Blod innsamling og behandling
Alle prosedyrer som involverer innsamling av humant blod fra friske frivillige var i samsvar med Human Research Ethics Committee of the University of Sydney (godkjenning HREC 2014/244), og informert samtykke ble innhentet fra alle personer., Alle prosedyrer som involverer innsamling av humant blod fra ECMO pasienter var i samsvar med Alfred Hospital Etikk, Monash University Stående Komité for Forskning på Mennesker (godkjenning 388/13), og informert samtykke ble innhentet fra alle personer. Alle prosedyrene var i samsvar med Helsinki-Deklarasjonen av 1983. Blod ble samlet inn ved årelating ved hjelp av en 21 g butterfly needle Terumo fra 10 friske givere på ingen medisiner (fire menn, seks kvinner, 22-58 år gamle)., De første 5 mL blod ble forkastet for å unngå eventuelle trombin som kan ha blitt generert rundt nålen innstikkstedet og deretter trekkes inn i rør som inneholder 3.2% v/v natriumsitrat. Blod fra åtte pasienter på en enkelt senter som hadde ECMO-støtte (fire menn, fire kvinner, 34-67 år gamle) ble trukket inn ACD-ET rør (BD Vacutainer)., Pasienter med ECMO støtte mottatt anti-koagulering og/eller platehemmende medikamenter basert på klinikere’ skjønn eller institusjonelle retningslinjer for hvor pasientene vanligvis begynte på warfarin, målet internasjonal normalisert ratio (INR) 2-3, med bro over heparin infusjon og aspirin terapi, så vel som dipyridamole for de som er vurdert som høy risiko for trombose. Plasma ble utarbeidet av to ganger sentrifugering på 800 × g i 20 min ved romtemperatur., På enkelte anledninger, sunn donor plasma ble skåret på priser av 2000 s−1 eller 10 000 s−1 for 5 min i romtemperatur ved hjelp av en Kinexus pro+ rheometer.
Hepatocyte fibrinogen collection
Den menneskelige leveren kreft celle-linje HepG2 (ATCC, HB-8065) ble dyrket i DMEM, 10% foetal kalveserum og glutamax ved 5% CO2 og 37 °C. Celler på 80-90% samløpet ble vasket med fosfat-bufret saltvann, inkubert i 18 h i DMEM uten serum ved 5% CO2 og 37 °C eller i en hypoksisk kammer ved 1% O2, 5% CO2 og 37 °C., Den har medium var samlet inn (1 mL per 4 × 106 celler) og utskilles fibrinogen umiddelbart behandles som beskrevet nedenfor.
Fibrinogen og fibrin analyser
plasmaprøver ble ubehandlet eller inkubert med trombin og/eller fibrin polymerisering inhibitor, GPRP (Sigma). Fibrin ble utarbeidet i 1 mL plasma ved tillegg av 50 enheter av storfe trombin (Sigma) og 10 mM CaCl2 og MgCl2 i 40 min på 22 °C. fibrin polymerer ble samlet inn ved hjelp av en plast stang., I ett eksperiment, plasma (2 mL) ble inkubert med 27 Enheter/mL av trombin og 10 mM CaCl2 og MgCl2 i 40 min på 22 °C, og fibrin polymer som samles inn på en plast stang og fjernet. Den tomme plasma ble inkubert med en annen delmengde av 27 Enheter/mL av trombin og den nye fibrin polymer som samles inn og fjernet. En alikvot av plasma (0,2 mL) ble prøvetatt før og etter tilsetting av både massevis av trombin, 150 µM av d-phenylalanyl-prolyl-arginyl chloromethyl keton (PPACK, Sigma) lagt til for å hemme trombin aktivitet, og prøvene inkubert for 16 h til 22 °C., Den fibrinogen innhold av plasmaprøver ble estimert ved å samle protein på polyklonale anti-fibrinogen antistoff-belagt perler (se neste avsnitt), løse fibrinogen på SDS-PAGE og farging med kolloidalt Coomassie. I et annet eksperiment, plasma ble inkubert med 8 mM GPRP (Sigma) for 5 min på 22 °C før tillegg av 50 enheter/mL av trombin i 60 min ved 22 °C. reaksjonen var slukket med 150 µM av PPACK i 10 min ved 22 °C. Renset fibrinogens var isolert fra friske donor frisk frosset plasma ved β-alanin precipitation32 eller innhentet kommersielt (Sigma F4883).,
Kvantifisering av redox-statene av fibrinogen og fibrin disulfide obligasjoner
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) var belagt med 16 µg av polyklonale anti-fibrinogen antistoffer (Dako, Katt A0080, Mye 00015063) i 1 mL av fosfat-bufret saltvann på en roterende hjulet for 1 h ved 22 °C, og de overskytende antistoff fjernes ved å vaske tre ganger med 1 mL av fosfat-bufret saltvann. Plasma (0.7 mL) eller HepG2 med klimaanlegg, medium (4.5 mL) ble inkubert med 2 mg filmdrasjerte perler på en roterende hjulet for 1 h ved 22 °C., Perlene ble samlet inn ved hjelp av en magnet, overflødig plasma-aspirert til å redusere volumet, og inkubert i 0.3 mL 5 mM 12C-IPA i fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder 10% DMSO-for 1 t ved 22 °C i mørket for å alkylate gruppert Cys thiols i proteiner. Den supernatants var aspirert, og perlene inkubert med NuPAGE LDS eksempel buffer (Life Technologies) som inneholder ytterligere 5 mM 12C-IPA i 30 min ved 60 °C. supernatants ble løst på SDS-PAGE., Fibrin polymerer som genereres i plasma ble samlet inn på en plast stang og umiddelbart nedsenket i 1 mL 5 mM 12C-IPA i fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder 10% DMSO-for 1 t ved 22 °C i mørket. Den fibrin ble vasket 3 ganger med fosfat-bufret saltvann før oppløsning av polymer i 1 mL av 20 mM eddiksyre for 24 t ved 22 °C. Tjue microliters av løsningen ble inkubert med NuPAGE LDS eksempel buffer (Life Technologies) inneholder 5 mM 12C-IPA i 30 min ved 60 °C og proteiner løst på SDS-PAGE., Renset fibrinogen (12 µg) ble inkubert med 5 mM 12C-IPA i fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder 10% DMSO-for 1 t ved 22 °C i mørke og protein løst på SDS-PAGE.
SDS-PAGE gel som var farget med kolloidalt coomassie (Sigma) og fibrin(ogen) band excised, destained, tørket, inkubert med 40 mM ditiotreitol og washed14. Gelen skiver ble inkubert med 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotoper) for 1 h ved 22 °C i mørket for å alkylate disulfide bond Cys, vasket og tørket før fordøyelsen av proteiner med 12.,5 ng/µL av trypsin (Promega) i 25 mM NH4CO2 overnatting på 25 °C. Peptider var eluted fra skiver med 5% maursyre, 50% acetonitrile. Nano-Væske-kromatografi (nano-LC) ble utført ved hjelp av en Ultimate 3000 HPLC og automatiske prøvetakeren system (Dionex). Prøvene ble injisert inn i en fritless nano-LC-kolonnen (75 µm x ~12 cm) inneholder C18 media (1.9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) og varmes opp til 45 °C for hele går. Peptider var eluted ved bruk av en lineær gradient over 52 min, på en strømningsrate på 0,2 µL/min. Mobile fasen besto av En 0.,1% maursyre i H2O, mens mobile fase B besto av acetonitrile:H2O (8:2) med 0,1% maursyre. Overgangen ble: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B 37.5 min 80% B, 39 min 2% B og 52 min 2% B. Høy spenning (2000 V) ble brukt til et lavt volum tee (Upchurch Vitenskapelige) og kolonnen tips plassert ~0,5 cm fra oppvarmet kapillær (T = 275 °C) av et LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) masse spektrometer. Positive ioner ble generert ved electrospray ionisering og mass spectrometer drives i data avhengige kjøp modus., Full scan MS spektra ble ervervet (m/z 350-1750) av Orbitrap med en oppløsning på 30 000. De 15 mest tallrike ioner (>5000 teller) med kostnad stater ≥ +2 ble sekvensielt isolert og fragmentert innen lineær-ion-fellen ved hjelp av collisionally indusert dissosiasjon med en aktiverings-q = 0,25 og aktivering tid av 10 ms til en retningsgivende verdi av 30.000 ioner. M/z forholdstall som er valgt for MS/MS ble dynamisk ekskludert for 35 s. Ion Felle Zoom AGC-Mål: 3000.00. Ion Felle Full AGC-Mål: 30000.00. Ion Felle SIM-AGC-Mål: 10000.00. Ion Felle MSn AGC-Mål: 10000.00., Data ble analysert ved hjelp av Maskot Daemon (Versjon 2.5.0, Matrix Science) mot Swissprot database. Søk parametere var forløperen toleranse på 6 ppm og produkt-ion-toleranser ±0.6 Da, og iodoacetanilide derivat (Cys), iodoacetanilide 13C derivat (Cys), oksidasjon (Met) valgt som variabel endringer med full tryptic spalting av opp til tre ubesvarte splittelsene. Med listen av cystein-som inneholder peptider som er identifisert ved hjelp av Maskot, deres monoisotopic masse/kostnad-forhold (m/z) i +2, +3 og +4 er beregnet ved hjelp av MS-Produktet (Versjon v 6.2.2, Protein Prospector Verktøy)., Cys merket med 12C-IPA eller 13C-IPA har en masse på 133.05276 eller 139.07289, henholdsvis. Tretti Cys-som inneholder peptider ble analysert (Supplerende Tabellene 1 og 2). De ulike redox former av Cys rester ble kvantifisert fra den relative ion overflod av peptider som er merket med 12C-IPA og/eller 13C-IPA. For å beregne ion overflod av peptider, hentet ion chromatograms ble generert ved hjelp av XCalibur Qual Nettleser (v2.1.0; Thermo Scientific). Området ble beregnet ved hjelp av den automatiske topp detection-funksjon som er innebygd i programvaren., Dataene ble rutinemessig søkte etter peptider som inneholder gratis Cys thiols og disse ble ikke oppdaget, noe som indikerer at alkylering av høyeste Cys rester av 12C-IPA eller 13C-IPA ble fullført i proteinet.
Fibrinogen disulfide knyttet peptid analyse
Sunn donor plasma (0.7 mL) ble inkubert med polyklonale anti-fibrinogen antistoff-belagt Dynabeads på en roterende hjulet for 1 h ved 22 °C. perler ble samlet inn, overflødig plasma-aspirert og 0,3 mL 5 mM 12C-IPA i fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder 10% DMSO ble lagt til og inkubert for 1 h ved 22 °C i mørket., Deretter supernatanten ble aspirert, perlene inkubert med NuPAGE LDS eksempel buffer i 30 min ved 60 °C og supernatants løst på SDS-PAGE. Gel skiver inneholder fibrinogen ble vasket og tørket før fordøyelsen med 12 ng/µL trypsin (Promega) for 4 h ved 37 °C. Reaksjoner ble stoppet ved å legge til 5% (v/v) maursyre og peptider eluted fra gel skiver med 5% maursyre) og 50% (v/v) acetonitrile. Peptider i 0.,1% maursyre (endelig volum 12 µL) ble løst på en 35 cm × 75 µm C18 omvendt fase analytisk kolonnen ved hjelp av en 2-35% acetonitrile gradient over 22 min ved en vannføring på 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) og analysert på en LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer som beskrevet ovenfor. Disulfide knyttet peptider ble søkt mot menneskelig fibrinogen sekvens ved hjelp av Byonic analyse programvare (Versjon 3.9-7, Protein Beregninger) med en false discovery rate på 1%. Alle disulfide knyttet peptider ble manuelt kontrollert for korrektheten., Forløperen masse toleranse og fragment toleranse ble satt på 10 ppm og 0.6 Da, henholdsvis. Variabel endringer ble definert som oksidert Oppfylt, oksidert Cys (mono -, di-og tri) og glutathionylated Cys med full trypsin spalting av opp til tre ubesvarte splittelsene.
Fibrinogen funksjonalitet analysen
Renset fibrinogen (0,2 mL og 10 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 5 mM 12C-IPA for 1 h ved 22 °C i mørket for å alkylate gruppert Cys thiols i protein., Den ureagert IPA ble fjernet ved hjelp av en 7 kDa MWCO Zeba spinn desalting kolonne (Thermo Fisher). Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1,1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma) for 5 h ved 22 °C i et samlet volum på 0,2 mL i 1,5 mL mikrosentrifuge rør. Den fibrin polymerer ble pelletert ved 13 000 × g i 15 min, og konsentrasjonen av fibrinogen igjen i supernatanten ble målt. Funksjonaliteten er uttrykt i % av fibrinogen forbrukes i fibrin polymer-formasjonen.,
Fibrin polymer dannelse målt av lys-spredning
Renset fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma). Økningen i absorbans på 350 nm ble spilt inn hver 30 s i 15 min.
Fibrin polymer struktur målt ved skanning elektron mikroskopi (SEM)
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma) for 2 h på 22 °C i et samlet volum på 0,2 mL., Den fibrin polymerer var skylles to ganger med 0,1 M fosfat-buffer saltløsning (PBS), fast med 2,5% glutaraldehyde i PBS over natten ved 4 °C, post-fast med 1% OsO4 i PBS, dehydrert med gradert serien av etanol, og neste kritisk punkt tørket med en Leica EM CPD300. Prøvene ble frese belagt med 15 nm gull (K550X, Emitech) og avbildes med en Zeiss SigmaHD Feltet Utslipp Scanning Electron Microscope. Den SEM mikrografer ble registrert på 5 kV akselererende spenning og en arbeider avstand på 5 mm. Fiber diameter ble målt ved hjelp av ImageJ.,
Fibrin polymer gjennomtrengning analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma) for 2 h på 22 °C i et samlet volum på 0,2 mL i polypropylen kromatografi kolonner med en intern diameter 4,6 mm. Kolonnene ble overlappet med 0,8 mL av Hepes-buffer og fluks (J) ble beregnet ut fra vekten av dråper som percolated i 20 min., Den gjennomtrengning (Darcy) constant33 ble beregnet ut fra forholdet, Ks = JƞA/LP, hvor J er flux (cm3/s), ƞ er viskositeten av buffer (0.01 likevekt ved romtemperatur), A er tverrsnittet av blodpropp (0.17 cm2), L er lengden av blodpropp (1.1 cm), og P er hydrostatisk trykk (1,018,218 dyne/cm2).
Fibrin polymer komprimering analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma) for 16 h til 22 °C i et samlet volum på 0,5 mL i 1.,5 mL mikrosentrifuge rør som tidligere er belagt med 10 mg/mL PEG-20000 i vann og luft tørket. Den fibrin polymerer var sentrifugerte ved 13 000 × g i 5 til 2400 s og volumet av væske heves fra polymer målt.
Fibrinolysis analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1.8 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) ble inkubert med 1 enhet/mL av storfe trombin (Sigma) for 2 h på 22 °C i et samlet volum på 0,5 mL i 24-godt plater (15.6 mm diameter) for 2 h ved 22 °C. En delmengde av plasmin (5 µL av 0.,59 mikrometer) ble lagt til midten av brønner og platene inkubert for 18 timer ved 37 °C i et fuktig miljø. Lyse områder ble bestemt ut fra gjennomsnittet av to diametere måles i rett vinkel.
Kvantifisering av redox-statene α2-macroglobulin disulfide obligasjoner
Den 10 friske donor plasmaer er beskrevet ovenfor for analyse av fibrinogen ble ansatt for analyse av α2-macroglobulin ved bruk av de samme prosedyrene. Plasma (0.,7 mL) ble inkubert med polyklonale anti-α2-macroglobulin antistoff (Dako, Katt Q0102, Mye 20068567)-belagt Dynabeads (Life Technologies) på en roterende hjulet for 1 h ved 22 °C. perler ble samlet inn, overflødig plasma-aspirert, og inkubert i 0.3 mL 5 mM 12C-IPA i fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder 10% DMSO-for 1 t ved 22 °C i mørket for å alkylate gruppert Cys thiols i proteiner. Den supernatants var aspirert, og perlene inkubert med NuPAGE LDS eksempel buffer (Life Technologies) som inneholder ytterligere 5 mM 12C-IPA i 30 min ved 60 °C. supernatants ble løst på SDS-PAGE., SDS-PAGE gel som var farget med kolloidalt coomassie (Sigma) og α2-macroglobulin band excised, destained, tørket, inkubert med 40 mM ditiotreitol og washed14. Gelen skiver ble inkubert med 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotoper) for 1 h ved 22 °C i mørket for å alkylate disulfide bond Cys, vasket og tørket før fordøyelsen av proteiner med 12,5 ng/µl av trypsin (Promega) i 25 mM NH4CO2 overnatting på 25 °C. Peptider var eluted fra skiver med 5% maursyre, 50% acetonitrile., Væske-kromatografi, mass spectrometry og data-analyse ble utført som beskrevet for fibrinogen34. 17 Cys-som inneholder peptider ble analysert (Supplerende Tabellene 2 og 4). De ulike redox former av Cys rester ble kvantifisert fra den relative ion overflod av peptider som er merket med 12C-IPA og/eller 13C-IPA.
Rapportering oppsummering
Ytterligere informasjon om forskning design er tilgjengelig i Nature Research Rapportering Oppsummering knyttet til denne artikkelen.