bloedinzameling en-verwerking
alle procedures waarbij menselijk bloed werd verzameld bij gezonde vrijwilligers waren in overeenstemming met de Human Research Ethics Committee van de Universiteit van Sydney (goedkeuring HREC 2014/244) en van alle individuen werd geïnformeerde toestemming verkregen., Alle procedures met betrekking tot het verzamelen van menselijk bloed bij ECMO-patiënten waren in overeenstemming met de Alfred Hospital Ethics, Monash University Standing Committee for Research in Humans (goedkeuring 388/13) en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle individuen. Alle procedures waren in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki van 1983. Bloed werd verzameld door venesectie met behulp van een 21 g vlinder Terumo naald van 10 gezonde donoren op geen medicijnen (vier man, zes vrouw, 22-58 jaar oud)., De eerste 5 mL bloed werd weggegooid om trombine te voorkomen dat rond de plaats van inbrengen van de naald werd gegenereerd en vervolgens werd opgezogen in buisjes met 3,2% V/v natriumcitraat. Bloed van acht patiënten in een enkel centrum die ECMO-ondersteuning hadden (vier mannen, vier vrouwen, 34-67 jaar oud) werd in ACD-a-buizen (Bd Vacutainer) getrokken., Patiënten met ECMO-ondersteuning kregen anti-stollings-en/of bloedplaatjesaggregatieremmers gebaseerd op het oordeel van artsen of institutionele richtlijnen waar patiënten doorgaans begonnen met warfarine, target international normalized ratio (INR) 2-3, met overbruggende heparine-infusie en aspirinetherapie, evenals dipyridamol voor degenen die als hoog risico op trombose worden beschouwd. Plasma werd bereid door tweemaal centrifugeren bij 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur., Bij sommige gelegenheden werd gezond donorplasma geschoren met snelheden van 2000 s – 1 of 10000 s-1 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een Kinexus pro+ reometer.de humane leverkankercellijn HepG2 (ATCC, HB-8065) werd gekweekt in DMEM, 10% foetaal kalverserum en glutamax bij 5% CO2 en 37 °C. cellen bij 80-90% confluentie werden gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing, gedurende 18 uur geïncubeerd in DMEM zonder serum bij 5% CO2 en 37 °C of in een hypoxische kamer bij 1% O2, 5% CO2 en 37 °C., Het geconditioneerde medium werd verzameld (1 mL per 4 × 106 cellen) en het uitgescheiden fibrinogeen werd onmiddellijk verwerkt zoals hieronder beschreven.
fibrinogeen-en fibrinebepalingen
plasmamonsters werden onbehandeld of geïncubeerd met trombine en / of de fibrinepolymerisatie-remmer GPRP (Sigma). Fibrine werd bereid in 1 mL plasma door toevoeging van 50 eenheden boviene trombine (Sigma) en 10 mM CaCl2 en MgCl2 gedurende 40 minuten bij 22 °C. De fibrinepolymeren werden verzameld met behulp van een plastic staafje., In één experiment werd plasma (2 mL) geïncubeerd met 27 eenheden/mL trombine en 10 mM CaCl2 en MgCl2 gedurende 40 minuten bij 22 °C, en het fibrinepolymeer werd verzameld op een plastic staaf en verwijderd. Het uitgeputte plasma werd geïncubeerd met een ander aliquot van 27 eenheden/mL trombine en het nieuwe fibrinepolymeer werd verzameld en verwijderd. Een aliquot van plasma (0,2 mL) werd bemonsterd voor en na toevoeging van beide partijen trombine, 150 µM d-fenylalanyl-prolyl-arginyl chloromethyl keton (Ppack, Sigma) toegevoegd om de trombineactiviteit te remmen en de monsters geïncubeerd gedurende 16 uur bij 22 °C., Het fibrinogeengehalte van de plasmamonsters werd geschat door het eiwit te verzamelen op polyklonale anti-fibrinogeen antilichaam-gecoate parels (zie volgende paragraaf), Het fibrinogeen op SDS-pagina op te lossen en kleuring met colloïdale Coomassie. In een ander experiment werd plasma geïncubeerd met 8 mM GPRP (Sigma) gedurende 5 minuten bij 22 °C voordat 50 eenheden/mL trombine gedurende 60 minuten bij 22 °C werd toegevoegd.de reactie werd geblust met 150 µM PPACK gedurende 10 minuten bij 22 °C. gezuiverde fibrinogenen werden geïsoleerd uit gezond donorvers bevroren plasma door β-alanine precipitatie32 of commercieel verkregen (Sigma F4883).,
kwantificering van de redoxtoestanden van fibrinogeen-en fibrinedisulfidebindingen
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) werden gecoat met 16 µg polyclonale anti-fibrinogeen-antilichamen (Dako, Cat A0080, Lot 00015063) in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 22 °C en het overtollige antilichaam verwijderd door driemaal te wassen met 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing. Plasma (0,7 mL) of HepG2-geconditioneerd medium (4,5 mL) werd geïncubeerd met de 2 mg gecoate parels op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 22 °C., De parels werden verzameld met behulp van een magneet, overtollig plasma aangezogen om het volume te verminderen, en geïncubeerd in 0,3 mL van 5 mM 12C-IPA in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% DMSO gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker om ongepaarde Cys thiolen in de eiwitten te alkyleren. De supernatanten werden aangezogen en de parels werden geïncubeerd met NuPAGE LDS-monsterbuffer (Life Technologies) met nog eens 5 mM 12C-IPA gedurende 30 min bij 60 °C. De supernatanten werden opgelost op SDS-PAGE., In plasma gegenereerde fibrinepolymeren werden verzameld op een plastic staaf en onmiddellijk ondergedompeld in 1 mL 5 mM 12C-IPA in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% DMSO gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker. Het fibrine werd 3 maal gewassen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing alvorens het polymeer gedurende 24 uur bij 22 °C op te lossen in 1 mL 20 mM azijnzuur.twintig microliter van de oplossing werd geïncubeerd met NuPAGE LDS-monsterbuffer (Life Technologies) met 5 mM 12C-IPA gedurende 30 minuten bij 60 °C en de eiwitten verdwenen op SDS-PAGE., Gezuiverd fibrinogeen (12 µg) werd geïncubeerd met 5 mM 12C-IPA in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% DMSO gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker en het eiwit verdween op SDS-PAGE.
de SDS-pagina gels werden gekleurd met colloïdale coomassie (Sigma) en de fibrine(ogen) banden werden uitgesneden, ontleed, gedroogd, geïncubeerd met 40 mM dithiothreitol en gewassen 14. De gelplakken werden geïncubeerd met 5 mM 13C – IPA (Cambridge-isotopen)gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker om de Disulfidebinding Cys te alkyleren, gewassen en gedroogd vóór de vertering van eiwitten met 12.,5 ng/µL trypsine (Promega) in 25 mM NH4CO2 ‘ s nachts bij 25 °C. peptiden werden geëlueerd uit de plakjes met 5% mierenzuur, 50% acetonitril. Nano-vloeistofchromatografie (nano-LC) werd uitgevoerd met behulp van een Ultimate 3000 HPLC en autosampler systeem (Dionex). Monsters werden geïnjecteerd in een fritless Nano-LC kolom (75 µm x ~12 cm) met C18 media (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) en verwarmd tot 45 °C voor alle runs. Peptiden werden geëlueerd met behulp van een lineaire gradiënt over 52 min, bij een debiet van 0,2 µL/min. Mobiele fase A bestond uit 0.,1% mierenzuur in H2O, terwijl mobiele fase B bestond uit acetonitril: H2O (8: 2) met 0,1% mierenzuur. De gradiënt was: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B en 52 min 2% B. hoogspanning (2000 V) werd toegepast op een laag volume tee (Upchurch Scientific) en de kolomtip werd ~0,5 cm van het verwarmde capillaire (T = 275 °C) van een LTQ Orbitrap Velos (Thermo elektron) massaspectrometer geplaatst. Positieve ionen werden gegenereerd door electrospray ionisatie en de massaspectrometer in werking gesteld data afhankelijke acquisitie mode., De volledige spectra van aftasten MS werden verworven (m / z 350-1750) door Orbitrap bij een resolutie van 30.000. De 15 meest voorkomende ionen (>5000 tellingen) met ladingstoestanden ≥ +2 werden sequentieel geïsoleerd en gefragmenteerd binnen de lineaire ionenval met behulp van collisionaal geïnduceerde dissociatie met een activering q = 0,25 en activeringstijd van 10 ms bij een streefwaarde van 30.000 ionen. M / z-verhoudingen geselecteerd voor MS / MS werden dynamisch uitgesloten voor 35 s. Ion Trap Zoom AGC Target: 3000,00. Ionenval volledig AGC-doel: 30000.00. Ion Val SIM AGC Target: 10000.00. Ion Trap MSN AGC Target: 10000.00., Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Mascot Daemon (versie 2.5.0, Matrix Science) tegen Swissprot database. Zoekparameters waren precursor tolerantie van 6 ppm en product ion toleranties van ±0,6 Da, en iodoacetanilide derivaat (Cys), iodoacetanilide 13C derivaat (Cys), oxidatie (Met) geselecteerd als variabele modificaties met volledige tryptische splitsing van maximaal drie gemiste splitsing. Met de lijst van cysteine-bevattende peptiden geïdentificeerd met behulp van mascotte, hun mono-isotopische massa/lading verhouding (m/z) van +2, +3, en +4 worden berekend met behulp van MS-Product (Versie v 6.2.2, Protein Prospector Tools)., Cys geëtiketteerd met 12C-IPA of 13C-IPA heeft een massa van 133.05276 of 139.07289, respectievelijk. Dertig Cys-bevattende peptiden werden geanalyseerd (aanvullende tabellen 1 en 2). De verschillende redoxvormen van de residuen van Cys werden gekwantificeerd van de relatieve ionenovervloed van peptiden geëtiketteerd met 12C-IPA en/of 13C-IPA. Om de Ion abundantie van peptiden te berekenen, werden geëxtraheerde ionchromatogrammen gegenereerd met behulp van XCalibur Qual Browser (V2.1.0; Thermo Scientific). Het gebied werd berekend met behulp van de geautomatiseerde piekdetectiefunctie ingebouwd in de software., De gegevens werden routinematig gezocht naar peptiden die vrije Cys-thiolen bevatten en deze werden niet gedetecteerd, wat erop wijst dat de alkylering van ongepaarde Cys-residuen door 12C-IPA of 13C-IPA volledig was in het eiwit.
fibrinogeendisulfide-gebonden peptideanalyse
gezond donorplasma (0,7 mL) werd geïncubeerd met Polyclonale Anti-fibrinogeenantilichaam-gecoate Dynabeads op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 22 °C. De parels werden verzameld, overtollig plasma opgezogen en 0,3 mL van 5 mM 12C-IPA in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% DMSO werd toegevoegd en gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker geïncubeerd., Vervolgens werd het supernatant opgezogen, de parels geïncubeerd met NuPAGE LDS monsterbuffer gedurende 30 min bij 60 °C en de supernatants opgelost op SDS-PAGE. Gelplakken die het fibrinogeen bevatten, werden voor de vertering gewassen en gedroogd met 12 ng/µL trypsine (Promega) gedurende 4 uur bij 37 °C. De reacties werden gestopt door toevoeging van 5% (v/v) mierenzuur en peptiden die uit de gelplakken werden geëlueerd met 5% mierenzuur en 50% (v/v) acetonitril. Peptiden in 0.,1% mierenzuur (eindvolume 12 µL) werd opgelost op een analytische kolom van 35 cm × 75 µm C18 met een gradiënt van 2-35% acetonitril over 22 minuten met een debiet van 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) en geanalyseerd op een LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer zoals hierboven beschreven. Disulfide-gekoppelde peptiden werden gezocht tegen menselijke fibrinogeenvolgorde met behulp van Byonic analysesoftware (Versie 3.9-7, Eiwitmetrics) met een vals ontdekkingspercentage van 1%. Alle disulfide-verbonden peptides werden handmatig geïnspecteerd op nauwkeurigheid., Precursor massa tolerantie en fragment tolerantie werden vastgesteld op 10 ppm en 0,6 Da, respectievelijk. Variabele modificaties werden gedefinieerd als geoxideerd Met, geoxideerd Cys (mono, di en tri) en glutathionyleerd Cys met volledige trypsineafsplitsing van maximaal drie overgeslagen splitsingen.
Fibrinogeenfunctionaliteitstest
gezuiverd fibrinogeen (0,2 mL van 10 mg / mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 5 mM 12C-IPA gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker tot Gealkyleerde ongepaarde Cys thiolen in het eiwit., De unreacted IPA werd verwijderd met behulp van een 7 KDA MWCO Zeba spin ontzilting kolom (Thermo Fisher). Fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1,1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid/mL boviene trombine (Sigma) gedurende 5 uur bij 22 °C in een totaal volume van 0,2 mL in 1,5 mL microcentrifugebuisjes. De fibrinepolymeren werden gedurende 15 minuten gepelleteerd bij 13.000 × g en de concentratie fibrinogeen die in het supernatans achterbleef, werd gemeten. De functionaliteit wordt uitgedrukt in het percentage fibrinogeen dat wordt verbruikt bij de vorming van fibrinepolymeren.,
Fibrinepolymeervorming gemeten door lichte verstrooiing
gezuiverd fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid / mL boviene trombine (Sigma). De toename van de absorptie bij 350 nm werd om de 30 s gedurende 15 minuten geregistreerd.
Fibrinepolymeerstructuur gemeten door scanning elektronenmicroscopie (SEM)
fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid/mL boviene trombine (Sigma) gedurende 2 uur bij 22 °C in een totaal volume van 0,2 mL., De fibrinepolymeren werden tweemaal gespoeld met 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde in PBS ‘ s nachts bij 4 °c, na gefixeerd met 1% OsO4 in PBS, gedehydrateerd met gesorteerde series ethanol en vervolgens kritisch punt gedroogd met een Leica EM CPD300. Monsters werden sputter gecoat met 15 nm goud (K550x, Emitech) en afgebeeld met een Zeiss SigmaHD veld emissie Scanning elektronenmicroscoop. De SEM micrographs werden geregistreerd bij 5 kV acceleratiespanning en een werkafstand van 5 mm. vezeldiameters werden gemeten met behulp van ImageJ.,
Fibrinepolymeerpermeatietest
fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid/mL boviene trombine (Sigma) gedurende 2 uur bij 22 °C in een totaal volume van 0,2 mL in polypropyleen chromatografiekolommen met een inwendige diameter 4,6 mm. de kolommen werden bedekt met 0,8 mL hepes-buffer en flux (J) werd berekend uit de gewicht van de druppels die in 20 minuten sijpelden., De permeatie (Darcy) constant33 werd berekend uit de relatie, Ks = JƞA / LP, waar J de flux is (cm3/s), ƞ de viscositeit van de buffer is (0,01 evenwicht bij kamertemperatuur), A de doorsnede van het stolsel is (0,17 cm2), L de lengte van het stolsel is (1,1 cm), en P de hydrostatische druk is (1,018,218 dyne/cm2).
fibrinepolymeerverdichtingstest
fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid/mL boviene trombine (Sigma) gedurende 16 uur bij 22 °C in een totaal volume van 0,5 mL in 1.,5 mL microcentrifugebuisjes die vooraf zijn gecoat met 10 mg / mL PEG-20000 in water en aan de lucht gedroogd. De fibrinepolymeren werden gecentrifugeerd bij 13.000 × g gedurende 5 tot 2400 s en het volume van de vloeistof geëxtrudeerd uit het polymeer gemeten.
Fibrinolysis assay
fibrinogeen of fibrinogeen-IPA (1,8 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) werd geïncubeerd met 1 eenheid/mL boviene trombine (Sigma) gedurende 2 uur bij 22 °C in een totaal volume van 0,5 mL in 24-Wells platen (15,6 mm diameter) gedurende 2 uur bij 22 °C. Een aliquot plasmine (5 µL van 0.,59 µM) werd toegevoegd aan het centrum van de putten en de platen geïncubeerd gedurende 18 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving. De lysisgebieden werden bepaald aan de hand van het gemiddelde van twee loodrecht gemeten diameters.
kwantificering van de redoxtoestanden van α2-macroglobulinedisulfidebindingen
de 10 gezonde donorplasma ‘ s die hierboven voor de analyse van fibrinogeen zijn beschreven, werden gebruikt voor de analyse van α2-macroglobuline volgens dezelfde procedures. Plasma (0.,7 mL) werd geïncubeerd met polyklonale Anti-α2-macroglobuline antilichaam (Dako, Cat Q0102, Lot 20068567)-gecoate Dynabeads (Life Technologies) op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 22 °C. De parels werden verzameld, overtollig plasma opgezogen en geïncubeerd in 0,3 mL van 5 mM 12C-IPA in fosfaatgebufferde zoutoplossing met 10% DMSO gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker tot Gealkyleerde ongepaarde Cys thiolen in de eiwitten. De supernatanten werden aangezogen en de parels werden geïncubeerd met NuPAGE LDS-monsterbuffer (Life Technologies) met nog eens 5 mM 12C-IPA gedurende 30 min bij 60 °C. De supernatanten werden opgelost op SDS-PAGE., De SDS-PAGE gels werden gekleurd met colloïdaal coomassie (Sigma) en de α2-macroglobulineband werd uitgesneden, ontdaan, gedroogd, geïncubeerd met 40 mM dithiothreitol en gewassen 14. De gelplakken werden geïncubeerd met 5 mM 13C-IPA (Cambridge-isotopen) gedurende 1 uur bij 22 °C in het donker om de Disulfidebindingscy ’s te alkyleren, gewassen en gedroogd vóór de vertering van eiwitten met 12,5 ng/µl trypsine (Promega) in 25 mM NH4CO2′ s nachts bij 25 °C. peptiden werden uit de plakjes geëlueerd met 5% mierenzuur, 50% acetonitril., Vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en gegevensanalyse werden uitgevoerd zoals beschreven voor fibrinogeen34. 17 Cys-bevattende peptiden werden geanalyseerd (aanvullende tabellen 2 en 4). De verschillende redoxvormen van de residuen van Cys werden gekwantificeerd van de relatieve ionenovervloed van peptiden geëtiketteerd met 12C-IPA en/of 13C-IPA.
Rapporteringssamenvatting
nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.