Creazione di una trama di contorno diretta di dati sperimentali richiede l’uso di un possibile metodo di high-throughput e un numero considerevole di campioni. Il dosaggio, pertanto, deve essere adatto per l’uso in un design a piastra a 96 pozzetti., I vantaggi generali di questa miniaturizzazione da tubi a reazione singola a piastre a 96 pozzetti sono già stati mostrati per il DNSA e altri saggi colorimetrici . Tutti i saggi utilizzati in questo studio erano adatti per il formato a 96 pozzetti. Per produrre un diagramma di contorno, le miscele enzimatiche e di substrato sono state incubate a otto diversi livelli di pH. Questi otto livelli di pH sono stati incubati a 12 diverse temperature utilizzando un ciclatore PCR gradiente, con conseguente 96 condizioni di reazione uniche. Per ottenere i dati è stato utilizzato un lettore di targhe., I risultati sono stati trasformati in attività relative con l’attività più alta su ogni piastra impostata su 100%. La misurazione è stata eseguita in triplice copia e i valori medi sono stati successivamente trasformati in un diagramma di contorno utilizzando SigmaPlot, come descritto nella sezione materiali e metodi. L’attività (asse z) è rappresentata come colore dal viola al rosso invece di un asse normale per migliorare la vista del grafico del contorno.,
Sistema tampone
Un prerequisito per la determinazione affidabile del pH e della temperatura optima è un sistema tampone stabile che è adatto per quanto riguarda l’attività enzimatica e quasi resistente ad uno spostamento del pH con l’aumentare della temperatura. In alternativa, questo effetto potrebbe essere considerato nella trama del contorno. L’influenza della temperatura sul pKa dei tamponi e quindi sul pH è un fatto che dovrebbe essere considerato, specialmente per i tamponi alcalini come il Tris ., Come requisito per il test, tutte le variazioni di pH del nostro sistema tampone citrato–fosfato sono state testate per la variazione del pH tra 35 °C e 80 °C (vedere il file aggiuntivo 4). Tutti i buffer mostrano una leggera diminuzione del pH con l’aumento della temperatura, con i buffer a valori di pH più elevati che mostrano deviazioni più elevate. La dipendenza dalla temperatura aumenta con la quantità di fosfato, che è correlata con i coefficienti di temperatura di fosfato (− 0,0028) e citrato (0)., Poiché le variazioni di pH dipendenti dalla temperatura di tutti i buffer erano solo minori, potevano essere trascurate nella compilazione dei grafici di contorno all’interno dell’intervallo di valori utilizzati qui. Tuttavia, se si utilizza un altro sistema tampone con un coefficiente di temperatura più elevato, è facilmente possibile adattare il diagramma di contorno per la variazione del pH assegnando a ciascun tampone un pH individuale ad ogni temperatura., Questi valori sono determinati sperimentalmente come descritto nella rispettiva sezione materiali e metodo o derivati dai coefficienti di temperatura e possono quindi essere utilizzati per adattare l’asse x (pH) del file Sigmaplot fornito.
Determinazione dell’intervallo di attività per Cel8A
Una panoramica dei diversi enzimi, substrati e saggi utilizzati in questo studio per la creazione dei rispettivi diagrammi di contorno è riportata nella Tabella 1.,
Cel8A è una cellulasi, più specificamente un endo-glucanasi, da C. thermocellum ed è stato il primo enzima del glicoside idrolasi famiglia 8 con un risolto struttura di cristallo . In questo studio, l’enzima è stato incubato con BBG per convalidare il nostro metodo proposto utilizzando il test DNSA. Cel8A è stato segnalato per avere la sua temperatura ottimale a 75 ° C e pH ottimale tra 5.5 e 6.5 ., Questi valori sono in accordo con i risultati del nostro diagramma di contorno in quanto sono all’interno della regione di > 90% di attività (Fig. 1). Il nostro diagramma di contorno, tuttavia, mostra che l’enzima è altamente attivo in una vasta gamma di condizioni diverse. L’enzima mostra attività accettabili a valori di pH inferiori quando tra 60 °C e 65 °C e svolge anche con più del 60% della sua attività massima quando a valori di pH inferiori a 4,5. Il nostro metodo fornisce i mezzi per visualizzare tali effetti e valutare le prestazioni di un enzima in qualsiasi punto all’interno dei parametri testati a colpo d’occhio.,
Contour plot di Cel8A utilizzando il DNSA dosaggio con orzo-beta-glucano come substrato
Per verificare se il nostro metodo è adatto per diversi idrolasi metodi di dosaggio, abbiamo prodotto una trama di contorno utilizzando Cel8A con Azo-CM-cellulosa come substrato e il rispettivo dosaggio (Fig. 2). La trama mostra optima simile a 75 °C e pH 5.5. Tuttavia, l’uso di Azo-CM-cellulosa come substrato ha determinato un intervallo di attività leggermente inferiore., Le differenze minori tra i due saggi potrebbero essere dovute alle strutture dissimili e ai tipi di legame di entrambi i substrati, differendo quindi nelle loro proprietà di legame all’enzima. Azo-CM-cellulosa è un substrato non naturale con gruppi di coloranti aggiunti, che potrebbero aggiungere ulteriormente a questo effetto. Utilizzando Cel8A, abbiamo potuto dimostrare che il nostro metodo fornisce dati validi ed è adatto per l’uso in due diversi saggi stabiliti per idrolasi: DNSA e Azo-CM-cellulosa.
Contour plot di Cel8A utilizzando Azo-CM-cellulosa
Attività gamma determinazione per Celluclast®
In aggiunta a un singolo enzima, un enzima miscela è stata studiata. Celluclast® è un prodotto di cellulasi commerciale ampiamente usato derivato da Trichoderma reesei. È costituito principalmente da cellobioidrolasi e end-1,4-β-glucanasi, ma presenta anche xilanasi e almeno una β-xilosidasi . Il manuale del prodotto afferma che le attività ottimali sono comprese tra 50 °C e 60 °C e pH 4.,5 e 6.0 . In questo lavoro, abbiamo prima prodotto una trama di contorno per Celluclast® con BBG come substrato utilizzando il metodo DNSA (Fig. 3). Il diagramma di contorno BBG è stato verificato da una curva di temperatura standard (Fig. 4). I risultati della curva di temperatura a pH 5,5 sono in accordo con i risultati del diagramma di contorno, mostrando lo stesso intervallo di attività. Tuttavia, la misurazione di curve separate è inadeguata per descrivere l’attività di Celluclast® su BBG. L’intervallo di pH in cui la miscela enzimatica mostra un’elevata attività dipende fortemente dalla temperatura., Più alta è la temperatura, più basso è il pH deve essere per ottenere una elevata attività. Intorno ai 45 °C, Celluclast® è altamente attivo (> 60%) fino a un pH di 6,5, mentre a 65 °C è altamente attivo solo fino a un pH di 5,0. Descrivere l’attività con due curve separate è, quindi, strettamente dipendente dal valore scelto come parametro statico. I grafici di temperatura, ad esempio, quelli presi ai due estremi dell’intervallo di pH dichiarato (4.5 e 6.0) dovrebbero dare risultati significativamente diversi. Lo stesso vale per i grafici del pH presi a temperature diverse., Per rendere evidente questo effetto, abbiamo prodotto grafici pH standard a 45 °C, 55 °C e 65 ° C (Fig. 5). Queste tre curve di pH mostrano che, con l’aumentare della temperatura, il bordo del pH per l’alta attività si sposta su valori di pH più acidi. Le tre curve verificano quindi i risultati visti nella trama del contorno. Inoltre, mostrano i limiti della determinazione convenzionale dell’attività separata, che almeno per Celluclast® è, nel caso delle curve di pH, dipendente dalla temperatura scelta., L’uso del nostro metodo di contorno elude completamente questo problema misurando l’effetto della temperatura e del pH in un unico passaggio.
Contour plot di Celluclast® tramite l’DNSA dosaggio con orzo-beta-glucano come substrato
Temperatura convenzionale determinazione ottimale di Celluclast® a pH 5.0., La temperatura ottimale di Celluclast® su orzo-β-glucano è stata determinata a pH 5.0. L’approccio convenzionale mostra l’attività massima intorno a 55 °C ed è in accordo con i risultati visti nel diagramma di contorno corrispondente
pH convenzionale determinazione ottimale di Celluclast® a tre temperature. Il pH ottimale di Celluclast® su orzo-β-glucano è stato determinato a 45 °C, 55 °C e 65 °C., A temperature più basse, l’enzima può tollerare valori di pH più elevati. Questo è in accordo con il diagramma di contorno corrispondente e mostra il forte impatto del parametro fisso scelto quando si determina separatamente il pH o la temperatura ottimale
L’intervallo di attività di Celluclast® su arabinoxylan (AX) (Fig. 6) differisce da quello con BBG come substrato. L’attività è notevolmente spostata verso temperature più basse, senza attività elevate osservate sopra i 60 °C., Poiché Celluclast® è una miscela di diversi enzimi, è molto probabile che questi diversi enzimi abbiano caratteristiche diverse. Tuttavia, il modello di attività è simile a quello di BBG; ad esempio, a pH 4.5, la miscela enzimatica è altamente attiva fino a quasi 60 °C, mentre a pH 6.5, è altamente attiva solo fino a 50 °C. In letteratura, l’optimum di Celluclast® su AX solubile in grano è stato determinato da un modello di superficie di risposta (RSM) e trovato intorno a pH 4.4 e 39 °C., Il nostro diagramma di contorno mostra la più alta attività nello stesso intervallo di temperature e ad un pH leggermente più alto, che è ancora all’interno dell’ottimale determinato dall’RSM. Mentre l’optimum è quasi lo stesso per entrambi i metodi, il nostro diagramma di contorno mostra sorprendentemente l’attività esatta di Celluclast® su AX all’interno dell’intera gamma delle circostanze provate ed esibisce una disposizione più dettagliata che il RSM. Con i nostri diagrammi di contorno di Celluclast® su BBG e AX, abbiamo potuto dimostrare che le miscele enzimatiche complesse possono essere analizzate con il metodo proposto.
Contour plot di Celluclast® tramite l’DNSA dosaggio con arabinoxylan come substrato
Per dimostrare ulteriormente la versatilità della nostra attività gamma determinazione, abbiamo valutato l’uso con ulteriori substrati e dosaggi. L’attività di Celluclast® su p-NP-β-d-glucopiranoside è stata testata e la trama del contorno è mostrata in Fig. 7. L’elevata attività su questo substrato è limitata a un intervallo piuttosto ristretto tra pH 4,0-5,5 e 55 °C – 70 ° C., Ciò suggerisce che solo uno o pochi enzimi all’interno della miscela enzimatica Celluclast® probabilmente mostra attività verso p-NP-β-d-glucopiranoside. i glicosidi p-NP possono essere utilizzati come substrati per la preparazione di trame di contorno. Tuttavia, non tutti i glicosidi p-NP sono substrati adatti nel test, poiché molti di essi mostrano un background elevato a causa dell’instabilità (vedere il file aggiuntivo 5), specialmente quando le alte temperature sono combinate con valori di pH elevati.
Contour plot di Celluclast® utilizzando p-NP-beta-d-glucopyranoside
Per testare l’applicazione del nostro metodo naturale, biomassa esempio, abbiamo scelto di utilizzare una cannuccia a base di substrato. La liberazione del glucosio da parte di Celluclast® è stata rilevata utilizzando il dosaggio commerciale d-glucosio HK (Megazyme). Il componente principale nella parete cellulare della paglia è la cellulosa, che è la principale fonte di glucosio liberato enzimaticamente. La trama del contorno (Fig., 8), quindi, mostra prevalentemente l’attività di Celluclast® sulla cellulosa cristallina, che è recalcitrante verso la degradazione enzimatica . Il più alto rilascio di glucosio è stato osservato a circa pH da 4,0 a 5,5 e da 40 °C a 60 °C. L’intervallo con alta attività è, quindi, meno ampio di quello determinato per BBG, che dovrebbe essere preso in considerazione per un processo principalmente volto a degradare la cellulosa., Con l’uso di d-glucosio HK e p-NP-β-d-glucopiranoside come saggi alternativi, abbiamo potuto dimostrare l’adattabilità del nostro metodo a un totale di quattro diversi e comunemente usati saggi di idrolasi glicosidica. L’utilizzo della paglia ha dimostrato che il nostro metodo è adatto anche per substrati naturali di rilevanza industriale e potrebbe essere utilizzato per la valutazione di processi e substrati complessi. Celluclast ® mostra diversi profili di attività su diversi substrati., Collettivamente per tutti i metodi, è, quindi, cruciale determinare i dati dell’intervallo di pH e temperatura di un enzima con il substrato di interesse.
Contour plot di Celluclast® utilizzando il d-glucosio HK dosaggio con paglia naturale a base di substrato
Considerazioni quando si utilizza il metodo
Quando una trama di contorno è prodotto con il metodo proposto, ci sono alcune considerazioni che devono essere presi in considerazione., Il substrato deve essere stabile e lo sfondo misurato riproducibile per l’intera gamma di condizioni nella piastra a 96 pozzetti. Questo è un prerequisito, perché il controllo del substrato deve essere sottratto da tutti i valori prima della conversione in attività relative, ma non può essere misurato direttamente sulla piastra per ciascuna delle 96 condizioni. Diversi substrati di glicosidi p-NP, ad esempio, non possono essere utilizzati, poiché mostrano uno sfondo altamente dipendente dalla temperatura e dal pH. È necessario un pipettaggio molto preciso per ottenere livelli accettabili di deviazione standard dai triplicati., L’uso di pipette a 96 teste e 8 canali è fortemente raccomandato in quanto migliorano significativamente l’accuratezza e accelerano la procedura. Inoltre, plate reader e gradiente PCR cycler sono requisiti tecnici per eseguire correttamente il metodo. L’intervallo di temperatura in cui il metodo può essere eseguito può essere adattato in base alle proprietà tecniche del ciclatore PCR gradiente, che di solito è limitato a 30 °C o 40 °C e spesso non può includere valori inferiori a 20 °C., Abbiamo convertito direttamente l’assorbanza in attività relativa di un enzima, perché i valori sono tutti su una curva di calibrazione lineare (dati non mostrati). Se questo non è il caso, tuttavia, l’attività deve essere calcolata prima, ad esempio, in U/mg, e questi valori possono quindi essere utilizzati per produrre la trama del contorno. Quando si desidera produrre un diagramma di contorno per un enzima che dipende fortemente dagli ioni metallici bivalenti, è necessario utilizzare un diverso sistema di buffer, poiché i buffer a base di citrato–fosfato complessi tali ioni.,
Mentre gli approcci RSM sono uno strumento indiscutibilmente potente per valutare relazioni complesse, ad esempio, variabili diverse che influenzano più fattori, determinare l’effetto di solo pH e temperatura sull’attività non è troppo complesso per essere raggiunto con la misurazione diretta. La determinazione dei valori di bordo corretti del modello può richiedere diversi approcci e può influenzare il modello risultante. Il modello RSM è derivato solo da un piccolo numero di misurazioni attorno al punto centrale dell’attività dell’enzima e l’accuratezza verso i valori sperimentali effettivi deve essere testata in seguito., La risoluzione complessiva dell’RSM è, quindi, inferiore a quella ottenuta con il nostro metodo, il che rende difficile vedere gli effetti dell’attività come mostrato per Celluclast® a temperature e/o valori di pH più elevati. Il nostro metodo non richiede la capacità di progettare modelli statistici complessi e può essere eseguito con requisiti tecnici minimi e relativamente standard. Uno svantaggio sia il nostro metodo che la condivisione RSM è che la visualizzazione diretta della deviazione standard all’interno del grafico tridimensionale non è possibile., Tuttavia, il nostro metodo consente il calcolo della deviazione standard per ogni singolo punto di dati. La maggior parte dei modelli RSM determina la deviazione standard per l’intero modello solo dai dati del punto dati centrale del modello, mentre gli altri punti dati vengono misurati una sola volta . Le deviazioni standard sono naturalmente più elevate ai confini dell’attività di un enzima e illustrano un forte impatto sull’attività all’interno di un leggero cambiamento di condizioni. Intorno all’ottimale e all’interno di aree di attività assente o bassa, le deviazioni sono significativamente inferiori., Poiché il metodo proposto si traduce in un insieme di dati fattoriali completo, sarebbe possibile calcolare un modello statistico se necessario per ulteriori analisi. Il modello statistico derivato si baserebbe direttamente su dati sperimentali, ma è una fase aggiuntiva che non dovrebbe essere necessaria per le applicazioni standard del metodo.
In sintesi, una facile valutazione dell’idoneità di un enzima o di una miscela enzimatica per una combinazione di parametri di processo è di fondamentale importanza quando si progettano processi biotecnologici su scala di laboratorio o industriale., La temperatura e il pH sono due dei fattori di processo più importanti che influenzano l’attività enzimatica. Gli approcci convenzionali per testare l’effetto di questi fattori sugli enzimi si basano sul presupposto che esiste una correlazione bidimensionale tra temperatura e attività, nonché pH e attività. Al contrario, nuovi approcci determinano la relazione nella materia tridimensionale, ma sono basati su statistiche, complessi da progettare e la loro accuratezza nei dati effettivi può variare., Il metodo introdotto qui, d’altra parte, consente di determinare rapidamente e facilmente l’effetto che la temperatura e il pH hanno sull’attività dell’enzima contemporaneamente utilizzando piastre a 96 pozzetti, pipette multicanale e un ciclatore PCR gradiente. Con questa attrezzatura tecnica di base, è possibile produrre diagrammi di contorno di pH, temperatura e attività che si basano direttamente su dati sperimentali. Il metodo è stato testato per diversi saggi di idrolasi glicosidica diffusi, nonché per modelli e substrati complessi.