Vekst og næringsopptak dynamics av Ochromonas sp., stamme BG-1
Phagotrophy av phototrophic flagellates antas å gi betydelige økologiske fordeler på alger som viser virkemåten (Flynn og Mitra, 2009), men det vises også til å være begrensninger (selv om det i stor grad uncharacterized) for å gjennomføre blandet ernæring samtidig i en enkelt celle (Raven, 1997). Disse begrensninger kan innebære at kostnadene eller ulempene for å opprettholde dual mobil apparater (i forhold til spesialiserte konkurrenter), eller kanskje til og cross-talk mellom anabolske og katabolske biokjemiske mekanismer som narre utførelsen av både aktiviteter samtidig., Dessverre er det nesten ingen kvantitativ informasjon om kostnader og nytte av mixotrophic atferd, eller om både prosesser utføres i rekkefølge eller samtidig med disse artene. Temporal oppdeling kan være en mekanisme for å opprettholde både evner i liten celler (riktignok å sette en prosess «på vent» til enhver tid)., Vurderingen av om både atferd skjer samtidig, bestemte fysiologiske nytte(s) for heterotrophic ernæring i mixotrophic alger, og responsen av denne virkemåten til abiotiske og biotiske variabler er aspekter av mixotrophic næring som har vært vanskelig å etablere ved hjelp av tradisjonelle tilnærminger og metoder.
Vi studerte mixotrophic chrysophyte Ochromonas sp., belastning BG-1 fordi det kan dyrkes i axenic kultur (bakterier-free) og det har tidligere blitt rapportert å være en overveiende heterotrophic organisme som oppnår høy vekst bare i nærvær av bakterier (Sanders et al., 2001). Vekst i axenic kultur forhindret potensielt kompliserende biologiske interaksjoner og elementær flyter som følge av aktiviteter av andre levende mikroorganismer i kulturer, og dermed muliggjør en sammenligning mellom nanoSIMS og bulk IRMS målinger og en bedre forståelse av den spesifikke kilder av karbon og nitrogen brukes for vekst av alga.,
i Tillegg, bruk av en enkelt uorganiske kilde til nitrogen forenklet våre eksperimentelle design, slik at den eneste kilder til nitrogen i medium var ammonium eller HKB. Alger generelt har mekanismer for opptak og bearbeiding av både ammonium og nitrat, men transcriptomic data tyder på at noen chrysophytes, inkludert Ochromonas sp. belastning BG-1, kan være manglende genetisk evne til nitrat assimilering (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Videre, MES buffer ble ikke lagt til medium i våre eksperimenter fordi dette kunne ha gitt en alternativ kilde til nitrogen. MES kan også ha utgjort en kilde til organisk karbon, for alga (Sanders et al., 2001), og eliminering sin sørget for at det bare kilder av karbon i medium var enten bicarbonate eller HKB. Transcriptomic analyse fra eksperimenter utført på samme måte som de som er presentert i dette manuskriptet viser at den fotosyntetiske maskiner av Ochromonas sp. belastning BG-1 er uttrykt og oppregulert i nærvær av lys (Lie et al., 2017)., Dette forenklet tilnærming, kombinert med stabil isotop merking, tillot oss å avgjøre hvilken kilde(s) av nitrogen og karbon ble brukt for vekst av alga.
Betydelig vekst av Ochromonas i denne studien ble oppnådd bare mens HKB var rikt som byttedyr (Figur 1a). Chl en dynamikk i kultur også reflektert høy vekst priser på grunn av beiting på HKB, som konsentrasjonen av Chl en celle−1 redusert med en størrelsesorden i løpet av de første 48 timers inkubering for kulturer vokst i lyset, så vel som i kontinuerlig mørke (Figur 1d)., Disse endringene i mobilnettet klorofyll kan være knyttet til en fortynning av Chl en inne i cellene på grunn av den høye veksten av alga (Hansen et al., 2000), slik at reduksjon av Chl en celle−1 var en konsekvens av raskt økende priser på alga, og ikke en direkte reduksjon av klorofyll biosyntese pris. Likevel, det er også mulig at det ikke var noen regulering av klorofyll biosyntese når HKB var tilstede som transcriptomic analyse på dette alga foreslår upregulation av gener knyttet til klorofyll syntese i nærvær av lys når HKB var utarmet (Lie et al., 2017)., I alle fall, disse observasjonene er i overensstemmelse med tidligere studier av Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) som observeres en godt utviklet heterotrophic evne, noe som tyder på at utslippene av fiksering og kanskje andre cellulære strukturer og prosesser som er involvert i fotosyntesen reduseres når det vokser mixotrophically, som observert for noen andre alger (Wan et al., 2011).
Oppløst ammonium, samt fosfat, samlet i Ochromonas kulturer i løpet av de første 48 h av eksperimenter, når HKB var aktivt beitet (Figur 2)., Dette resultatet indikerer at overflødig nitrogen og fosfor fra beitet HKB var skilles ut av alga. Masse balanse beregninger basert på endringer i byttedyr/alge abundances og deres cellulære nitrogen innholdet indikert at opp til 50% av nitrogen som finnes i fortært HKB ble assimilert av alga, mens en betydelig mengde av overflødig nitrogen ble utgitt først og fremst som ammonium i løpet av perioden aktive bakteriell beite (Figur 2)., Disse verdiene for nitrogen assimilering (og utskillelse) er i samsvar med assimilering effektiviteten av heterotrophic protists av lignende størrelse (Taylor, 1982; Caron og Goldman, 1990), i samsvar med den konklusjon at Ochromonas vokste hovedsakelig som en heterotroph når byttedyr var rikelig. Videre, transcriptomic analyser har vist at ulike ammonium transportører er uttrykt av Ochromonas sp. belastning BG-1 som vokser på HKB i forhold til vekst etter bakterier har blitt beitet til svært lave abundances (Lie et al., 2017)., Det synes derfor som transportører for eksport av ammonium ut av cellen kan være annerledes enn de som brukes for ammonium opptak, som har blitt observert for andre organismer (Shnaiderman et al., 2013).
det er Interessant konsentrasjoner av ammonium, men ikke fosfat, gikk ned i medium når HKB hadde blitt fjernet av beiting (som er etter 48 t; Figur 2) når Ochromonas var vokst i lyset., Dette resultatet synes å indikere at alga aktivt tok opp ammonium (men ikke fosfat) fra middels når bakterier var ikke lenger er tilgjengelige, og fotosyntesen ble indusert (Figur 1d). I kontrast, både ammonium og fosfat i kulturer som dyrkes i mørke fortsatte å stige gjennom hele eksperimentet (stiplede linjer i Figur 2). Ingen betydelig netto knyttet til befolkningsvekst skjedde følgende uttømming av byttedyr selv i lyset, og forklaringen for todeling i opptaket av disse to elementene er uklart., Vi spekulerer i at ammonium ble tatt opp fordi det var tvingende nødvendig for å gjenoppbygge den fotosyntetiske maskiner av cellen.
Den fortsatte utseende av fosfat i kultur medium i løpet av den senere del av eksperimenter kontraster med studier av noen andre Ochromonas arter som har rapportert en opptaket av fosfat når alga, er økende autotrophically (Rothhaupt, 1996)., Mangel på fosfat opptak av belastning BG-1 kan tyde på at dette Ochromonas var ute av stand til effektivt fosfat opptak (som også kan forklare, i en del, de fattige phototrophic vekst kapasitet i denne stammen), eller at fosfor var ikke nødvendig i store mengder for mobil omorganisering forbundet med endringen til phototrophic vekst, og derfor er resultatene ikke ble stimulert av å endre phototrophy., Det er lite sannsynlig at fortsatt økning i konsentrasjonen av fosfat var på grunn av dekomponering av oppløst organisk fosfor stoffer i medium fordi kulturene hadde ingen levende bakterier.
Slutninger fra stabile isotop sondering eksperimenter
Stabil isotop analyser (nanoSIMS og bulk elementær analyse-IRMS) viste at både uorganisk (13C-bikarbonat og 15N-ammonium) underlag og 13C/15N-merket HKB ble assimilert av Ochromonas, bidra til 15N og 13C mobil berikelse etter 48 timers inkubering (Figur 4)., Men omfanget av berikelse av uorganiske substrater eller HKB indikert at de i løpet av mixotrophic vekst, er den primære kilder av karbon og nitrogen var avledet fra phagotrophy. Isotopisk masse balanse indikert at 88-95% av nitrogen og 84-99% av karbon ble hentet fra HKB når Ochromonas vokste mixotrophically i lyset. En berikelse av 13C ble observert i alger dyrket i lys sammenlignet med mørke (Eksperiment 1 vs Eksperiment 3) når 13C-bikarbonat var tilgjengelig (Figur 4)., Men den beregnede bidrag av fotosyntetiske karbon fiksering var bare 1-10% av assimilert karbon i biomasse. Den effektivisering av nitrogen inkorporering fra byttedyr observert i lys forhold til kontinuerlig mørke (Figur 3; Eksperimenter 1, 2 vs Eksperiment 3) tyder på at lyset spilte en rolle, om enn en liten en, i phagotrophic effektiviteten av alga., Derfor, til tross for mulige reduksjoner i den fotosyntetiske maskiner av Ochromonas voksende phagotrophically på HKB (som dokumentert av lave celle kvoter av Chl a; Figur 1d), lys gjorde har en liten og positiv innvirkning på knyttet til ernæring. Fordi mengden av karbon løst ved fotosyntesen representert en liten brøkdel av karbon assimilert av alga når det vokser på HKB, vi spekulerer i at den fotosyntetiske apparater kan være å gi energi snarere enn karbon for cellemateriale, som det har vært hypotetiske for Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
Vår isotopisk masse balanse beregninger har to begrensninger. For det første kan vi ikke kontrollere pH utviklingen innenfor kulturer, noe som ville ha gitt bedre innsikt på karbonat likevekt som kan ha blitt berørt av respirasjon og karbon fiksering, og utveksling med atmosfæren. Som sådan, er vårt anslag basert på eksperimenter ved hjelp av merket uorganisk karbon kan ha undervurdert mengden av uorganisk karbon løst av Ochromonas sp. BG-1 (1% i henhold til isotopisk masse balanse)., I alle fall, eksperiment ved hjelp av merket HKB ikke burde ha blitt påvirket av dette forbeholdet, og anslaget på 10% av karbon som stammer fra uorganisk substrat er trolig realistisk. For det andre, Ochromonas er ansett som en ineffektiv karbon fixer på grunn av manglende karbon konsentrasjon mekanismer (Maberly et al. 2009) som øker CO2-konsentrasjonen via transport av CO2 og/eller bikarbonat til enzymet RubisCO (Raven et al., 2008). På den annen side, transcriptomic analyser har vist at den fotosyntetiske maskiner av belastning BG-1 er funksjonelle (Lie et al.,, 2017), og våre eksperimenter ved hjelp av merket bicarbonate viste en betydelig berikelse av 13C brøk overflod i Ochromonas (figur 4 og 5), og derfor Ochromonas sp. belastning BG-1 har en viss evne til å bruke uorganisk karbon, om enn inefficiently.
Likevel, den sterke heterotrophic aktivitet av Ochromonas mens vokser mixotrophically er sannsynlig å øke den intracellulære CO2-bassenget, så vel som dens forandring. Som en tommelfingerregel er det vurdert at heterotrophic protists assimilere 40% av inntatt organisk materiale, mens de slipper 30% og respire ytterligere 30% (Slede, 1989)., Basert på dette, er den totale mengden karbon utgitt av Ochromonas som CO2 under eksponentiell vekst kan være så høy som den totale bicarbonate lagt i begynnelsen av inkubasjon, som har konsekvenser for isotopisk massebalansen vi har presentert. Hvis vi antar at isotopically beriket CO2 stammer fra HKB åndedrett er tilgjengelig på samme nivå som oppløst uorganisk karbon, incubation utført med Ochromonas og merket HKB indikert at ~84% av karbon ble avledet fra HKB., Opp til 20% av assimilert karbon avledet fra HKB faktisk kunne svare til karbon som var utgangspunktet respired og deretter løst av Ochromonas. Hvis alt er riktig, åndedrett avledet fra phagotrophic aktivitet ville fungere som en karbon konsentrasjon mekanisme slags for denne Ochromonas. Mens den primære kilden av karbon for Ochromonas voksende mixotrophically ble avledet fra HKB, et ikke-ubetydelig beløp, kan ha blitt avledet fra åndedrett og deretter CO2-fiksering av bakterielle biomasse.,
Ochromonas flyttet sin metabolisme mot autotrophy når inkubert i lyset, men bare etter at det hadde utarmet den HKB i kulturer (≈ 48 h av vekst). Dette skiftet ble reflektert i bulk IRMS 13C brøk overflod for behandling ved hjelp av merket HKB der en reduksjon ble observert mellom 48 h og 145 h (Eksperiment 2 i Figur 5), som vitner om inkorporering av umerket karbon i alge-biomasse via lys prosesser. Chrysophytes er generelt ansett for å være dårlig autotrophic karbon fixers på grunn av dårlig karbon konsentrasjon mekanismer (Maberly et al., 2009)., Likevel, disse resultatene indikerer at det var en betydelig grad av uorganisk karbon assimilasjon. En sammenligning av kulturer vokst i lyset (Eksperiment 1 i Figur 5) og kontinuerlig mørke (Eksperiment 3 i Figur 5) viste at 15N brøk overflod av mørke kulturer ikke endret etter 95 h mens kulturer i lys fortsatte å berike i 15N, noe som indikerer at Ochromonas fortsatte å assimilere nitrogen for å opprettholde sin metabolisme når HKB var tomt., Disse resultatene var i samsvar med observert en nedgang i konsentrasjonen av ammonium i medium i løpet av denne perioden (Figur 3a), selv om det fortsatt utseende av fosfat i medium i løpet av denne perioden er uforklarlig.
Vi fått god generell avtale mellom bulk isotop målinger og nanoSIMS målinger for nitrogen, i samsvar med observasjoner i tidligere studier (Popa et al., 2007; Foreldreløse og Hus, 2009; Kopf et al., 2015; Figur 4c)., Men, mesteparten av målingene var noe lavere i form av brøk overflod verdier for karbon, spesielt for høyanriket prøvene (Figur 4d). Vi spekulerer i at forskjellene mellom nanoSIMS og bulk isotop målinger for karbon kan være knyttet til det faktum at nanoSIMS prøvene ble konservert med glutaraldehyde, mens prøver for bulk analyse ble det ikke. Fiksering har vist seg å påvirke mobil karbon (Musat et al., 2014), selv om vi kunne ha forventet dette for å fortynne 13C i nanoSIMS målinger i forhold til bulk verdier., En mer sannsynlig forklaring er at encellede målinger er ikke påvirket av mobilnettet rusk i kulturen som kan være mindre beriket. Mesteparten 13C-verdien kan bli utvannet av disse komponentene i forhold til nanoSIMS målinger, noe som tyder på at nanoSIMS data kan mer nøyaktig gjenspeile karbon -, nitrogen-opptak av alger. Imidlertid, celle til celle variasjon kan også ha bidratt til mindre forskjeller mellom bulk og nanoSIMS målinger.,
bruk av nanoSIMS i denne studien representerer sin første søknad mot studiet av karbon og næringsstoffer fluksene i en mixotrophic alga, og har gjort en bedre forståelse av karbon og energi kjøp av denne arten, og cellulær metabolisme. Våre funn utvide informasjon som er tilgjengelig fra tradisjonelle analyser av Ochromonas sp. belastning BG-1 vokst under ulike forhold av lys og byttedyr tilgjengelighet (Sanders et al., 2001), noe som bekrefter at de fleste av nitrogen og karbon som brukes for vekst er innhentet gjennom sin bakteriell byttedyr., Selv om resultatene ikke kan være direkte ekstrapolert til alle arter langs kontinuum av alger med annen mixotrophic strategier, vårt arbeid validerer bruk av stabil isotop sondering eksperimenter og nanoSIMS å bedre forstå den metabolske grunnlaget av mixotrophy i en art. Videre, det gir en tilnærming for å vurdere mixotrophic ernæring i jordprøver. Ochromonas sp. belastning BG-1 gitt en ideell modell for systemet for å sammenligne bulk isotop-analyser for å nanoSIMS fordi bakterier ble raskt fjernet av beite i løpet av de første 48 h av eksperimenter., Avtalen mellom disse to målingene viser at nanoSIMS nøyaktig fanget dynamics av karbon og næringsstoffer oppkjøp i denne mixotroph, og kan derfor være mer generelt brukes til å utforske mixotrophy i komplekse blandet samfunn der bulk tiltakene vil være tilstrekkelige til å fange opp disse dynamikkene. Denne og fremtidige detaljerte studier vil fortsette å gi forbedringer i vår forståelse av ernæring av mixotrophic alger.