Un nuovo metodo per valutare la temperatura vs. pH profili di attività per biotecnologiche rilevanti enzimi
Creazione di una trama di contorno diretta di dati sperimentali richiede l’uso di un possibile metodo di high-throughput e un numero considerevole di campioni. Il dosaggio, pertanto, deve essere adatto per l’uso in un design a piastra a 96 pozzetti., I vantaggi generali di questa miniaturizzazione da tubi a reazione singola a piastre a 96 pozzetti sono già stati mostrati per il DNSA e altri saggi colorimetrici . Tutti i saggi utilizzati in questo studio erano adatti per il formato a 96 pozzetti. Per produrre un diagramma di contorno, le miscele enzimatiche e di substrato sono state incubate a otto diversi livelli di pH. Questi otto livelli di pH sono stati incubati a 12 diverse temperature utilizzando un ciclatore PCR gradiente, con conseguente 96 condizioni di reazione uniche. Per ottenere i dati è stato utilizzato un lettore di targhe., I risultati sono stati trasformati in attività relative con l’attività più alta su ogni piastra impostata su 100%. La misurazione è stata eseguita in triplice copia e i valori medi sono stati successivamente trasformati in un diagramma di contorno utilizzando SigmaPlot, come descritto nella sezione materiali e metodi. L’attività (asse z) è rappresentata come colore dal viola al rosso invece di un asse normale per migliorare la vista del grafico del contorno.,
Sistema tampone
Un prerequisito per la determinazione affidabile del pH e della temperatura optima è un sistema tampone stabile che è adatto per quanto riguarda l’attività enzimatica e quasi resistente ad uno spostamento del pH con l’aumentare della temperatura. In alternativa, questo effetto potrebbe essere considerato nella trama del contorno. L’influenza della temperatura sul pKa dei tamponi e quindi sul pH è un fatto che dovrebbe essere considerato, specialmente per i tamponi alcalini come il Tris ., Come requisito per il test, tutte le variazioni di pH del nostro sistema tampone citrato–fosfato sono state testate per la variazione del pH tra 35 °C e 80 °C (vedere il file aggiuntivo 4). Tutti i buffer mostrano una leggera diminuzione del pH con l’aumento della temperatura, con i buffer a valori di pH più elevati che mostrano deviazioni più elevate. La dipendenza dalla temperatura aumenta con la quantità di fosfato, che è correlata con i coefficienti di temperatura di fosfato (− 0,0028) e citrato (0)., Poiché le variazioni di pH dipendenti dalla temperatura di tutti i buffer erano solo minori, potevano essere trascurate nella compilazione dei grafici di contorno all’interno dell’intervallo di valori utilizzati qui. Tuttavia, se si utilizza un altro sistema tampone con un coefficiente di temperatura più elevato, è facilmente possibile adattare il diagramma di contorno per la variazione del pH assegnando a ciascun tampone un pH individuale ad ogni temperatura., Questi valori sono determinati sperimentalmente come descritto nella rispettiva sezione materiali e metodo o derivati dai coefficienti di temperatura e possono quindi essere utilizzati per adattare l’asse x (pH) del file Sigmaplot fornito.
Determinazione dell’intervallo di attività per Cel8A
Una panoramica dei diversi enzimi, substrati e saggi utilizzati in questo studio per la creazione dei rispettivi diagrammi di contorno è riportata nella Tabella 1.,
Cel8A è una cellulasi, più specificamente un endo-glucanasi, da C. thermocellum ed è stato il primo enzima del glicoside idrolasi famiglia 8 con un risolto struttura di cristallo . In questo studio, l’enzima è stato incubato con BBG per convalidare il nostro metodo proposto utilizzando il test DNSA. Cel8A è stato segnalato per avere la sua temperatura ottimale a 75 ° C e pH ottimale tra 5.5 e 6.5 ., Questi valori sono in accordo con i risultati del nostro diagramma di contorno in quanto sono all’interno della regione di > 90% di attività (Fig. 1). Il nostro diagramma di contorno, tuttavia, mostra che l’enzima è altamente attivo in una vasta gamma di condizioni diverse. L’enzima mostra attività accettabili a valori di pH inferiori quando tra 60 °C e 65 °C e svolge anche con più del 60% della sua attività massima quando a valori di pH inferiori a 4,5. Il nostro metodo fornisce i mezzi per visualizzare tali effetti e valutare le prestazioni di un enzima in qualsiasi punto all’interno dei parametri testati a colpo d’occhio.,
Per verificare se il nostro metodo è adatto per diversi idrolasi metodi di dosaggio, abbiamo prodotto una trama di contorno utilizzando Cel8A con Azo-CM-cellulosa come substrato e il rispettivo dosaggio (Fig. 2). La trama mostra optima simile a 75 °C e pH 5.5. Tuttavia, l’uso di Azo-CM-cellulosa come substrato ha determinato un intervallo di attività leggermente inferiore., Le differenze minori tra i due saggi potrebbero essere dovute alle strutture dissimili e ai tipi di legame di entrambi i substrati, differendo quindi nelle loro proprietà di legame all’enzima. Azo-CM-cellulosa è un substrato non naturale con gruppi di coloranti aggiunti, che potrebbero aggiungere ulteriormente a questo effetto. Utilizzando Cel8A, abbiamo potuto dimostrare che il nostro metodo fornisce dati validi ed è adatto per l’uso in due diversi saggi stabiliti per idrolasi: DNSA e Azo-CM-cellulosa.
Attività gamma determinazione per Celluclast®
In aggiunta a un singolo enzima, un enzima miscela è stata studiata. Celluclast® è un prodotto di cellulasi commerciale ampiamente usato derivato da Trichoderma reesei. È costituito principalmente da cellobioidrolasi e end-1,4-β-glucanasi, ma presenta anche xilanasi e almeno una β-xilosidasi . Il manuale del prodotto afferma che le attività ottimali sono comprese tra 50 °C e 60 °C e pH 4.,5 e 6.0 . In questo lavoro, abbiamo prima prodotto una trama di contorno per Celluclast® con BBG come substrato utilizzando il metodo DNSA (Fig. 3). Il diagramma di contorno BBG è stato verificato da una curva di temperatura standard (Fig. 4). I risultati della curva di temperatura a pH 5,5 sono in accordo con i risultati del diagramma di contorno, mostrando lo stesso intervallo di attività. Tuttavia, la misurazione di curve separate è inadeguata per descrivere l’attività di Celluclast® su BBG. L’intervallo di pH in cui la miscela enzimatica mostra un’elevata attività dipende fortemente dalla temperatura., Più alta è la temperatura, più basso è il pH deve essere per ottenere una elevata attività. Intorno ai 45 °C, Celluclast® è altamente attivo (> 60%) fino a un pH di 6,5, mentre a 65 °C è altamente attivo solo fino a un pH di 5,0. Descrivere l’attività con due curve separate è, quindi, strettamente dipendente dal valore scelto come parametro statico. I grafici di temperatura, ad esempio, quelli presi ai due estremi dell’intervallo di pH dichiarato (4.5 e 6.0) dovrebbero dare risultati significativamente diversi. Lo stesso vale per i grafici del pH presi a temperature diverse., Per rendere evidente questo effetto, abbiamo prodotto grafici pH standard a 45 °C, 55 °C e 65 ° C (Fig. 5). Queste tre curve di pH mostrano che, con l’aumentare della temperatura, il bordo del pH per l’alta attività si sposta su valori di pH più acidi. Le tre curve verificano quindi i risultati visti nella trama del contorno. Inoltre, mostrano i limiti della determinazione convenzionale dell’attività separata, che almeno per Celluclast® è, nel caso delle curve di pH, dipendente dalla temperatura scelta., L’uso del nostro metodo di contorno elude completamente questo problema misurando l’effetto della temperatura e del pH in un unico passaggio.