le materie di Studio
Le donne sono state reclutate da una fabbrica della comunità urbana di Cuernavaca, 89 km a sud di Città del Messico., La concentrazione di emoglobina in tutte le donne in fabbrica è stata determinata da campioni di sangue di puntura di dito, seguiti da un campione di sangue venoso per determinare la ferritina sierica tra le donne non anemiche. Un totale di 20 donne non anemiche con basse riserve di ferro sono state reclutate in base alla concentrazione di emoglobina ⩾125 g/l e alla concentrazione di ferritina sierica <25 µg/l. I criteri di esclusione includevano gravidanza e allattamento, disturbi gastrointestinali o metabolici (malattia infiammatoria intestinale, diarrea cronica, fibrosi cistica), altre malattie croniche e quelle che assumevano integratori di ferro., In tutto, 20 neonati apparentemente sani (di età compresa tra 6 e 24 mesi) e 20 bambini apparentemente sani (di età compresa tra 2 e 5 anni) sono stati reclutati da madri con livelli di emoglobina adeguati. I soggetti e i genitori dei bambini sono stati pienamente informati sugli obiettivi e le procedure dello studio ed è stato ottenuto il consenso scritto. Il Comitato etico dell’Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca, Messico e dell’Istituto federale svizzero di tecnologia, Zurigo, Svizzera hanno esaminato e approvato il protocollo.,
Dimensione del campione
I calcoli delle dimensioni del campione sono stati basati su variazioni interindividuali e intraindividuali nell’assorbimento del ferro, come osservato in precedenti studi sulla biodisponibilità del ferro nei neonati e nei bambini piccoli (Davidsson et al., 1994, 1997, 2000, 2004). È stato stimato che 20 bambini sarebbero una dimensione minima del campione per rilevare una differenza significativa del 50% nell’assorbimento di ferro medio di log da una media aritmetica di assorbimento di ferro al basale del 7%, con potenza del 90%, un livello di significatività di 0,05 (test t non accoppiato) e un tasso di errore di tipo I del 5%., Anticipando un tasso di abbandono del 10%, queste stime indicavano che almeno 20 soggetti in ciascun gruppo sarebbero stati necessari per completare gli studi.
Progettazione dello studio
Donne, neonati e bambini sono stati assegnati in modo casuale a ricevere il pasto di prova con solfato ferroso o con fumarato ferroso in giorni consecutivi. Il pasto di prova è stato somministrato come colazione dopo un digiuno notturno. L’accettabilità del pasto di prova è stata confermata con ogni neonato e bambino prima dell’iscrizione allo studio. Nessun cibo o bevanda è stato consentito per 3 h dopo l’assunzione completa del pasto etichettato., Neonati e bambini sono rimasti sotto stretta supervisione durante e dopo l’assunzione del pasto di prova.
In tutto, 5 ml di sangue venoso sono stati aspirati in provette trattate con EDTA poco prima dell’assunzione del primo pasto di prova e di nuovo 14 giorni dopo. Sono stati analizzati campioni di sangue per gli indicatori di stato del ferro (emoglobina e ferritina sierica) e la composizione isotopica del ferro. Il peso corporeo e l’altezza sono stati misurati ad ogni punto di prelievo di sangue.
Pasto di prova
Il pasto di prova era una bevanda zuccherata a base di latte di mais a base di farina di mais messicana locale “atole”. E ‘ stato fatto da farina di mais degermed (24.,7%), latte intero in polvere (11,7%), piloncillo (una forma solida di zucchero di canna non raffinato; 63,5%) e acqua depurata (200 ml) senza aggiunta di ferro o acido ascorbico. I pasti di prova standardizzati sono stati preparati appositamente per lo studio da alimenti disponibili localmente acquistati alla rinfusa, ad eccezione della farina di mais degermata che non era disponibile in Messico ed è stata ottenuta dalla Svizzera (Swiss Mill, Zurigo, Svizzera). La farina di mais degermata è stata utilizzata per ridurre al minimo il contenuto di acido fitico della farina, che altrimenti ridurrebbe la biodisponibilità del ferro dal pasto di prova (Hurrell et al., 2002)., Il pasto di prova è stato cucinato in una struttura di cucina e trasportato caldo al centro di alimentazione in fabbrica, dove una porzione di 220 g per donna e 60 g per neonato e bambino è stata preparata come colazione ed è stata seguita dall’assunzione di acqua. Tutti i pasti di prova erano identici tranne che per l’aggiunta di 4 mg Fe (donne) o 2,5 mg Fe (neonati e bambini) come fumarato ferroso o solfato ferroso, che sono stati aggiunti al pasto di prova immediatamente prima di servire. La polvere di fumarato ferroso è stata aggiunta direttamente nel pasto di prova e il solfato ferroso è stato aggiunto come soluzione.,
Stable isotope labels
Isotopically labeled-ferrous fumarate was produced by Dr Paul Lohmann GmbH (Emmerthal, Germany) from enriched elemental iron using a downscaled procedure of their equivalent commercial manufacturing process. La stessa procedura è stata utilizzata per studi precedenti (Davidsson et al., 2000, 2001, 2002; Fidler et al., 2003; Sarker et al., 2004). Le singole dosi di fumarato ferroso sono state pre-pesate in provette di polietilene, per cui la quantità esatta aggiunta è stata determinata dal peso del tubo e sono state quindi conservate., – il solfato ferroso è stato preparato da ferro elementare arricchito isotopicamente (Chemgas, Boulogne, Francia), che è stato sciolto in 0,1 mol H2SO4/l e portato alla concentrazione appropriata. La soluzione è stata tenuta in atmosfera di argon in un flacone di polietilene fino al momento del bisogno e pesata in dosi individuali prima dell’alimentazione.,
La composizione isotopica di entrambe le etichette è stata misurata in triplice copia mediante spettrometria di massa a ionizzazione termica negativa utilizzando uno spettrometro di massa a campo magnetico (MAT262; Finnigan MAT, Brema, Germania) dotato di un sistema multi-collettore di tazze di Faraday per il rilevamento di ioni. La concentrazione di ferro di ciascuna etichetta è stata misurata in triplice copia mediante analisi di diluizione isotopica inversa (Walczyk, 1997). Il fumarato ferroso è stato sciolto in acido nitrico concentrato prima della diluizione isotopica., Lo standard di ferro della composizione isotopica naturale è stato preparato gravimetricamente da un materiale di riferimento isotopico (IRMM-014; E. U. Institute of Reference Materials and Measurements, Geel, Belgio). I rapporti isotopici sono stati misurati mediante spettrometria di massa a ionizzazione termica negativa (Walczyk, 1997).
Composizione isotopica dei campioni di sangue
I campioni di sangue intero arricchiti sono stati mineralizzati mediante digestione a microonde utilizzando una miscela di HNO3 concentrato e H2O2 (30%) come agenti ossidanti., Il ferro è stato separato dalla matrice mediante cromatografia a scambio anionico e una fase di estrazione liquido–liquido in etere dietilico (Walczyk et al., 1997). Gli spazi vuoti chimici sono stati elaborati durante tutta la procedura. La composizione isotopica del ferro separato è stata misurata mediante spettrometria di massa a ionizzazione termica negativa.
Stato del ferro
Campioni di sangue intero appena prelevati sono stati assegnati per la misurazione della concentrazione di emoglobina utilizzando un fotometro portatile HemoCue (Hemocue Inc., Angelholm, Svezia) e tecniche standardizzate., Il materiale corrispondente di controllo di qualità è stato analizzato all’inizio di ogni giorno di campionamento (Hemocue Inc., Angelholm, Svezia). Un’aliquota di sangue intero è stata separata per le misurazioni della ferritina sierica mediante immunoassay automatizzato (Immulite One; DPC, Los Angeles, CA, USA) all’ETH, Zurigo, e il sangue intero rimanente è stato congelato per un’analisi successiva della composizione isotopica.,
Calcolo dell’assorbimento del ferro
Le quantità di etichette isotopiche 57Fe e 58Fe nel sangue, 14 giorni dopo la somministrazione, sono state calcolate in base allo spostamento dei rapporti isotopici Fe e alla quantità stimata di ferro circolante nell’organismo. I calcoli erano basati sui principi della diluizione isotopica, tenendo conto del fatto che le etichette isotopiche di ferro non erano mono-isotopiche. Il ferro circolante è stato calcolato in base al volume del sangue e alla concentrazione di emoglobina. I calcoli del volume del sangue erano basati sul peso corporeo e sull’altezza secondo Brown et al. (1962) per le donne e Linderkamp et al., (1977) per i bambini. Per i calcoli dell’assorbimento frazionario del ferro, è stata assunta l’incorporazione dell ‘ 80% del ferro assorbito negli eritrociti per le donne (Hosein et al., 1967) e 90% per i bambini (9). Il RBV di fumarato ferroso è stato calcolato per ogni serie di dati.
Analisi statistica
I valori di assorbimento frazionario del ferro sono presentati come mezzi geometrici e s.d. Tutti i test statistici sono stati alimentati all ‘ 80% ed eseguiti con intervallo di confidenza del 95% sui dati log-trasformati, poiché i valori di assorbimento del ferro non sono normalmente distribuiti., T-test associato dello studente è stato utilizzato per confrontare i dati all’interno di ogni gruppo di età. Il RBV di fumarato ferroso tra i gruppi di età è stato confrontato utilizzando il t-test spaiato di Student. L’analisi statistica della potenza è stata eseguita utilizzando software commerciale (StatMate 2; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, Stati Uniti d’America). La regressione lineare è stata utilizzata per valutare la relazione tra assorbimento del ferro e riserve di ferro (rappresentate dalla ferritina sierica) e la correlazione di Pearson è stata utilizzata per esaminare la relazione tra ferritina sierica e RBV.