창조의 윤곽을 줄거리에서 직접 실험 데이터의 사용을 필요로 가능한 높은 처리량 방법과 상당한 수의 샘플입니다. 분석실험은,그러므로,96 잘 판 디자인에 있는 사용을 위해 적당해야 합니다., 단일 반응 튜브에서 96-웰 플레이트에 이르기까지이 소형화의 일반적인 이점은 DNSA 및 기타 비색 분석법에 대해 이미 나타났습니다. 이 연구에서 사용 된 모든 분석법은 96-웰 플레이트 형식에 적합했습니다. 윤곽 플롯을 생성하기 위해,효소 및 기질 혼합물을 8 개의 상이한 pH 수준으로 배양 하였다. 그 8 개의 pH 수준은 구배 PCR 사이클러를 사용하여 12 개의 상이한 온도에서 배양되어 96 개의 독특한 반응 조건을 초래했다. 데이터를 얻기 위해 플레이트 리더가 사용되었습니다., 결과는 각 플레이트에서 가장 높은 활동이 100%로 설정된 상대 활동으로 변형되었습니다. 측정이 수행되었 세중과 평균값 이후로 변형 등고선도를 사용하여 SigmaPlot 에서 설명하는 자료와 방법을 섹션입니다. 활동(z 축)은 윤곽 플롯의보기를 향상시키기 위해 일반 축 대신 자주색에서 빨간색으로 색상으로 표시됩니다.,
버퍼시스템
하나의 전제 조건에 대한 신뢰할 수 있는 결정의 pH 및 온도 옵은 안정된 버퍼하는 시스템에 적합한 효소 활동 및 거의에 저항하는 pH 변화 온도 증가와 함께. 대안으로,이 효과는 등고선 플롯에서 고려 될 수있다. 완충액의 pka 및 이에 따른 ph 에 대한 온도의 영향은 특히 Tris 와 같은 알칼리성 완충액에 대해 고려되어야하는 사실이다., 으로 요구 사항에 대한 분석 결과,모든 pH 의 변형을 우리의 구연산 인산염 완충 시스템이 테스트의 변화에 대한 pH 사이 35°C 에서 80°C(추가 파일 4 회). 모든 버퍼쇼에서 약간 감소 pH 상승으로 온도와 버퍼에서 높은 pH 값을 보여주는 더 높은 편차를 계산하는 것이 좋습니다. 온도 의존성은 인산염(−0.0028)과 구연산염(0)의 온도 계수와 상관 관계가있는 인산염의 양에 따라 증가합니다., 때문에 온도 의존 pH 변화의 버퍼가 만들 수 있습 무시 컴파일에서의 윤곽을 플롯의 범위 내에서 값을 여기에서 사용됩니다. 그럼에도 불구하고,만일 다른 버퍼 시스템은 높은 온도 계수를 이용해야한다,그것은 쉽게 적응 가능한 윤곽을 줄거리의 변화에 대한 pH 할당하여 각 버퍼를 개별 pH 에서 각각 온도입니다., 이러한 값은 실험적으로 결정으로 설명에서 각각의 재료 및 방법 섹션 또는 파생에서 온도 계수 및 수 있습니다 다음 그에 따라야에 맞춰 사용 x-axis(pH)를 제공 Sigmaplot 파일입니다.
활동 범위를 결정에 대한 Cel8A
의 개요를 다른 효소,기질,그리고 분석 실험에서 사용되는 이 연구의 창조를 위해 각각의 윤곽을 플롯을 주어서 표 1.,
Cel8A 는 셀룰라아제,더 구체적으로 엔도-글루카나아제에서,C.thermocellum 고 처음 효소의 배당체 가수분해 가족 8 으로 해결 결정 구조입니다. 이 연구에서,효소는 DNSA 분석법을 사용하여 우리의 제안 된 방법을 검증하기 위해 BBG 로 배양되었다. Cel8A 는 75°C 에서의 온도 최적 및 5.5 와 6.5 사이의 ph 최적을 갖는 것으로보고되었습니다., 이러한 값에 따라 결과의 윤곽을 플롯으로 그들은 지역 내의>90%활동(Fig. 1). 그러나 우리의 윤곽 플롯은 효소가 다양한 조건의 넓은 범위에서 매우 활성임을 보여줍니다. 이 효소는 전시 허용되는 활동에서 낮은 pH 값을 60°C 에서 65°C 도 함께 수행의 60%이상의 최대한 활동을 때에 pH 값을 아래 4.5 입니다. 우리의 방법 방법을 제공합 시각화의 이러한 효과를 평가하는 효소의 성능에서 어떤 시점에서 테스트에서 매개 변수입니다.,
의 윤곽 그리 Cel8A 를 사용하 DNSA 분석 결과와 보리-β-글로기판
지 여부를 테스트하는 우리의 방법은 적합한 다양한 가수분해 효소 분석 방법은, 우리가 생산한 윤곽을 줄거리를 사용하여 Cel8A 와 Azo-CM-셀룰로오스로 기판과 각각의 분석 결과(그림. 2). 플롯은 75°C 와 ph5.5 에서 유사한 옵티마를 보여줍니다. 그러나,기질로서 아조-CM-셀룰로오스의 사용은 약간 더 작은 활성 범위를 초래했다., 사소한 차이 분석을 수 있으로 인해 서로 다른 구조 및 결합 형태의 두 기질,그로 인하여 다른 자신의 결착성하는 효소입니다. Azo-CM-셀룰로오스는이 효과에 더 추가 할 수있는 염료 그룹이 첨가 된 비 천연 기질입니다. 사용 Cel8A,우리는 우리의 방법을 제공하는 유효한 데이터를 사용하기에 적합한에 두 개의 서로 다른 설립한 분석 실험을 위한 hydrolases:DNSA 및 아조 CM-셀룰로오스이다.
의 윤곽 그리 Cel8A 를 사용하여 Azo-CM-셀룰로오스
활동 범위를 결정에 대한 Celluclast®
뿐만 아니라 효소,효소 혼합물을 공부한다. Celluclast®는 Trichoderma reesei 에서 파생된 널리 이용되는 상업적인 셀룰라아제 제품입니다. 그것은 주로 cellobiohydrolases 와 endo-1,4-β-glucanases 로 이루어져 있지만,또한 xylanases 와 적어도 하나의 β-xylosidase 를 특징으로합니다. 제품 설명서에는 최적의 활동이 50°c 와 60°c 와 pH4 사이라고 명시되어 있습니다.,5 및 6.0. 이 작업에서는 먼저 DNSA 방법을 사용하여 BBG 를 기질로 사용하여 Celluclast®용 윤곽 플롯을 제작했습니다(그림 1). 3). BBG 컨투어 플롯은 표준 온도 곡선에 의해 검증되었다(그림 2). 4). PH5.5 에서의 온도 곡선의 결과는 등고선 플롯의 결과에 따라 동일한 활동 범위를 나타냅니다. 그러나,별도의 곡선의 측정은 BBG 에 대한 Celluclast®의 활성을 설명하기에는 부적절합니다. 효소 혼합물이 높은 활성을 나타내는 ph 의 범위는 강하게 온도 의존적이다., 온도가 높을수록 높은 활성을 달성하기 위해 ph 가 낮아야합니다. 약 45°C,Celluclast®는 6.5 의 ph 까지 매우 활성(>60%)인 반면 65°C 에서는 5.0 의 ph 까지만 매우 활성입니다. 따라서 두 개의 개별 곡선으로 활동을 설명하는 것은 정적 매개 변수로 선택한 값에 엄격하게 의존합니다. 온도 그래프,예를 들어 명시된 pH 범위(4.5 및 6.0)의 두 극단에서 취한 그래프는 크게 다른 결과를 제공해야합니다. 동일은 다른 온도에서 촬영 pH 그래프에 대해 사실 보유하고 있습니다., 이 효과를 분명하게하기 위해 45°C,55°C 및 65°c 에서 표준 pH 그래프를 생성했습니다(그림 1). 5). 이 세 가지 pH 곡선은 온도가 증가함에 따라 높은 활성에 대한 pH 경계가보다 산성 pH 값으로 이동 함을 보여줍니다. 따라서 세 개의 곡선은 등고선 플롯에서 볼 수있는 결과를 확인합니다. 또한,그들은 쇼에 제한은 기존의 별도 활동을 결정하는 적어도에 대한 Celluclast®의 경우,pH 곡선에 따라 선택된 온도이다., 우리의 윤곽 플롯 방법의 사용은 한 단계에서 온도와 pH 의 영향을 측정함으로써이 문제를 완전히 우회합니다.
의 윤곽 그리 Celluclast®사용하여 DNSA 분석 결과와 보리-β-글로기판
Ph5.0 에서 Celluclast®의 기존 온도 최적 결정., 보리-β-글루칸에 대한 Celluclast®의 온도 최적은 ph5.0 에서 결정되었다. 기존의 접근을 보여줍니다 최대의 활동이 약 55°C 에 따라 결과를 볼 수 있에 해당하는 윤곽을 플롯.
3 가지 온도에서 Celluclast®의 기존 pH 최적 결정. 보리-β-글루칸에 대한 Celluclast®의 ph 최적은 45°C,55°C 및 65°C 에서 결정되었다., 더 낮은 온도에서 효소는 더 높은 pH 값을 견딜 수 있습니다. 이에 따라 해당하는 윤곽을 줄거리와 쇼의 강한 충격을 선택한 고정 매개변수를 결정할 때 또는 pH 온도 별도로 최적의
활동의 범위 Celluclast®에서비스(AX)(Fig. 6)는 기질로 BBG 를 가진 그것과 다릅니다. 활동은 60°C. 의 위 관찰된 높은 활동 없이 더 낮은 온도로 현저하게 이동됩니다., Celluclast®는 여러 효소의 혼합물이기 때문에 이러한 다른 효소가 다른 특성을 가질 가능성이 큽니다. 그러나,활동 패턴의 그것과 유사하 BBG;예를 들어,pH4.5,효소의 혼합물은 매우 활성까지 거의 60°C 는 반면,pH6.5,그것은 매우 활성까지 50°C. 에 문학,최적의 Celluclast®에 밀 녹 AX 었에 의해 결정된 반응 표면 모델(RSM)고 주위에 pH4.4 39°C., 우리의 윤곽을 줄거리를 보여줍 가장 높은 활동에서 동일한 온도 범위에서 약간 높은 pH,는 아직도 내에서 최적의 결정에 의해 RSM. 동적 최적은 거의 동일한 모두에 대한 방법을 우리의 윤곽을 플롯을 현저하게 보여주는 정확한 활동의 Celluclast®에 도끼에서는 전체 범위의 테스트 조건과 전시 더 자세한 처분보다 RSM. BBG 와 AX 에 celluclast®의 등고선 플롯을 사용하면 복잡한 효소 혼합물을 제안 된 방법으로 분석 할 수 있음을 보여줄 수 있습니다.
의 윤곽 그리 Celluclast®사용하여 DNSA 분석 결과 함께비로 기판
을 더 설명의 다양성과 우리의 활동 범위를 결정에,우리는 그것의 사용으로 추가적인 기판 및 분석 실험. P-NP-β-d-glucopyranoside 에 대한 Celluclast®의 활성을 시험하고 윤곽 플롯을도 2 에 나타내었다. 7. 이 기질상의 높은 활성은 ph4.0 내지 5.5 및 55℃내지 70℃사이의 다소 좁은 범위로 제한된다., 이것은 하나 또는 몇 가지 효소에 Celluclast®효소의 혼합물 아마의 활동을 보여 줍으로 p-NP-β-d-에 비해 표시. p-NP 배당체는 등고선 플롯의 제조를위한 기질로 사용될 수있다. 그러나,모든 p-NP glycosides 적합한 기판에서 분석 결과로,그들 중 몇 가지 보여 높은 배경으로 인해 불안정성(추가 파일의 5),특히 높은 온도 결합으로 높은 pH 값입니다.
의 윤곽 그리 Celluclast®사용하여 p-NP-β-d-에 비해 표시
응용 프로그램을 테스트하기 위해 우리의 방법에서는 자연적인 바이오매스 샘플 우리가 선택한 사용을 짚 기반 기판이다. Celluclast®에 의한 포도당의 해방은 상업용 d-포도당 HK 분석법(Megazyme)을 사용하여 검출되었습니다. 짚의 세포벽에있는 주성분은 효소 적으로 해방 된 포도당의 주요 공급원 인 셀룰로오스입니다. 등고선 플롯(그림 2)., 8),그러므로,우세하게 효소 분해로 재계산되는 결정질 셀룰로오스에 대한 Celluclast®의 활성을 나타낸다. 가장 높은 릴리스의 포도당에서 관찰 약 pH4.0 5.5 40°C~60°C 의 범위와 높은 활동이다,따라서 적은 광보다는 결정에 대한 BBG 는 고려되어야한 프로세스에 대한 주는 목적을 저하시킬 셀룰로오스이다., 의 사용으로 d-포도당 HK 및 p-NP-β-d-에 비해 표시 대안으로 분석,습을 보여줄 수 있는 적응성의 우리의 방법이 총 네 가지고 일반적으로 사용되는 배당체 가수분해 효소 분석. 의 사용을 짚으로 보이는 우리의 방법은 또한 적합한 자연한 기판의 산업 관련성에 대해 사용될 수 있의 평가는 복잡한 프로세스와 기판. Celluclast®는 다른 기질에서 다양한 활성 프로파일을 보여줍니다., 모든 방법에 대해 총체적으로,따라서 관심있는 기질을 가진 효소의 pH 및 온도 범위 데이터를 결정하는 것이 중요합니다.
의 윤곽 그리 Celluclast®사용하여 d-포도당 HK 분석 결과 빨대 기반의 자연한 기판
고려할 때 사용하는 방법
면 윤곽을 줄거리를 제공할 수 있었습니다 제안한 방법으로,거기에 몇 가지 사항을 고려해야 합니다 계정으로 가져옵니다., 기판은 안정적이어야하며 측정 된 배경은 96-웰 플레이트에서 조건의 전체 범위에 걸쳐 재현 가능해야합니다. 이것은 필수이기 때문에,기질 제어를 제외한 모든 값을하기 전에 변환을 상대적으로 활동할 수는 없습니다만 직접 측정에 격판덮개를 위한 각각의 96 조건입니다. 예를 들어,몇몇 p-NP 글리코 시드 기질은 고도의 온도 및 pH 의존성 배경을 보여주기 때문에 사용될 수 없다. 삼중에서 표준 편차의 허용 수준을 산출하기 위해서는 매우 정밀한 피펫팅이 필요하다., 96 헤드 및 8 채널 피펫의 사용은 정확도를 크게 향상시키고 절차를 가속화하므로 강력히 권장됩니다. 또한,플레이트 리더 및 그라디언트 PCR cycler 는 방법을 올바르게 실행하기위한 기술적 요구 사항입니다. 온도 범위에서는 이 방법이 될 수 있습을 수행할 수 있습에 따른 적응 기술의 속성을 기울 PCR 자전거 타는 사람은 일반적으로 30°C~40°C 할 수 없는 경우가 많 포함한 값이 20°C, 우리는 직접 변환 흡광도가 상대적으로 활동의 효소기 때문에 값은 모두에 선정 곡선(데이터시하지 않음). 는 경우가 아닌 경우,그러나,활동을 계산 첫째,예를 들어,U/mg,그리고 이러한 값을 사용하여 다음을 수행할 수 있습니다 생산하는 윤곽을 줄거리입니다. 고자 할 때를 생산하는 윤곽에 대한 줄거리는 효소를 강하게 의존에 divalent 금속이온,다른 버퍼 시스템을 사용해야 하므로,구연산 인산염-버퍼를 기반으로 복잡한 사람들 이온입니다.,
동안 RSM 접근 방식은 논의의 여지가 없는 강력한 도구를 평가하는 복잡한 관계,예를 들어,다양한 변수에 영향을 미치는 요인이 여러 개를 결정하는 효과만 pH 온도에서 활동은 너무 복잡하지 않습을 달성에 의해 직접 측정도 가능합니다. 모델의 올바른 테두리 값 결정은 여러 가지 접근법을 취할 수 있으며 결과 모델에 영향을 줄 수 있습니다. RSM 모델에서 파생된 소수의 측정이 주변의 중앙 지점 효소의 활성과 정확성을 향해 실제 실험 값을 테스트할 수 있습니다., 전체적인 해결책의 RSM,따라서보다 낮을 얻은 우리의 방법을 만드는것은 보기 어렵 활동을 효과로 표시되 Celluclast®높은 온도에서 그리고/또는 pH 값입니다. 우리의 방법을 필요로하지 않는 능력을 디자인하는 복잡한 통계적 모델을 수행 할 수 있습니다 최소화하고 상대적으로 표준 기술적 요구 사항입니다. 단점은 모두 우리의 방법과 RSM 공유하는 직접적인 시각화의 표준편차 이내 입체 음모가 가능하지 않습니다., 그러나 우리의 방법은 각 개별 데이터 포인트에 대한 표준 편차를 계산할 수있게합니다. 가장 RSM 모델을 결정하는 표준 편차에 대한 전체적인 모델에서만 데이터의 중앙 데이터 포인트는 모델의 동안,기타 데이터 포인트만을 측정한다. 표준 편차는 자연적으로 높은 국경에서의 효소의 활동과 설명에 강한 영향을 미칠 활동에서 약간의 변화의 조건입니다. 최적 주위 및 활동이 없거나 낮은 영역 내에서 편차가 현저히 낮습니다., 이 제안된 방법에서 결과 완전 요인 데이터 설정,그것이 가능한 것을 계산하는 통계적 모델이 필요하다면 비용에 대한 정보를 제공합니다. 파생 된 통계 모델은 실험 데이터에 직접적으로 기초 할 것이지만,방법의 표준 적용에는 필요하지 않아야하는 추가 단계입니다.
에서 요약,쉽게 평가하는 효소의 또는 효소 혼합물의 적합성에 대한 조합의 공정 매개 변수의 중요한 중요성을 디자인할 때는 생명 공학 프로세스 중 하나에서 실험실 또는 산업적 규모입니다., 온도와 pH 는 효소 활성에 영향을 미치는 가장 중요한 공정 인자 중 두 가지입니다. 기존의 접근 방식 테스트의 효과 요소들에서 효소는 가정에 기반을 두고 있는 두 차원 사이의 상관 관계는 온도 및 활동뿐만 아니라 pH 과 활동입니다. 반면,새로운 접근 방식의 관계를 결정에는 세 가지 차원의 문제이지만,그는 통계를 기반으로,복잡한 디자인과 그들의 정확한 실제 데이터 달라질 수 있습니다., 이 방법을 소개한 여기에서 다른 손으로는 빠르고 쉬운 결정은 효과 온도,pH 야에서 효소의 활동은 동시에 사용하여 96-well 플레이트,멀티 채널 피펫,그리고 그라데이션 PCR 자전거 타는 사람. 이 기본 기술 장비를 사용하면 실험 데이터를 직접 기반으로하는 pH,온도 및 활동의 등고선 플롯을 생성 할 수 있습니다. 이 방법은 테스트를 위한 여러 가지 광범위한 배당체 가수분해 효소 분석뿐만 아니라 모델을하고 복잡한 기판.피>