel pode ser diluído por estes componentes em relação às medições dos nanossim, o que implica que os dados dos nanoSIMS podem reflectir com mais precisão a absorção de carbono e azoto pelas algas. No entanto, a variabilidade celular / celular também pode ter contribuído para as pequenas diferenças entre as medições de massa e nanossims.,o uso de nanossim neste estudo representa sua primeira aplicação para o estudo de fluxos de carbono e nutrientes em uma alga mixotrófica, e permitiu uma melhor compreensão da aquisição de carbono e energia por esta espécie, e metabolismo celular. Nossas descobertas expandem a informação disponível a partir de análises tradicionais de Ochromonas sp. estirpe BG-1 cultivada em várias condições de luz e disponibilidade de presas (Sanders et al., 2001), confirmando que a maioria do nitrogênio e carbono usado para o crescimento são obtidos através de sua presa bacteriana., Embora os resultados não possam ser diretamente extrapolados para todas as espécies ao longo do continuum de algas com diferentes estratégias mixotróficas, o nosso trabalho valida o uso de experimentos de sonda isotópica estável e nanoSIMS para entender melhor os fundamentos metabólicos de mixotrofia em uma espécie. Além disso, fornece uma abordagem para avaliar a nutrição mixotrófica em amostras ambientais. Ochromonas sp. a estirpe BG-1 forneceu um modelo ideal para comparar a análise de isótopos em massa com nanossímus, porque as bactérias foram rapidamente removidas por pastoreio dentro dos primeiros 48 h dos experimentos., O Acordo entre estas duas medições demonstra que os nanossímios captaram com precisão a dinâmica da aquisição de carbono e nutrientes neste mixotrófico, e poderiam, portanto, ser mais amplamente aplicados para explorar a mixotrofia em comunidades mistas complexas, onde as medidas a granel seriam insuficientes para capturar essa dinâmica. Este e os futuros estudos detalhados continuarão a produzir melhorias na nossa compreensão da nutrição das algas mixotróficas.