groei en nutriëntendynamica van Ochromonas sp.,, stam BG-1
Fagotrofie door fototrofe flagellaten wordt verondersteld significante ecologische voordelen te bieden aan algen die dit gedrag vertonen (Flynn and Mitra, 2009), maar er lijken ook beperkingen te zijn (hoewel grotendeels niet gekarakteriseerd) voor het gelijktijdig uitvoeren van gemengde voeding in een enkele cel (Raven, 1997). Deze beperkingen kunnen kosten of afwegingen voor het handhaven van dubbele cellulaire machines (in vergelijking met gespecialiseerde concurrenten), of misschien cross-talk tussen anabole en katabole biochemische wegen die de prestaties van beide activiteiten gelijktijdig verwarren., Helaas is er vrijwel geen kwantitatieve informatie over de kosten en baten van mixotroop gedrag, noch over de vraag of beide processen achtereenvolgens of gelijktijdig door deze soorten worden uitgevoerd. Temporele partitionering kan een mechanisme zijn voor het handhaven van beide vermogens in minutieuze cellen (zij het dat één proces op een bepaald moment ‘in de wacht’ wordt gezet)., Het beoordelen of beide gedragingen gelijktijdig voorkomen, de specifieke fysiologische voordeel (s) voor heterotrofe voeding in mixotrofe algen, en de responsiviteit van dit gedrag aan abiotische en biotische variabelen zijn aspecten van mixotrofe voeding die moeilijk zijn om vast te stellen met behulp van traditionele benaderingen en methoden.
we bestudeerden de mixotrofe chrysofyte Ochromonas sp., stam BG-1 omdat het kan worden gekweekt in axenische cultuur (bacterievrij) en het is eerder gemeld als een overwegend heterotroop organisme dat hoge groeipercentages bereikt alleen in de aanwezigheid van bacteriën (Sanders et al., 2001). De groei in axenic cultuur verhinderde potentieel complicerende biologische interactie en elementaire stromen als gevolg van de activiteiten van andere levende micro-organismen in de culturen, waardoor een vergelijking tussen nanoSIM en bulk IRMS metingen en een beter begrip van de specifieke bronnen van koolstof en stikstof die voor de groei door de alga worden gebruikt.,
Bovendien heeft het gebruik van één anorganische stikstofbron ons experimenteel ontwerp vereenvoudigd, zodat de enige stikstofbronnen in het medium ammonium of HKB waren. Algen bezitten over het algemeen mechanismen voor de opname en assimilatie van zowel ammonium als nitraat, maar transcriptomic gegevens wijzen erop dat sommige chrysofyten, waaronder Ochromonas sp. stam BG-1, ontbreekt mogelijk het genetische vermogen voor nitraatassimilatie (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Bovendien werd MES buffer niet toegevoegd aan het medium in onze experimenten omdat dit een alternatieve bron van stikstof zou kunnen hebben geleverd. MES zou ook een bron van organische koolstof voor de alg (Sanders et al., 2001), en de eliminatie ervan zorgde ervoor dat de enige koolstofbronnen in het medium ofwel bicarbonaat of HKB waren. Transcriptomische analyse van experimenten uitgevoerd op dezelfde manier als die in dit manuscript laten zien dat de fotosynthetische machinerie van Ochromonas sp. stam BG-1 wordt uitgedrukt en upregulated in de aanwezigheid van licht (Lie et al., 2017)., Deze vereenvoudigde benadering, gecombineerd met stabiele isotopenetikettering, stelde ons in staat om te bepalen welke bron(nen) van stikstof en koolstof werden gebruikt voor de groei door de alg.
significante groeisnelheden van Ochromonas in dit onderzoek werden alleen bereikt terwijl HKB als prooi overvloedig aanwezig was (figuur 1a). De dynamiek van Chl a in de cultuur weerspiegelde ook de hoge groeisnelheden als gevolg van begrazing op HKB, aangezien de concentratie van CHL a cell−1 tijdens de eerste 48 uur van incubatie met één orde van grootte daalde voor culturen die zowel in het licht als in continue duisternis werden gekweekt (figuur 1d)., Deze veranderingen in cellulaire chlorofyl kunnen verband houden met een verdunning van Chl A in de cellen als gevolg van de hoge groeisnelheden van de alg (Hansen et al., 2000), zodat de reductie van Chl a cell−1 een gevolg was van snel groeiende snelheden van de alg en niet een directe reductie van chlorofyl biosynthese snelheid. Niettemin, is het ook mogelijk dat er één of andere regulatie van chlorofylbiosynthese was toen HKB aanwezig was als transcriptomic analyse op deze alga suggereert upregulation van genen met betrekking tot chlorofylsynthese in de aanwezigheid van licht toen HKB werden uitgeput (Lie et al., 2017)., In ieder geval zijn deze waarnemingen in overeenstemming met eerdere studies van Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) dat een goed ontwikkelde heterotrofe capaciteit waarnam, die suggereert dat koolstoffixatie en misschien andere cellulaire structuren en processen betrokken bij fotosynthese worden verminderd wanneer het kweken van mixotrophic, zoals waargenomen voor sommige andere algen (Wan et al., 2011).
opgeloste ammonium en fosfaat, verzameld in de Ochromonas culturen tijdens de eerste 48 uur van de experimenten, toen HKB actief werd begraasd (Figuur 2)., Dit resultaat geeft aan dat overtollige stikstof en fosfor uit begraasd HKB door de alg werden uitgescheiden. Massabalansberekeningen op basis van veranderingen in de abundantie van prooien/algen en hun celstikstofgehalte gaven aan dat tot 50% van de stikstof in verbruikte HKB door de alg werd opgenomen, terwijl een aanzienlijke hoeveelheid van de overtollige stikstof voornamelijk als ammonium werd vrijgegeven tijdens de periode van actieve bacteriële begrazing (Figuur 2)., Deze waarden voor stikstofassimilatie (en excretie) komen overeen met de assimilatie-efficiëntie van heterotrofe protisten van vergelijkbare grootte (Taylor, 1982; Caron and Goldman, 1990), consistent met de conclusie dat Ochromonas voornamelijk als heterotroof groeide toen er een overvloed aan prooien was. Verder hebben transcriptomic analyses aangetoond dat verschillende ammoniumtransporters door Ochromonas sp worden uitgedrukt. stam BG-1 groeit op HKB in vergelijking met de groei nadat bacteriën zijn begraasd tot zeer lage abundanties (Lie et al., 2017)., Daarom blijkt dat transporters voor de export van ammonium uit de cel anders kunnen zijn dan die welke worden gebruikt voor de opname van ammonium, zoals is waargenomen voor andere organismen (Shnaiderman et al., 2013).interessant is dat de concentraties ammonium, maar niet fosfaat, in het medium daalden nadat de HKB was verwijderd door begrazing (dat wil zeggen na 48 uur; Figuur 2) toen Ochromonas in het licht werd gekweekt., Dit resultaat lijkt erop te wijzen dat de alg actief ammonium (maar geen fosfaat) uit het medium nam toen bacteriën niet meer beschikbaar waren en fotosynthese werd geïnduceerd (figuur 1d). Daarentegen bleven zowel ammonium als fosfaat in de in het donker geteelde culturen gedurende het experiment stijgen (stippellijnen in Figuur 2). Zelfs in het licht was er geen significante groei van de algenpopulatie na uitputting van prooien, en de verklaring voor de tweedeling in de opname van deze twee elementen is onduidelijk., We speculeren dat ammonium werd opgenomen omdat het specifiek nodig was voor de wederopbouw van de fotosynthetische machines van de cel.
het voortdurende voorkomen van fosfaat in het kweekmedium tijdens het latere deel van de experimenten staat in contrast met studies van enkele andere Ochromonas-soorten die een opname van fosfaat hebben gemeld wanneer de alg autotroop groeit (Rothhaupt, 1996)., Het gebrek aan fosfaatopname door stam BG-1 kan erop wijzen dat deze Ochromonas niet in staat was tot effectieve fosfaatopname (wat gedeeltelijk ook de slechte fototrofische groeicapaciteit van deze stam kan verklaren), of dat fosfor niet in significante hoeveelheden nodig was voor cellulaire reorganisatie in verband met de verandering in fototrofische groei, en daarom werd de opname niet gestimuleerd door de verandering in fototrofie., Het is onwaarschijnlijk dat de voortdurende toename van de fosfaatconcentratie te wijten was aan de afbraak van opgeloste organische fosforverbindingen in het medium, omdat de culturen geen levende bacteriën hadden.
gevolgtrekkingen uit experimenten met stabiele isotopensondes
stabiele isotopenanalyse (nanoSIM en bulk elementanalyse-IRMS) toonden aan dat zowel anorganische (13C-bicarbonaat en 15N-ammonium) substraten als met 13C/15N gelabelde HKB werden geassimileerd door Ochromonas, wat bijdroeg tot de cellulaire verrijking van 15N en 13C na 48 uur incubatie (Figuur 4)., De omvang van de verrijking uit anorganische substraten of HKB wees er echter op dat tijdens de mixotrofe groei de primaire bronnen van koolstof en stikstof afkomstig waren van fagotrofie. Isotopische massabalans gaf aan dat 88-95% van de stikstof en 84-99% van de koolstof afkomstig waren van HKB toen Ochromonas mixotroop groeide in het licht. Een verrijking van 13C werd waargenomen bij algen die in het licht werden gekweekt in vergelijking met donker (Experiment 1 versus Experiment 3) Wanneer 13C-bicarbonaat beschikbaar was (Figuur 4)., De berekende bijdrage van fotosynthetische koolstoffixatie bedroeg echter slechts 1-10% van de in biomassa geassimileerde koolstof. De grotere efficiëntie van de opname van stikstof uit prooi waargenomen in het licht ten opzichte van continue duisternis (Figuur 3; experimenten 1, 2 vs Experiment 3) suggereert dat licht een rol speelde, zij het een kleine, in de fagotrofe efficiëntie van de alg., Ondanks veronderstelde reducties in de fotosynthetische machines van Ochromonas die fagotroop op HKB groeiden (zoals blijkt uit lage celquota van Chl a; figuur 1d), had licht daarom een geringe en positieve invloed op de algenvoeding. Omdat de door fotosynthese gefixeerde hoeveelheid koolstof een kleine fractie van de door de alg geassimileerde koolstof vertegenwoordigde bij het groeien op HKB, speculeren we dat het fotosynthetische apparaat eerder energie zou kunnen leveren dan koolstof voor cellulair materiaal, zoals het is verondersteld voor Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
onze isotopische massabalansberekeningen hebben twee kanttekeningen. Ten eerste hebben we de pH-evolutie binnen de culturen niet gecontroleerd, wat een beter inzicht zou hebben gegeven in het carbonaatevenwicht dat zou kunnen worden beïnvloed door ademhaling en koolstoffixatie, en uitwisseling met de atmosfeer. Als zodanig, onze schatting gebaseerd op de experimenten met geëtiketteerde anorganische koolstof zou de hoeveelheid anorganische koolstof die door Ochromonas sp. BG-1 (1% volgens de isotopenmassabalans)., In ieder geval, zou het experiment met geëtiketteerde HKB niet door dit voorbehoud moeten zijn beà nvloed, en de schatting van 10% van koolstof afgeleid van anorganisch substraat is waarschijnlijk realistisch. Ten tweede, Ochromonas wordt beschouwd als een inefficiënte koolstof fixer als gevolg van ontbrekende koolstofconcentratiemechanismen (Maberly et al. 2009) die de CO2-concentratie verhogen via het transport van CO2 en / of bicarbonaat naar het Rubisco-enzym (Raven et al., 2008). Aan de andere kant, transcriptomic analyse hebben aangetoond dat de fotosynthetische machinerie van Stam BG-1 functioneel is (Lie et al.,, 2017), en onze experimenten met gelabeld bicarbonaat toonden een significante verrijking aan van de 13C fractionele abundantie in Ochromonas (figuren 4 en 5); daarom Ochromonas sp. stam BG-1 heeft enige capaciteit om anorganische koolstof te gebruiken, zij het inefficiënt.
niettemin is het waarschijnlijk dat de sterke heterotrofe activiteit van Ochromonas, terwijl het mixotroop groeit, zowel de intracellulaire CO2-pool als de flux ervan verhoogt. Als vuistregel wordt aangenomen dat heterotrofe protisten 40% van de ingeslikte organische stof assimileren, terwijl zij 30% vrijgeven en nog eens 30% uitademen (Slee, 1989)., Op basis hiervan kan de totale hoeveelheid koolstof die door Ochromonas als CO2 vrijkomt tijdens exponentiële groei even hoog zijn als het totale bicarbonaat dat aan het begin van de incubatie wordt toegevoegd, wat gevolgen heeft voor de isotopische massabalans die we hebben gepresenteerd. Als we aannemen dat het isotopisch verrijkte CO2 afkomstig van de HKB-ademhaling beschikbaar is op dezelfde niveaus als de opgeloste anorganische koolstof, dan gaf de incubatie uitgevoerd met Ochromonas en gelabeld HKB aan dat ~84% van de koolstof afkomstig was van de HKB., Tot 20% van de geassimileerde koolstof afkomstig van HKB kan eigenlijk overeenkomen met koolstof die aanvankelijk werd uitgeademd en vervolgens gefixeerd door Ochromonas. Als het juist is, zou de ademhaling afgeleid van de fagotrofe activiteit fungeren als een soort koolstofconcentratiemechanisme voor deze Ochromonas. Terwijl de primaire bron van koolstof voor Ochromonas die mixotrophically kweken werd afgeleid van HKB, zou een niet-verwaarloosbare hoeveelheid kunnen zijn afgeleid van de ademhaling en vervolgens CO2-fixatie van de bacteriële biomassa.,Ochromonas veranderde zijn metabolisme naar autotrofie toen het in het licht werd geïncubeerd, maar pas nadat het de HKB in de culturen had uitgeput (≈48 uur groei). Deze verschuiving werd weerspiegeld in de bulk IRMS 13C fractionele abundantie voor de behandeling met behulp van geëtiketteerde HKB waar een vermindering werd waargenomen tussen 48 uur en 145 uur (Experiment 2 in Figuur 5), indicatief voor de incorporatie van niet-geëtiketteerde koolstof in algenbiomassa via lichte processen. Chrysofyten worden over het algemeen beschouwd als slechte autotrofe koolstof fixers als gevolg van slechte koolstofconcentratiemechanismen (Maberly et al., 2009)., Niettemin wijzen deze resultaten erop dat er een significant niveau van anorganische koolstofassimilatie was. Een vergelijking van culturen gekweekt in het licht (Experiment 1 in Figuur 5) en continue duisternis (Experiment 3 in Figuur 5) toonde aan dat de 15N fractionele overvloed van de donkere culturen niet veranderde na 95 uur, terwijl culturen in het licht bleven verrijken in 15N, wat aangeeft dat Ochromonas stikstof bleef assimileren om zijn metabolisme te handhaven zodra HKB was uitgeput., Deze resultaten waren consistent met waargenomen dalingen in de ammoniumconcentratie in het medium gedurende deze periode (figuur 3a), hoewel het aanhoudende optreden van fosfaat in het medium gedurende deze periode onverklaard is.
We verkregen een goede algemene overeenkomst tussen de bulk isotoop metingen en nanoSIM metingen voor stikstof, in overeenstemming met waarnemingen in eerdere studies (Popa et al., 2007; Orphan and House, 2009; Kopf et al., 2015; figuur 4c)., De bulkmetingen waren echter iets lager in termen van fractionele abundantiewaarden voor koolstof, met name voor sterk verrijkte monsters (figuur 4d). We speculeren dat de verschillen tussen nanoSIM en de bulk isotoop metingen voor koolstof gerelateerd kunnen zijn aan het feit dat nanoSIM monsters werden geconserveerd met glutaaraldehyde, terwijl de monsters voor bulk analyse dat niet waren. Er is aangetoond dat fixatie cellulaire koolstof beïnvloedt (Musat et al., 2014), hoewel we hadden kunnen verwachten dat dit de 13C in de nanosimmetingen zou verdunnen ten opzichte van de bulkwaarden., Een waarschijnlijker verklaring is dat de eencellige metingen niet worden beïnvloed door cellulair puin in de cultuur die minder verrijkt kan zijn. De bulkwaarde 13C kan met betrekking tot de nanosimmetingen door deze componenten worden verdund, wat impliceert dat de nanosimgegevens de opname van koolstof en stikstof door de algen nauwkeuriger kunnen weerspiegelen. Nochtans, kan de cel aan celvariabiliteit ook tot de minder belangrijke verschillen tussen de bulk en nanosimsmetingen hebben bijgedragen.,
het gebruik van nanoSIM in deze studie is de eerste toepassing op de studie van koolstof-en nutriëntenfluxen in een mixotrofe alg, en heeft een beter begrip mogelijk gemaakt van koolstof-en energie-acquisitie door deze soort, en cellulair metabolisme. Onze bevindingen breiden de beschikbare informatie uit de traditionele analyses van Ochromonas sp. Strain BG-1 gekweekt onder verschillende omstandigheden van licht en prooien beschikbaarheid (Sanders et al., 2001), bevestigend dat het grootste deel van de stikstof en koolstof die voor de groei worden gebruikt door zijn bacteriële prooi worden verkregen., Hoewel de resultaten niet direct kunnen worden geëxtrapoleerd naar alle soorten langs het continuüm van algen met verschillende mixotrofe strategieën, valideert ons werk het gebruik van stabiele isotoop probing experimenten en nanoSIM om de metabole onderbouwing van mixotrofie in één soort beter te begrijpen. Bovendien biedt het een benadering voor de beoordeling van mixotrofe voeding in milieumonsters. Ochromonas sp. stam BG-1 bood een ideaal modelsysteem om de analyse van bulkisotopen te vergelijken met nanoSIM, omdat bacteriën snel werden verwijderd door begrazing binnen de eerste 48 uur van de experimenten., De overeenkomst tussen deze twee metingen toont aan dat nanoSIMS nauwkeurig de dynamica van koolstof en nutriënten acquisitie in deze mixotroph vastgelegd, en zou daarom breder kunnen worden toegepast om mixotrofie in complexe gemengde gemeenschappen waar bulk maatregelen onvoldoende zouden zijn om deze dynamica vast te leggen. Deze en toekomstige gedetailleerde studies zullen verbeteringen blijven opleveren in ons begrip van de voeding van mixotrofe algen.