Etableringen av et contour plot direkte fra eksperimentelle data krever bruk av en mulig høy gjennomstrømning metode og et betydelig antall prøver. Analysen må derfor være egnet for bruk i en 96-brønns plate design., Den generelle fordeler av dette miniatyrisering fra én reaksjon rør til 96-brønns platene har allerede blitt vist for DNSA og andre kolorimetrisk analyser . Alle analyser som er brukt i denne studien var egnet for 96-brønns plate-format. For å produsere en contour plot, enzym og substrat blandinger ble inkubert ved åtte forskjellige pH-verdier. De åtte pH-nivå ble inkubert ved 12 forskjellige temperaturer ved hjelp av en gradient PCR-cycler, noe som resulterer i 96 unike reaksjon forhold. En plate reader ble brukt for å innhente data., Resultatene ble forvandlet til relativ aktiviteter med høyest aktivitet på hver plate er satt til 100%. Målingen ble utført i triplikat og den gjennomsnittlige verdier ble senere omgjort til et contour tomt ved hjelp av SigmaPlot, som beskrevet i materialer og metoder delen. Aktiviteten (z-aksen) er representert som farge fra lilla til rødt i stedet for et vanlig aksen for å forbedre visning av contour plot.,
Buffer-system
En forutsetning for pålitelig bestemmelse av pH og temperatur optima er en stabil buffer system som er egnet angående enzym aktivitet og nesten bestandig til en pH-shift med økende temperatur. Alternativt, vil denne effekten kunne bli vurdert i contour plot. Påvirkning av temperaturen på pKa av buffere og dermed pH er et faktum som bør vurderes, spesielt for alkaliske buffere som Tris ., Som en forutsetning for analysen, alle pH-variasjoner av våre citrate–fosfat buffer systemet ble testet for endring i pH mellom 35 °C og 80 °C (se Ekstra fil 4). Alle buffere viser en svak nedgang i pH med stigende temperatur, med buffere ved høyere pH-verdier viser høyere avvik. Temperaturen avhengighet øker med mengden av fosfat, som korrelerer med temperaturen koeffisienter av fosfat (− 0.0028) og citrate (0)., Siden temperaturen avhenger av pH-variasjoner av alle buffere var bare mindre, kunne de bli neglisjert i utarbeidelsen av kontur tomter innenfor rekkevidde av verdier som er brukt her. Likevel, hvis en annen buffer system med en høyere temperatur koeffisient bør utnyttes, det er lett mulig å tilpasse contour tomt for endring i pH ved å tilordne hver buffer en individuell pH ved hver temperatur., Disse verdier er enten eksperimentelt bestemmes som beskrevet i de respektive materialer og metode seksjon eller avledet fra temperaturen koeffisienter og kan følgelig brukes til å tilpasse x-aksen (pH) i gitt Sigmaplot fil.
Aktivitet utvalg besluttsomhet for Cel8A
En oversikt over de forskjellige enzymer, underlag, og analyser som brukes i denne studien for etableringen av de respektive kontur tomter er gitt i Tabell 1.,
Cel8A er en cellulase, mer spesifikt en endo-glucanase, fra C. thermocellum og var den første enzymet av glycoside hydrolase familie 8 med et løst krystallstruktur . I denne studien, enzymet ble inkubert med BBG å validere vår foreslåtte metode å bruke DNSA analysen. Cel8A har blitt rapportert til å ha sin optimal temperatur på 75 °C og pH-optimum mellom 5.5 og 6.5 ., Disse verdiene er i samsvar med resultatene av våre contour tomt som de er i regionen > 90% aktivitet (Fig. 1). Våre contour plot, viser imidlertid at enzymet er svært aktive under en rekke forskjellige forhold. Enzymet gjør utstilling akseptabelt aktiviteter ved lavere pH-verdier da mellom 60 °C og 65 °C og utfører også med mer enn 60% av sin maksimale aktivitet ved pH-verdier under 4,5. Vår metode gir hjelp av visualisere slike effekter og evaluering av et enzym som er ytelse på noe tidspunkt i løpet av de testede parametre på et øyeblikk.,
Contour tomt på Cel8A bruke DNSA analysen med bygg-β-glukan som substrat
for Å teste om metoden er egnet for ulike hydrolase analyse metoder, vi produserte en contour tomt ved hjelp av Cel8A med Azo-CM-cellulose som substrat og de respektive analysen (Fig. 2). Plottet viser lignende optima ved 75 °C og pH 5,5. Men, bruk av Azo-CM-cellulose som substrat resulterte i en litt mindre aktivitet på området., Mindre forskjeller mellom de to analysene kan være på grunn av ulike strukturer og sammenhengen typer av både underlag, og dermed ulik i sin bindende egenskaper til enzymet. Azo-CM-cellulose er en ikke-naturlig substrat med tilsatt fargestoff grupper, som kunne legge ytterligere til denne effekten. Ved hjelp av Cel8A, kunne vi vise at vår metode gir gyldige data og er egnet for bruk i to forskjellige etablert analyser for hydrolases: DNSA og Azo-CM-cellulose.
Contour tomt på Cel8A bruk av Azo-CM-cellulose
Aktivitet utvalg besluttsomhet for Celluclast®
I tillegg til en enkelt enzym, et enzym blandingen ble studert. Celluclast® er et mye brukt for kommersielle cellulase produkt hentet fra Trichoderma reesei. Det består for det meste av cellobiohydrolases og endo-1,4-beta-glucanases, men har også xylanases og minst en β-xylosidase . Produktmanualen sier at den optimale aktiviteter er mellom 50 °C og 60 °C og pH-4.,5 og 6.0 . I dette arbeidet, må vi først produsert en contour tomt for Celluclast® med BBG som substrat med DNSA metode (Fig. 3). Den BBG contour plot ble verifisert ved hjelp av en standard temperatur-kurve (Fig. 4). Resultatene av temperatur kurve ved pH 5,5 er i samsvar med resultatene av contour plot, som viser det samme utvalget av aktivitet. Imidlertid, måling av separate kurver er utilstrekkelig for å beskrive aktiviteten av Celluclast® på BBG. Omfanget av pH i som enzymet blandingen viser høy aktivitet er sterkt temperaturavhengige., Jo høyere temperatur, jo lavere pH må være for å oppnå en høy aktivitet. Rundt 45 °C, Celluclast® er svært aktive (> 60%) opp til en pH-verdi på 6,5, mens på 65 °C, det er svært aktive bare opp til en pH 5,0. Beskrive aktiviteten med to separate kurver er derfor strengt avhengig av verdien som er valgt som statisk parameter. Temperatur grafer, for eksempel de som ble tatt på de to ytterpunktene av det fastsatte pH-område (4.5 og 6.0) bør gi svært ulike resultater. Det samme gjelder for pH grafer tatt ved forskjellige temperaturer., For å gjøre denne effekten tydelig, vi produsert standard pH grafer på 45 °C-55 °C, og 65 °C (Fig. 5). Disse tre pH kurver viser at, med økende temperatur, pH grensen for høy aktivitet skifter til surere pH-verdier. De tre kurver og dermed kontrollere resultatene sett i contour plot. Videre viser de begrensningene av vanlig separat aktivitet vilje, som i hvert fall for Celluclast® er, i tilfelle av pH kurver, avhenger av valgt temperatur., Bruk av våre contour plot metoden omgår dette problemet helt, ved å måle effekten av temperatur og pH i ett trinn.
Contour tomt på Celluclast® ved hjelp av DNSA analysen med bygg-β-glukan som substrat
Konvensjonelle temperatur optimal fastsettelse av Celluclast® ved pH 5.0., Temperaturen optimale av Celluclast® på bygg-β-glukan ble bestemt ved pH 5.0. Den konvensjonelle tilnærmingen viser den maksimale aktivitet rundt 55 °C og er i samsvar med resultater sett i tilhørende contour plot
Konvensjonelle pH optimum fastsettelse av Celluclast® på tre temperaturer. PH optimum av Celluclast® på bygg-β-glukan var fast bestemt på 45 °C-55 °C, og 65 °C., Ved lavere temperaturer, enzymet kan tolerere høyere pH-verdier. Dette er i samsvar med tilhørende contour plot og viser sterk påvirkning av den valgte faste parameter når du skal bestemme pH eller temperatur optimal separat
aktiviteten utvalg av Celluclast® på arabinoxylan (AX) (Fig. 6) skiller seg fra det med BBG som substrat. Aktiviteten er betydelig forskjøvet mot lave temperaturer, med ingen høy aktiviteter observert over 60 °C., Som Celluclast® er en blanding av flere enzymer, det er mest sannsynlig at disse forskjellige enzymer har forskjellige egenskaper. Men aktiviteten mønsteret er omtrent som for BBG, for eksempel ved pH 4.5, enzymet blandingen er svært aktiv opp til nesten 60 °C, mens det ved pH 6,5, det er bare svært aktiv opp til 50 °C. I litteraturen, er de optimale av Celluclast® på hvete løselig AX ble bestemt av en respons overflate modell (RSM) og funnet å være rundt pH 4.4 og 39 °C ., Våre contour plot viser høyeste aktivitet i samme temperaturområde og på en litt høyere pH-verdi, som fortsatt er innenfor den optimale bestemt av RSM. Mens det optimale er nesten den samme for begge metoder, vår contour plot påfallende viser den nøyaktige aktivitet av Celluclast® på AX innenfor hele spekteret av det testet tilstander og viser en mer detaljert disposisjon enn RSM. Med våre kontur tomter Celluclast® på BBG og AX, kunne vi vise at enzym komplekse blandinger som kan analyseres med den foreslåtte metoden.
Contour tomt på Celluclast® ved hjelp av DNSA analysen med arabinoxylan som substrat
for Å vise ytterligere allsidigheten av våre aktivitet utvalg besluttsomhet, vi evaluert bruken med ekstra underlag og analyser. Aktiviteten av Celluclast® på p-NP-β-d-glucopyranoside ble testet, og konturen tomten er vist i Fig. 7. Høy aktivitet på dette underlaget er begrenset til et ganske smalt område mellom pH 4.0 5.5 og 55 °C til 70 °C., Dette tyder på at bare en eller et par enzymer i Celluclast® enzym blanding sannsynligvis viser aktivitet mot p-NP-β-d-glucopyranoside. p-NP glykosider kan brukes som underlag for utarbeidelse av kontur tomter. Imidlertid, ikke alle p-NP glykosider er egnet underlag i analysen, som flere av dem viser høy bakgrunn på grunn av ustabilitet (se Ekstra fil 5), spesielt ved høye temperaturer er kombinert med høye pH-verdier.
Contour tomt på Celluclast® ved hjelp av p-NP-β-d-glucopyranoside
for Å teste programmet med vår metode på en naturlig biomasse eksempel, vi valgte å bruke et sugerør-basert underlaget. Frigjøring av glukose ved Celluclast® ble oppdaget ved hjelp av den kommersielle d-glukose HK-analysen (Megazyme). Den viktigste komponenten i celleveggen av halm er cellulose , som er den største kilden til enzymatically frigjort glukose. Den contour plot (Fig., 8), derfor overveiende viser aktiviteten av Celluclast® på krystallinsk cellulose, som er gjenstridige mot enzymatisk nedbrytning . Høyest utslipp av glukose ble observert på omtrent pH 4.0 5.5 og 40 °C til 60 °C. serien med høy aktivitet er derfor mindre bredt enn fastsatt for BBG, som bør tas i betraktning for en prosess som i hovedsak tok sikte på å bryte ned cellulose., Med bruk av d-glukose HK og p-NP-β-d-glucopyranoside som alternative analyser, kan vi demonstrere tilpasning av vår metode til totalt fire ulike og ofte brukt glycoside hydrolase analyser. Bruk av halm viste at vår metode er også egnet for naturlig underlag av industriell relevans, og kan brukes til evaluering av komplekse prosesser, og underlag. Celluclast® viser varierende aktivitet profiler på forskjellige underlag., Samlet for alle metoder, det er derfor avgjørende for å bestemme pH og temperatur data av et enzym med substrat av interesse.
Contour tomt på Celluclast® ved hjelp av d-glukose HK-analysen med en halm-basert naturlig substrat
Betraktninger når du bruker metoden
Når en contour plot er produsert med den foreslåtte metoden, det finnes flere hensyn som bør tas i betraktning., Underlaget må være stabilt og målt bakgrunn reproduserbar over en komplett spekter av forhold i 96-brønns plate. Dette er en forutsetning, fordi underlaget kontroll må trekkes fra alle verdier før omregningen i forhold aktiviteter, men kan ikke være direkte målt på plate for hver av de 96 forhold. Flere p-NP glycoside underlag, for eksempel, kan ikke brukes, siden de viser en svært temperatur – og pH-avhengig av bakgrunn. Veldig presis pipettering er nødvendig for å gi et akseptabelt nivå av standardavvik fra triplicates., Bruk av 96-hode-og 8-kanals pipetter er sterkt anbefalt som de i betydelig grad forbedre nøyaktigheten og akselerere prosedyren. Videre, plate-leser og gradient PCR-cycler er tekniske krav for å utføre metoden på riktig måte. Temperaturen varierer i hvor metoden kan utføres kan tilpasses i samsvar med de tekniske egenskaper for gradient PCR-cycler, som er vanligvis begrenset til 30 °C, eller 40 °C og kan ofte ikke ta med verdier under 20 °C., Vi omdannet direkte absorbansen i forhold aktivitet av et enzym, fordi verdiene er alle på en lineær kalibreringskurven (data ikke vist). Hvis det ikke er tilfelle, men aktiviteten må beregnes først, for eksempel i U/mg, og disse verdiene kan deretter brukes til å produsere contour plot. Når du ønsker å produsere en contour tomt for et enzym som er sterkt avhengig divalent metall-ioner, en annen buffer system har til å bli brukt, siden citrate–fosfat-basert buffere de komplekse ioner.,
Mens RSM tilnærminger er et udiskutabelt kraftig verktøy for å vurdere komplekse sammenhenger, for eksempel ulike variabler som påvirker flere faktorer, for å fastslå effekten av bare pH og temperatur på aktiviteten ikke er for komplekse til å bli oppnådd ved direkte måling. Fastsettelse av riktig grensen verdier av modell kan ta flere tilnærminger og kan påvirke den resulterende modellen. RSM-modellen er avledet fra bare et lite antall målinger rundt det sentrale punktet i enzym aktivitet og nøyaktighet mot den faktiske eksperimentelle verdier kontrolleres etterpå., Den totale oppløsningen av RSM er derfor lavere enn det som oppnås med vår metode, noe som gjør det vanskelig å se aktivitet effekter som vist for Celluclast® ved høyere temperaturer og/eller pH-verdier. Vår metode ikke krever evne til å designe komplekse statistiske modeller og kan utføres med minimal, og relativt standard tekniske krav. En ulempe både vår metode og RSM dele er at direkte visualisering av standard avvik innen de tre-dimensjonale plottet er ikke mulig., Men, vår metode tillater beregning av standardavvik for hvert enkelt datapunkt. De fleste RSM modeller bestemme standardavvik for hele modellen bare fra data om sentrale data punktet i modellen, mens den andre punkter er kun målt én gang . Standard avvik er naturlig nok høyere i randsonen av et enzym aktivitet og illustrere en sterk innvirkning på aktiviteten innen en liten endring av betingelser. Rundt optimal og i områder med ingen eller lav aktivitet, avvik er vesentlig lavere., Siden den foreslåtte metoden resulterer i en full fakultet datasettet, ville det være mulig å beregne en statistisk modell hvis det er nødvendig for videre analyse. Avledet statistisk modell ville base direkte på eksperimentelle data, men er et ekstra trinn som ikke bør være nødvendig for vanlige applikasjoner av metoden.
I sammendraget, enkel vurdering av et enzym eller en enzym blanding egnethet for en kombinasjon av prosessen parametrene er av avgjørende betydning ved utforming av bioteknologiske prosesser på enten laboratorium eller fullskala., Temperatur og pH er to av de viktigste prosessen faktorer som påvirker enzym aktivitet. Konvensjonelle tilnærminger for å teste effekten av disse faktorene på enzymer som er basert på antagelsen om at det er en to-dimensjonal korrelasjon mellom temperatur og aktivitet, samt pH og aktivitet. I kontrast, nye tilnærminger bestemme forholdet i tre-dimensjonale saken, men er statistikk-basert, komplekse til å designe og deres nøyaktighet til faktiske data, kan variere., Metoden ble introdusert her på den annen side gir rask og enkel beregning av effekten av temperatur og pH har på enzym-aktivitet samtidig med 96-bra plater, multikanal pipetter, og en gradient PCR-cycler. Med denne grunnleggende teknisk utstyr, det er mulig å produsere kontur tomter av pH, temperatur og aktivitet som er direkte basert på eksperimentelle data. Metoden ble testet for flere utbredt glycoside hydrolase analyser så vel som modell og komplekse underlag.