de Creatie van een contour plot van directe experimentele gegevens vereist het gebruik van een haalbaar high-throughput methode en een aanzienlijk aantal van de monsters. De test moet daarom geschikt zijn voor gebruik in een 96-wells plaatontwerp., De algemene voordelen van deze miniaturisatie van enkelvoudige reactiebuizen tot 96-wells platen zijn al aangetoond voor de dnsa en andere colorimetrische analyses . Alle analyses die in deze studie werden gebruikt, waren geschikt voor het 96-wells plaatformaat. Om een contourgrafiek te produceren, werden de enzym-en substraatmengsels geïncubeerd bij acht verschillende pH-niveaus. Deze acht pH-niveaus werden geïncubeerd bij 12 verschillende temperaturen met behulp van een gradiënt PCR-cycler, resulterend in 96 unieke reactievoorwaarden. Om de gegevens te verkrijgen werd een plaatlezer gebruikt., De resultaten werden omgezet in relatieve activiteiten waarbij de hoogste activiteit op elke plaat werd ingesteld op 100%. De meting werd uitgevoerd in drievoud en de gemiddelde waarden werden vervolgens omgezet in een contour plot met behulp van SigmaPlot, zoals beschreven in de sectie materialen en methoden. De activiteit (z-as) wordt weergegeven als kleur van paars naar rood in plaats van een normale as om de weergave van de contourplot te verbeteren.,
buffersysteem
een voorwaarde voor een betrouwbare bepaling van de pH-en temperatuuroptima is een stabiel buffersysteem dat geschikt is voor de enzymactiviteit en bijna resistent is tegen een pH-verschuiving bij toenemende temperatuur. Als alternatief kan dit effect worden overwogen in de contour plot. De invloed van de temperatuur op pKa van de buffers en daarmee pH is een feit dat moet worden overwogen, vooral voor alkalische buffers zoals Tris ., Als vereiste voor de analyse werden alle pH–variaties van ons citraat-fosfaatbuffersysteem getest op verandering in pH tussen 35 °C en 80 °C (Zie aanvullend dossier 4). Alle buffers vertonen een lichte daling van de pH bij stijgende temperatuur, waarbij de buffers bij hogere pH-waarden hogere afwijkingen vertonen. De temperatuurafhankelijkheid neemt toe met de hoeveelheid fosfaat, die correleert met de temperatuurcoëfficiënten van fosfaat (− 0,0028) en citraat (0)., Aangezien de temperatuurafhankelijke pH-variaties van alle buffers slechts gering waren, konden zij bij de samenstelling van de contourpercelen binnen de hier gebruikte waarden worden verwaarloosd. Indien echter een ander buffersysteem met een hogere temperatuurcoëfficiënt wordt gebruikt, is het gemakkelijk mogelijk om de contourplot aan te passen aan de verandering in pH door aan elke buffer een individuele pH toe te kennen bij elke temperatuur., Deze waarden worden ofwel experimenteel bepaald zoals beschreven in de respectievelijke materialen en methode sectie of afgeleid van de temperatuurcoëfficiënten en kunnen vervolgens dienovereenkomstig worden gebruikt om de x-as (pH) van het geleverde Sigmaplot bestand aan te passen.
Activiteitsbereik bepaling voor Cel8A
een overzicht van de verschillende enzymen, substraten en assays gebruikt in deze studie voor het maken van de respectieve contourpercelen wordt gegeven in Tabel 1.,
Cel8A is een cellulase, meer specifiek een endo-glucanase, van C. thermocellum en was de eerste enzym van glycoside hydrolase familie, 8 met een opgelost kristalstructuur . In deze studie werd het enzym geïncubeerd met BBG om onze voorgestelde methode te valideren gebruikend de analyse van DNSA. Cel8A heeft een optimale temperatuur bij 75 °C en een optimale pH tussen 5,5 en 6,5 ., Deze waarden zijn in overeenstemming met de resultaten van onze contourplot, aangezien ze binnen het gebied van > 90% activiteit liggen (Fig. 1). Onze contourgrafiek laat echter zien dat het enzym zeer actief is onder een breed scala van verschillende omstandigheden. Het enzym vertoont aanvaardbare activiteiten bij lagere pH-waarden tussen 60 °C en 65 °C en presteert ook met meer dan 60% van zijn maximale activiteit bij pH-waarden onder 4,5. Onze methode biedt de middelen om dergelijke effecten te visualiseren en de prestaties van een enzym op elk punt binnen de geteste parameters in één oogopslag te evalueren.,
Contour plot of Cel8A using the dnsa assay with barley-β-glucan as substrate
om te testen of onze methode geschikt is voor verschillende hydrolase assay methoden we produceerden een contour plot met cel8a met AZO-cm-cellulose als substraat en de respectievelijke assay (Fig. 2). Het perceel toont een vergelijkbare optima bij 75 °C en pH 5,5. Het gebruik van AZO-cm-cellulose als substraat resulteerde echter in een iets kleiner activiteitsbereik., De kleine verschillen tussen de twee analyses zouden aan de ongelijke structuren en verbindingstypes van beide substraten toe te schrijven kunnen zijn, daardoor verschillend in hun bindende eigenschappen aan het enzym. AZO-CM-cellulose is een niet-natuurlijk substraat met toegevoegde kleurstofgroepen, die nog meer aan dit effect kunnen toevoegen. Met behulp van Cel8A konden we aantonen dat onze methode geldige gegevens oplevert en geschikt is voor gebruik in twee verschillende beproevingen voor hydrolasen: DNSA en azo-CM-cellulose.
Contour plot van Cel8A met behulp van AZO-cm-cellulose
Activiteitsbereik bepaling voor Celluclast®
naast a een enkel enzym, een enzymmengsel werd bestudeerd. Celluclast® is een veel gebruikt commercieel cellulase product afgeleid van Trichoderma reesei. Het bestaat voornamelijk uit cellobiohydrolases en endo-1,4-β-glucanases, maar bevat ook xylanases en ten minste één β-xylosidase . De producthandleiding stelt dat de optimale activiteiten tussen 50 °C en 60 °C en pH 4 liggen.,5 en 6.0 . In dit werk produceerden we eerst een contour plot voor Celluclast® met BBG als substraat met behulp van de DNSA methode (Fig. 3). De bbg contour plot werd geverifieerd door een standaard temperatuur curve (Fig. 4). De resultaten van de temperatuurcurve bij pH 5,5 zijn in overeenstemming met de resultaten van de contourgrafiek, die hetzelfde activiteitsbereik toont. De meting van afzonderlijke curven is echter onvoldoende om de activiteit van Celluclast® op BBG te beschrijven. Het pH-bereik waarin het enzymmengsel een hoge activiteit vertoont, is sterk temperatuurafhankelijk., Hoe hoger de temperatuur, hoe lager de pH moet zijn om een hoge activiteit te bereiken. Celluclast® is bij ongeveer 45 °C zeer actief (> 60%) tot een pH van 6,5, terwijl het bij 65 °C slechts zeer actief is tot een pH van 5,0. Het beschrijven van de activiteit met twee afzonderlijke curves is daarom strikt afhankelijk van de waarde die als statische parameter is gekozen. Temperatuurgrafieken, bijvoorbeeld, die genomen op de twee uitersten van het opgegeven pH-bereik (4,5 en 6,0) moeten aanzienlijk verschillende resultaten opleveren. Hetzelfde geldt voor pH-grafieken genomen bij verschillende temperaturen., Om dit effect duidelijk te maken, produceerden we standaard pH-grafieken bij 45 °C, 55 °C en 65 °C (Fig. 5). Deze drie pH-curven tonen aan dat, bij toenemende temperatuur, de pH-grens voor hoge activiteit verschuift naar meer zure pH-waarden. De drie krommen bevestigen daarmee de resultaten die in de contourgrafiek worden gezien. Bovendien tonen ze de beperkingen van de conventionele separate activiteitsbepaling, die in ieder geval voor Celluclast®, in het geval van de pH-curven, afhankelijk is van de gekozen temperatuur., Het gebruik van onze contour plot methode omzeilt dit probleem volledig door het meten van het effect van temperatuur en pH in één stap.
Contour plot of Celluclast® using the dnsa assay with barley-β-glucan as substraat
conventionele temperatuur optimale bepaling van Celluclast® bij pH 5,0., Het temperatuuroptimum van Celluclast® op gerst-β-glucaan werd bepaald bij pH 5,0. De conventionele benadering toont de maximale activiteit rond 55 °C en is in overeenstemming met de resultaten gezien in de overeenkomstige contour plot
conventionele pH-optimale bepaling van Celluclast® bij drie temperaturen. Het pH-optimum van Celluclast® op gerst-β-glucaan werd bepaald bij 45 ° C, 55 ° C en 65 °C., Bij lagere temperaturen kan het enzym hogere pH-waarden verdragen. Dit is in overeenstemming met de overeenkomstige contourdiagram en toont de sterke impact van de gekozen vaste parameter bij het afzonderlijk bepalen van het pH-of temperatuuroptimum
het activiteitsbereik van Celluclast® op arabinoxylaan (Ax) (Fig. 6) verschilt van die met BBG als substraat. De activiteit is met name verschoven naar lagere temperaturen, waarbij geen hoge activiteiten worden waargenomen boven 60 °C., Aangezien Celluclast® een mengsel is van verschillende enzymen, is het zeer waarschijnlijk dat deze verschillende enzymen verschillende eigenschappen hebben. Het activiteitspatroon is echter vergelijkbaar met dat van BBG; bij pH 4,5 is het enzymmengsel bijvoorbeeld zeer actief tot bijna 60 °C, terwijl het bij pH 6,5 slechts zeer actief is tot 50 °C. In de literatuur werd het optimum van Celluclast® op tarweoplosbare AX bepaald door een response surface model (RSM) en bleek rond pH 4,4 en 39 °C te liggen ., Onze contour plot toont de hoogste activiteit in hetzelfde temperatuurbereik en bij een iets hogere pH, die nog steeds binnen de optimale bepaald door de RSM. Hoewel het optimum voor beide methoden bijna hetzelfde is, toont onze contourplot op opvallende wijze de exacte activiteit van Celluclast® op AX binnen het volledige bereik van de geteste omstandigheden en vertoont hij een gedetailleerdere dispositie dan de RSM. Met onze contour plots van Celluclast® op BBG en AX kunnen we aantonen dat complexe enzymmengsels geanalyseerd kunnen worden met de voorgestelde methode.
Contour plot of Celluclast® using the dnsa assay with arabinoxylaan as substraat
om de veelzijdigheid van de bepaling van ons activiteitsbereik verder aan te tonen, hebben we het gebruik ervan geëvalueerd met extra substraten en tests. De activiteit van Celluclast® op p-NP-β-d-glucopyranoside werd getest en de contourplot is weergegeven in Fig. 7. De hoge activiteit op dit substraat is beperkt tot een vrij smal bereik tussen pH 4,0 tot 5,5 en 55 °C tot 70 °C., Dit suggereert dat slechts één of enkele enzymen in het celluclast ® – enzymmengsel waarschijnlijk activiteit vertonen in de richting van p-NP-β-d-glucopyranoside. p-NP glycosiden kunnen worden gebruikt als substraten voor de bereiding van contourpercelen. Echter, niet alle P-NP glycosiden zijn geschikte substraten in de assay, aangezien verscheidene van hen hoge achtergrond vertonen als gevolg van instabiliteit (zie aanvullend dossier 5), vooral wanneer hoge temperaturen worden gecombineerd met hoge pH-waarden.
Contour plot of Celluclast® using p-NP-β-D-glucopyranoside
om de toepassing van onze methode op een natuurlijke biomassa te testen we kozen voor een substraat op basis van stro. Het vrijkomen van glucose door Celluclast® werd gedetecteerd met behulp van de commerciële D-glucose hk-assay (Megazyme). De belangrijkste component in de celwand van stro is cellulose , de belangrijkste bron van enzymatisch vrijgekomen glucose. Contour plot (vijg., 8), daarom, toont voornamelijk de activiteit van Celluclast® op kristallijne cellulose ,die recalcitrant in de richting van enzymatische afbraak. De hoogste afgifte van glucose werd waargenomen bij een pH van ongeveer 4,0 tot 5,5 en een temperatuur van 40 °C tot 60 °C. Het bereik met hoge activiteit is daarom minder breed dan bepaald voor BBG, waarmee rekening moet worden gehouden bij een proces dat voornamelijk gericht is op de afbraak van cellulose., Met het gebruik van D-glucose HK en p-NP-β-D-glucopyranoside als alternatieve analyses, konden wij het aanpassingsvermogen van onze methode aan een totaal van vier verschillende en algemeen gebruikte glycosidehydrolase analyses aantonen. Het gebruik van stro toonde aan dat onze methode ook geschikt is voor natuurlijke substraten van industrieel belang en kan worden gebruikt voor de evaluatie van complexe processen en substraten. Celluclast ® toont verschillende activiteitsprofielen op verschillende substraten., Collectief voor alle methodes, is het daarom cruciaal om de pH en temperatuurwaaiergegevens van een enzym met het substraat van belang te bepalen.
Contour plot of Celluclast® using the D-glucose hk assay with a straw-based natural substraat
overwegingen bij gebruik van de methode
wanneer met de voorgestelde methode een contourperceel wordt geproduceerd, moet met verschillende overwegingen rekening worden gehouden., Het substraat moet stabiel zijn en de gemeten achtergrond reproduceerbaar over het volledige gamma van omstandigheden in de 96-wells plaat. Dit is een voorwaarde, omdat de substraatregeling vóór de omzetting in relatieve activiteiten van alle waarden moet worden afgetrokken, maar niet rechtstreeks op de plaat kan worden gemeten voor elk van de 96 omstandigheden. Verschillende P-NP glycoside substraten kunnen bijvoorbeeld niet worden gebruikt, omdat ze een sterk temperatuur – en pH-afhankelijke achtergrond vertonen. Zeer nauwkeurig pipetteren is noodzakelijk om een aanvaardbare standaardafwijking van de triplicaten te verkrijgen., Het gebruik van 96-Kops en 8-kanaals pipetten wordt sterk aanbevolen, omdat ze de nauwkeurigheid aanzienlijk verbeteren en de procedure versnellen. Bovendien, plaatlezer en gradiënt PCR cycler zijn technische vereisten om de methode goed uit te voeren. Het temperatuurbereik waarin de methode kan worden uitgevoerd, kan worden aangepast aan de technische eigenschappen van de gradiënt PCR-cycler, die gewoonlijk beperkt is tot 30 ° C of 40 °C en vaak geen waarden Onder 20 °C kan bevatten., We zetten de absorptie direct om in relatieve activiteit van een enzym, omdat de waarden allemaal op een lineaire kalibratiecurve staan (gegevens worden niet getoond). Als dat echter niet het geval is, moet de activiteit eerst worden berekend, bijvoorbeeld in U/mg, en deze waarden kunnen dan worden gebruikt om de contour plot te produceren. Wanneer men een contourplot wil maken voor een enzym dat sterk afhankelijk is van divalente metaalionen, moet een ander buffersysteem worden gebruikt, omdat op citraat–fosfaat gebaseerde buffers deze ionen complexeren.,
hoewel RSM-benaderingen een onbetwistbaar krachtig instrument zijn om complexe relaties te beoordelen, bijvoorbeeld diverse variabelen die meerdere factoren beïnvloeden, is het bepalen van het effect van alleen pH en temperatuur op de activiteit niet te complex om door directe meting te worden bereikt. De bepaling van de juiste grenswaarden van het model kan verschillende benaderingen volgen en kan het resulterende model beïnvloeden. Het RSM-model is afgeleid van slechts een klein aantal metingen rond het centrale punt van de activiteit van het enzym en de nauwkeurigheid ten opzichte van de werkelijke experimentele waarden moet achteraf worden getest., De totale resolutie van de RSM is daarom lager dan met onze methode wordt verkregen, wat het moeilijk maakt om activiteitseffecten te zien zoals die voor Celluclast® bij hogere temperaturen en/of pH-waarden worden getoond. Onze methode vereist niet de mogelijkheid om complexe statistische modellen te ontwerpen en kan worden uitgevoerd met minimale en relatief standaard technische eisen. Een nadeel zowel onze methode als RSM aandeel is dat directe visualisatie van de standaardafwijking binnen de driedimensionale plot niet mogelijk is., Onze methode maakt echter de berekening van de standaardafwijking voor elk afzonderlijk gegevenspunt mogelijk. De meeste RSM-modellen bepalen de standaardafwijking voor het hele model alleen op basis van gegevens van het centrale gegevenspunt van het model, terwijl de andere gegevenspunten slechts één keer worden gemeten . De standaardafwijkingen zijn natuurlijk hoger aan de grenzen van de activiteit van een enzym en illustreren een sterke invloed op de activiteit binnen een lichte verandering van omstandigheden. Rond het optimale en binnen gebieden met geen of lage activiteit zijn de afwijkingen aanzienlijk lager., Aangezien de voorgestelde methode resulteert in een volledige factoriële gegevensverzameling, zou het mogelijk zijn om, indien nodig, een statistisch model te berekenen voor verdere analyse. Het afgeleide statistische model zou rechtstreeks gebaseerd zijn op experimentele gegevens, maar is een extra stap die niet nodig zou moeten zijn voor standaardtoepassingen van de methode.samenvattend is een gemakkelijke beoordeling van de geschiktheid van een enzym of een enzymmengsel voor een combinatie van procesparameters van cruciaal belang bij het ontwerpen van biotechnologische processen op laboratorium-of industriële schaal., Temperatuur en pH zijn twee van de belangrijkste procesfactoren die de enzymactiviteit beïnvloeden. De conventionele benaderingen om het effect van die factoren op enzymen te testen zijn gebaseerd op de veronderstelling dat er een tweedimensionale correlatie tussen temperatuur en activiteit evenals pH en activiteit is. In tegenstelling, nieuwe benaderingen bepalen de relatie in driedimensionale materie, maar zijn op statistieken gebaseerd, complex om te ontwerpen en hun nauwkeurigheid aan de feitelijke gegevens kan variëren., De hier geà ntroduceerde methode maakt een snelle en eenvoudige bepaling van het effect dat de temperatuur en pH hebben op de activiteit van het enzym gelijktijdig met behulp van 96-wells platen, meerkanaals pipetten, en een gradiënt PCR cycler. Met deze technische basisuitrusting is het mogelijk om contourpercelen van pH, temperatuur en activiteit te produceren die direct gebaseerd zijn op experimentele gegevens. De methode werd getest voor verscheidene wijdverspreide glycosidehydrolase analyses evenals model en complexe substraten.