혈액 수집 및 처리를
모든 절차의 컬렉션을 포함하는 인간의 혈액에서는 건강한 지원자들에 따라 인간의 연구 윤리 위원회의 대학 시드니(승인 HREC2014/244)보로부터 얻은 모든 개인이다., 모든 절차의 컬렉션을 포함하는 인간의 혈액에서 ECMO 환자에 따른 알프레드 병원의 윤리,모나쉬대학교 상무위원회에 대한 연구에서는 인간(승인 388/13)보로부터 얻은 모든 개인이다. 모든 절차는 1983 년 헬싱키 선언에 따라 이루어졌습니다. 혈액 수집하여 방혈을 사용하여 21g 나비 바늘 텔 모 10 에서는 건강한 기부자에 의약품(네 남성,여섯 여성,22-58 세)., 첫 번째 5mL 의 피는 삭제를 피하기 위해 트롬빈 수 있는가 생성된 바늘 주위에 사이트에 삽입한 다음에 그려진 튜브를 포함하는 3.2%v/v 나트륨 시트르산. ECMO 지원을받은 단일 센터의 8 명의 환자(남성 4 명,여성 4 명,34-67 세)의 혈액을 ACD-a 튜브(BD Vacutainer)로 채취했습니다., 환자 ECMO 지원을 받 anti-응고 그리고/또는 반대로 혈소판에 따라 약에서 임상의 재량에 따라 또는 기관의 지침에는 환자는 일반적으로 시작에서 와파린,target international normalized ratio(INR)2-3 과 함께,브리징 헤파린 주입 및 아스피린 치료뿐만 아니라,디피 리다 몰에 대한 사람들은 높은 위험으로 간주되증에 대해 표시되지 않습니다. 플라즈마를 실온에서 20 분 동안 800×g 에서 2 회 원심 분리하여 제조 하였다., 어떤 경우에는 건강증 플라즈마 전단에서의 요금 2000s−1 또는 10000s−1for5min 실온에서 사용하 Kinexus pro+분자.
Hepatocyte 차례로 수집
인간의 간 암 세포 라인 HepG2(ATCC,HB-8065)교양에 DMEM,10%송아지 태아 혈청과 glutamax5%CO2 및 37°C. 세포 80~90%의 합류는 세척하였으로 인산염 완충제 염분,incubated for18h DMEM 없이 혈청에서 5%CO2 및 37°C 또는 저산소 챔버에서 1%O2,5%CO2 및 37°C, 컨디셔닝 된 배지를 수집(4×106 세포 당 1mL)하고 분비 된 피브리노겐을 하기에 설명 된대로 즉시 처리 하였다.
차례로 및 섬유소 분석 실험
라 샘플을 치료 또는 incubated 트롬빈 및/또는 섬유소 중합 억제제,GPRP(시그마). 섬유소에 준비되었 1mL 의 플라즈마에 의한의 50 단위의 소 트롬빈(시그마)및 10mM CaCl2 과 는 mgcl2 40 분에서 22°C 섬유소 중합체 수집되었을 사용하여 플라스틱 막대입니다., 한 실험에서 혈장(2mL)을 22°C 에서 40 분 동안 27 단위/mL 의 트롬빈 및 10mM CaCl2 및 MgCl2 로 배양하고 피브린 중합체를 플라스틱 막대 상에 수집하여 제거 하였다. 고갈 된 혈장을 27 단위/mL 의 트롬빈 및 새로운 피브린 중합체의 또 다른 aliquot 으로 배양하여 수집하고 제거 하였다. 킵의 플라즈마(0.2mL)샘플링 전과 후의 모두의 트롬빈,150μm 의 d-phenylalanyl-드 프 롤릴-히드 록-arginyl chloromethyl 케톤(PPACK,시그마)추가을 억제하는 활동 트롬빈과 샘플 배양 16 서 22°C, 이 차례로 콘텐츠 플라즈마의 샘플을 추정하였다를 수집하여 단백질에 polyclonal anti-차례로 항체 입히는 구슬(다음 섹션),을 해결하는 차례로에 SDS 페이지와 얼룩과 함께 콜로이드 Coomassie. 에서 또 다른 실험,플라즈마 incubated8mM GPRP(시그마)5min22°C 하기 전에 첨가 50units/mL 의 트롬빈 60min22°C 반응이 침묵과 150μm 의 PPACK10min22°C. 정화 fibrinogens 으로부터 격리 되었고 건강한 기증자 신선한 언 플라즈마에 의해 β-알라닌 precipitation32 또는 상업적으로 획득(Sigma F4883).,
의 정량화 redox 국의 차례로 및 섬유소 이황화 채권
Dynabeads(2 밀리그램,생명기술)었으로 코팅 16µg 의 polyclonal anti-차례로 항체(가 ダッコ 에서 집착할,고양이 A0080,많은 00015063)1mL 의 인산염 완충제 식염수에서 회전하는 휠에 대한 1 시간 22°C 와 과도체 제거 세척하여 세 번과 1mL 의 인산염 완충제 염. 혈장(0.7mL)또는 HepG2-컨디셔닝 된 배지(4.5mL)를 22℃에서 1 시간 동안 회전 휠 상에 2mg 의 코팅 된 비드로 배양 하였다., 비즈를 수집한 자석을 사용하여,과도한 플라즈마 흡입을 줄일 수량 및 종묘에서 0.3mL5mM12C-IPA 인산염 완충제 염분이 포함된 10%DMSO1 서 22°C 에 어둠을 alkylate 짝이 없는 Cys 티올과에서 단백질이다. 상청액을 흡인하고,60℃에서 30 분 동안 추가로 5mm12C-IPA 를 함유하는 nupage LDS 샘플 완충액(Life Technologies)으로 배양 한 비드를 상청액을 SDS-PAGE 에서 해결 하였다., 섬유소 폴리머를 생성되는 플라즈마에서 수집되었습니다 막대 플라스틱 및 즉각에 잠긴 1mL of5mM12C-IPA 인산염 완충제 염분이 포함된 10%DMSO1 서 22°C 습니다. 섬유 소 씻어 3 번과 인산염 완충제 염기 전에 용해 폴리머 in1mL of20mM 아세트산서 24 시간 22°C 이십 마이크로 리터의 솔루션 incubated NuPAGE LDS 샘플 버퍼(기술)포함 5mM12C-IPA30 분에서 60°C 과 단백질의 해결에 SDS-PAGE., 정제 된 피브리노겐(12μg)을 어둠 속에서 22°C 에서 1h 동안 10%DMSO 를 함유 한 인산염 완충 식염수에서 5mm12C-IPA 로 배양하고 SDS-PAGE 에서 해결 된 단백질을 배양 하였다.
SDS-PAGE 겔을 콜로이드 coomassie(Sigma)및 피브린(ogen)밴드로 염색하고,절제하고,건조시키고,40mM dithiothreitol 로 배양하고 세척 하였다 14. 겔 조각을 배양되었으로 5mM13C-IPA(캠브리지의 동위원소의)1 시간 22°C 에 어둠을 alkylate 이황화 채권 Cys,세척 및 건조 전 단백질의 소화로 12.,25℃에서 밤새 25mM NH4CO2 에서 5ng/μl 의 트립신(Promega)을 5%포름산,50%아세토 니트릴로 슬라이스로부터 용출시켰다. 나노 액체 크로마토 그래피(nano-Lc)는 Ultimate3000HPLC 및 오토 샘플러 시스템(Dionex)을 사용하여 수행되었습니다. 샘플 주입 fritless nano-LC 칼럼(75μm x~12cm)를 포함하는 C18 미디어(1.9µm,120Å ReproSil-Pur120C18-AQ,박사 Maisch GmbH)및 가열 45°C 에 대한 모든 실행됩니다. 펩타이드는 0.2μl/min 의 유속에서 52 분 이상의 선형 구배를 사용하여 용출되었다. 모바일 단계 A 는 0 으로 구성되었습니다.,H2o 에서 1%포름산 인 반면,이동상 B 는 0.1%포름산으로 아세토 니트릴:h2o(8:2)로 구성되었다. 그라데이션었:0min2%B;4 분의 2%B,36min45%B,37 분 80%B,37.5 최소 80%B,39min2%B52min2%B. 높은 전압(2000V)에 적용되었으로 낮은 볼륨 티(궁금증들을 해결해 드립니다 과학)및 열 팁 배치~0.5cm 에서 가열된 모세관(T=275°C)의 LTQ Orbitrap Velos(Thermo Electron)질량 분석기. 양성 이온은 전기 분사 이온화에 의해 생성되었고 질량 분석기는 데이터 의존적 수집 모드에서 작동되었다., 전체 스캔 MS 스펙트럼은 orbitrap 에 의해 30,000 의 해상도로 획득되었습니다(m/z350-1750). 15 가장 풍부한이온(>5000 카운트)에 충전국≥+2 었던 순차적으로 절연과 조각에서는 선형 이온를 사용하여 트랩 collisionally 유도 분리와 활성화 q=0.25 및 활성화의 시간 10ms 에서 목표치의 30,000 이온입니다. MS/MS 에 대해 선택된 M/z 비율은 35s.이온 트랩 줌 AGC 표적:3000.00 에 대해 동적으로 제외되었다. 이온 트랩 전체 AGC 대상:30000.00. 이온 트랩 심 AGC 대상:10000.00. 이온 트랩 MSn AGC 대상:10000.00., 데이터는 Swissprot 데이터베이스에 대해 마스코트 데몬(버전 2.5.0,매트릭스 과학)을 사용하여 분석되었습니다. 검색 매개 변수가 전조성의 6ppm 및 제품 이온 허용오차±0.6Da 및 iodoacetanilide 유도체(Cys),iodoacetanilide13C 유도체(Cys),산화(만)으로 선택한 변수를 수정 전체간의 혈 청 다차원의 협곡까지 세 가지를 놓쳤 cleavages. 목록과 함께 시스테인-포함한 펩티드를 사용하여 식별 마스코트,그들의 monoisotopic 질량/담당 비율(m/z)의 인+2+3+4 를 사용하여 계산됩니다 MS-제품(버전 v6.2.2,단백질 통합관리 도구)., 12C-IPA 또는 13C-IPA 로 표지 된 Cys 는 각각 133.05276 또는 139.07289 의 질량을 갖는다. 30 개의 Cys 함유 펩타이드를 분석 하였다(보충 표 1 및 2). 다른 산물의 형태 Cys 잔류물었 정량화 상대로부터 이온의 풍부한 펩타이드 표시 12C-IPA 및/또는 13C-IPA. 펩티드의 이온 풍부도를 계산하기 위해 xcalibur Qual Browser(v2.1.0;Thermo Scientific)를 사용하여 추출 된 이온 크로마토 그램을 생성했습니다. 면적은 소프트웨어에 내장 된 자동화 된 피크 감지 기능을 사용하여 계산되었습니다., 데이터는 정기적으로 검색에 대한 펩타이드 포함 무료 Cys 티올과 이들을 검출되지 않았음을 나타내는 알킬화의 짝이 없는 Cys 잔류물 12C-IPA 또는 13C-IPA 완료되었에서 단백질이다.
차례로 이황화물 연결 펩티드 분석
건강한 기부자 플라즈마(0.7mL)was incubated polyclonal anti-차례로 항체 입히는 Dynabeads 에서 회전하는 휠에 대한 1 시간 22°C 슬 수집,초과 플라즈마 흡기 및 0.3mL5mM12C-IPA 인산염 완충제 염분이 포함된 10%DMSO 에 추가 되었고 배양을 위한 1 시간 22°C 습니다., 이어서 상청액을 흡인하고,비드를 60℃에서 30 분 동안 NuPAGE LDS 샘플 완충액으로 배양하고 상청액을 SDS-PAGE 에서 해결 하였다. 겔 조각을 포함하는 차례로 세척 및 건조 전에 소화 12ng/μl trypsin(Promega)4h37°C. 반응을 중지 추가해 5%(v/v)포름산 및 펩티드 용출서는 겔 조각 5%포름산과 50%(v/v)아세토니트릴. 0 에 있는 펩티드.,1%포름산(으 볼륨 12μl)were 에 해결 35cm×75µm C18 역상 분석은 열을 사용하여 2-35%아세토니트릴라 22 분의 흐름율 300nL/min(Thermo Fisher Scientific 궁극적인 3000HPLC)그리고 분석에 LTQ Orbitrap Velos 질량 분석기로 설명이다. 이황화물 연결 펩티드 검색에 대한 인간의 차례로 사용하여 순서 Byonic 분석 소프트웨어(버전 3.9-7,단백질 측정항목)거짓 발견율이 1%. 모든 디설파이드-연결된 펩티드는 정확도를 위해 수동으로 검사되었다., 전구체 질량 허용 오차 및 단편 허용 오차는 각각 10ppm 및 0.6Da 로 설정되었다. 가변 변형은 최대 3 개의 놓친 분열의 전체 트립신 분열로 산화 된 Met,산화 된 Cys(mono,di 및 tri)및 글루 타티 오닐 화 된 Cys 로 정의되었다.
차례로 기능을 분석
정화 차례로(0.2mL10mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated5mM12C-IPA1 시간 22°C 에 어둠을 alkylate 짝이 없는 Cys 티올과에서 단백질이다., 미반응 IPA 는 7kDa MWCO Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo Fisher)을 사용하여 제거되었다. 차례로 또는 차례로-IPA(1.1mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마)5 서 22°C 에서 총 볼륨의 0.2mL1.5mL microcentrifuge 튜브입니다. 피브린 중합체를 15 분 동안 13,000×g 로 펠렛 화하고 상청액에 남아있는 피브리노겐의 농도를 측정 하였다. 기능성은 피브린 중합체 형성에서 소비되는 피브리노겐의%로 표현됩니다.,
섬유소 중합체 형성을 측정하여 빛의 산란
정화 차례로 또는 차례로-IPA(1mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마). 350nm 에서의 흡광도의 증가는 15 분 동안 30s 마다 기록되었다.
섬유소 중합체 구조에 의해 측정된 스캐닝 전자 현미경(SEM)
차례로 또는 차례로-IPA(1mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마)2h22°C 에서 총 볼륨의 0.2mL., 섬유 소 폴리머었 씻어 두 번 0.1M 인산염 완충기 saline(PBS),고정 2.5%glutaraldehyde PBS 에서 하룻밤 4°C,post-1 로 설정%OsO4 에 PBS,탈수 등급의 시리즈 에탄올,그리고 다음 중요한 포인트 건조 Leica EM CPD300. 샘플을 15nm 금(K550X,Emitech)으로 코팅하고 Zeiss SigmaHD 전계 방출 주사 전자 현미경으로 이미징했습니다. SEM 마이크로 그래프는 5kV 가속 전압 및 5mm 의 작동 거리에서 기록되었다.Imagej 를 사용하여 섬유 직경을 측정 하였다.,
섬유소 중합체 침투석실험
차례로 또는 차례로-IPA(1mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마)2h22°C 에서 총 볼륨의 0.2mL 폴리프로필렌에서 크로마토그래피는 열과 내부 직경 4.6mm 입니다. 열었으로 오버레이 0.8mL 의 Hepes 버퍼 플럭스(J)계산되었에서의 중량이 떨어지는 것을 관류된 20min., 투과(다시)constant33 계산의 관계에서,Ks=JƞA/LP 곳,J flux(cm3/s),ƞ 은 점도의 buffer(0.01 균형 상온에서),A cross-section 의 응고(0.17cm2),L 길이의 응고(1.1cm),P 은 수압(1,018,218 다인/cm2).
섬유소 중합체 압축 assay
차례로 또는 차례로-IPA(1mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마)16 서 22°C 에서의 볼륨 0.5㎖1.,5mL microcentrifuge 튜브 이전에 물 10mg/mL PEG-20000 으로 코팅 하 고 공기 건조. 피브린 중합체를 5 내지 2400s 동안 13,000×g 에서 원심 분리하고 중합체로부터 압출 된 유체의 부피를 측정 하였다.
섬유소 분석 결과
차례로 또는 차례로-IPA(1.8mg/mL50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)was incubated1unit/mL 의 소 트롬빈(시그마)2h22°C 에서의 볼륨 0.5㎖24-well 플레이트(15.6mm 직경)2h22°C 는 부분의 플라스(5µL 은 0 입니다.,59μm)을 우물의 중심에 첨가하고,플레이트를 습한 환경에서 37°C 에서 18h 동안 배양 하였다. 용해 영역은 직각으로 측정 된 두 직경의 평균으로부터 결정되었다.
의 정량화 redox 국의 α2-마크로 글 로불린 이황화 채권
10 건강한 기증자 플라즈마에 대해 위에서 설명한 분석을 차례로 고용되었을 위한 분석 α2-마크로 글 로불린을 사용하여 동일한 절차입니다. 플라즈마(0.,7mL)was incubated polyclonal anti-α2-마크로 글 로불린 항체(가 ダッコ 에서 집착할,고양이 Q0102,많은 20068567)입히는 Dynabeads(Life Technologies)에서 회전하는 휠에 대한 1 시간 22°C 슬 수집,초과 플라즈마 흡기 및 배양에서는 0.3mL5mM12C-IPA 인산염 완충제 염분이 포함된 10%DMSO1 서 22°C 에 어둠을 alkylate 짝이 없는 Cys 티올과에서 단백질이다. 상청액을 흡인하고,60℃에서 30 분 동안 추가로 5mm12C-IPA 를 함유하는 nupage LDS 샘플 완충액(Life Technologies)으로 배양 한 비드를 상청액을 SDS-PAGE 에서 해결 하였다., SDS-PAGE 겔을 콜로이드 쿠마시에(Sigma)로 염색하고 α2-마크로 글로불린 밴드를 절제하고,탈염하고,건조시키고,40mM 디티오트레이톨로 배양하고 세척 하였다 14. 겔 조각을 배양되었으로 5mM13C-IPA(캠브리지의 동위원소의)1 시간 22°C 에 어둠을 alkylate 이황화 채권 Cys,세척 및 건조 전 단백질의 소화로 12.5ng/μl 의 트립신(Promega)에서 25mM NH4CO2 에서 하룻밤 25°C 펩타이드 용출 조각에서는 5%포름산,50%아세토니트릴., 액체 크로마토 그래피,질량 분석법 및 데이터 분석은 피브리노겐 34 에 대해 기술 된대로 수행되었다. 17 개의 Cys 함유 펩타이드를 분석 하였다(보충 표 2 및 4). 다른 산물의 형태 Cys 잔류물었 정량화 상대로부터 이온의 풍부한 펩타이드 표시 12C-IPA 및/또는 13C-IPA.
보고 요약
에 대한 자세한 정보는 연구 디자인에 자연의 연구 보고 요약 연결되어 이 문서입니다.피>