Etica
Questo studio è stato condotto in conformità con i regolamenti della Dichiarazione di Helsinki (1964) e conforme alle Regionali del Comitato Etico e di Göteborg.
Cani
Sono stati usati due cani, Hanna, uno Schnauzer gigante nero di 10 anni (chip n., 967000000389928), e Lotti, un gigante nero Schnauzer di 6 anni (chip no. 098100311386). Il proprietario e gestore è GH. I cani vivono come animali domestici di famiglia con il proprietario e la sua famiglia. C’è accesso gratuito all’acqua dolce tutto il giorno e alimentazione tre volte al giorno. I cani trascorrono diverse ore al giorno in un giardino o in passeggiate. I controlli sanitari vengono effettuati presso la clinica degli animali Värmdö, Gustavsberg.
Formazione
Il metodo di formazione è stato descritto in dettaglio altrove . Per 2 anni prima del presente studio, è stato utilizzato solo un addestramento di manutenzione una volta alla settimana., Ciascuna delle sessioni di allenamento includeva 4-10 scatole, 0-3 delle quali contenevano tessuto tumorale o sangue di pazienti con carcinoma ovarico. La configurazione è stata selezionata casualmente prima di ogni sessione. Questo programma ha permesso ai cani di confrontarsi con un problema diverso da risolvere in ogni occasione di allenamento. I cani sono stati premiati solo per una corretta identificazione. Per l’allenamento sono stati utilizzati campioni di sangue con >500 U/ml Valori di CA-125 come indicatore del carcinoma ovarico. Una goccia del campione di allenamento è stata posta in un piccolo piatto di plastica all’interno di ciascuna scatola., I campioni di sangue utilizzati durante il periodo di allenamento non sono stati utilizzati nei test. I cani sono stati utilizzati nell’esperimento con il permesso del Regional Ethical Review Board di Göteborg, numero di licenza: S-220-08. I cani avevano libero accesso all’acqua dolce durante l’allenamento e le ore di test. Dopo 2 ore di lavoro, i cani sono stati camminati o hanno avuto 20 minuti di tempo libero.
Selezione del paziente
I pazienti sono stati selezionati per l’inclusione in questo studio retrospettivo dai database della clinica e della bio-banca. Quest’ultimo contiene sangue e tessuto tumorale da pazienti con cancro ovarico., Il materiale è stato raccolto dopo aver ottenuto il permesso dal singolo paziente ed è stato regolato dal programma di trattamento per il cancro ovarico nella Svezia occidentale. La selezione del paziente è stata effettuata prima dal database della clinica, quindi i risultati sono stati correlati con il database bio-bank per ottenere campioni di sangue.
Il principale criterio di selezione applicato a tutti i pazienti in studio era la remissione completa clinica (CR) prima del sesto ciclo (finale) programmato di chemioterapia. I pazienti selezionati per la serie I sono stati divisi in 3 gruppi., Il gruppo A includeva pazienti con sopravvivenza libera da recidive a 3 anni, il gruppo B includeva pazienti che avevano avuto recidiva entro 6 mesi dall’ultima sessione di trattamento; e per il gruppo C includeva pazienti che avevano avuto recidiva tra 1 e 2 anni dopo il trattamento. Un totale di 66 pazienti con CR negli anni 2001-2007 sono stati selezionati nella serie 1. Tutti provenivano dalla zona di Göteborg ed erano anche nel database bio-banca. Quarantadue pazienti avevano campioni in una biobanca corrispondente a uno dei tre criteri di selezione secondari per l’inclusione nel gruppo A, B o C., La selezione per la serie II è stata effettuata utilizzando solo il database della biobanca.
Campioni di sangue
Campioni di sangue sono stati raccolti da pazienti che vivono nella zona di Göteborg, nella Svezia occidentale. La popolazione è di circa 600.000. Il programma di trattamento per il cancro ovarico in richiede l’analisi CA-125 in due occasioni. In primo luogo, prima o subito dopo l’intervento chirurgico primario, e il secondo prima del sesto ciclo di trattamento chemioterapico. Tuttavia, come al solito nel programma di trattamento per il carcinoma ovarico, il livello di CA-125 non è stato incluso nel follow-up, sebbene i medici abbiano la possibilità di controllarlo., Campioni di sangue con>500 U/ml CA-125 valori sono stati utilizzati per l’addestramento del cane, con una goccia di essere collocato in un piccolo piatto di plastica all’interno di ogni scatola. I campioni di sangue utilizzati durante il periodo di allenamento non sono stati utilizzati nei test.
Campioni di sangue di riferimento
Il materiale per il gruppo di riferimento è stato selezionato dal database bio-bank. Le variabili clinicopatologiche non sono state prese in considerazione perché i nostri precedenti risultati dello studio hanno mostrato che non influenzavano la sensibilità di rilevamento dei cani ., Un totale di 62 campioni (42 per la Serie I e 20 per la Serie II), da diversi individui, con CA-125 valori >200 U/ml sono stati selezionati in modo casuale come materiale di riferimento in Serie I e II.
Test di campioni di sangue in Serie I
Quaranta-due campioni sono stati raccolti e utilizzati come materiale di prova in Serie I. Questi campioni di sangue sono stati prelevati prima del sesto ciclo di chemioterapia. I pazienti sono stati divisi in tre gruppi., Il gruppo A era composto da 13 pazienti con CR, sopravvivenza libera da recidive a 3 anni e valori CA-125 normali (<35 U/ml) prima dell’ultimo ciclo di trattamento. Il gruppo B era composto da 12 pazienti che avevano una CR, recidivata entro 6 mesi, e tutti tranne 2 (61 U/ml; <200 U/ml) avevano CA-125 <35UI. Il gruppo C era composto da 17 pazienti con CR, recidiva tra 1 e 2 anni e valori normali di CA-125. Istopatologia tumorale, stadio e grado variavano all’interno dei gruppi.,
Campioni di sangue con>500 U / ml CA-125 valori sono stati utilizzati per l’allenamento, con una goccia di essere collocato in un piccolo piatto di plastica all’interno di ogni scatola. I campioni di sangue utilizzati durante il periodo di allenamento non sono stati utilizzati nei test.
Test di campioni di sangue nella serie II
I campioni sono stati prelevati 3 e 6 mesi dopo il sesto ciclo di chemioterapia finale. Sfortunatamente, non abbiamo potuto seguire i pazienti della serie I, Gruppo A perché nessuno di loro aveva sangue nella banca del sangue. Abbiamo raccolto sangue da altri 10 pazienti che sono stati seguiti regolarmente., L’età media del donatore era di 65 anni (intervallo, 38-78 anni).
Campioni di sangue di controllo
I campioni di controllo sono stati raccolti durante i 2 anni tra il 2007 e il 2009, principalmente da volontari del personale medico femminile a Göteborg. I criteri di inclusione erano che i pazienti si sentivano sani, non erano in stato di gravidanza ed erano privi di malattie ginecologiche. I materiali di controllo e di prova non sono stati abbinati all’età. Le persone più giovani sono state scelte consapevolmente come fonte di campioni di controllo per ridurre il rischio di presenza di cancro ovarico asintomatico., Pertanto, sia i gruppi di controllo che i gruppi di test avevano campioni di donne pre e postmenopausali.
Preparazione del campione
I campioni di sangue sono stati raccolti in tubi EDTA e quindi centrifugati a 3000 giri / min per 10 min con vasi di plasma sopra i piccoli tubi di plastica. Dopo la centrifugazione, il plasma è stato diviso in due parti, una per l’analisi CA-125 e l’altra per gli esperimenti successivi. Quest’ultima parte è stata mantenuta a -80°C nella banca del tumore (numero di licenza del Comitato etico: S-220-08, Regional Ethical Review Board a Göteborg)., I campioni di plasma di controllo sono stati elaborati e conservati in modo identico agli obiettivi. Tuttavia, i tubi con sangue di controllo sono stati conservati separatamente. L’età media del donatore era di 45 anni (intervallo, 29-65 anni).
Test design
I test sono stati eseguiti in doppio cieco come descritto in precedenza . Per riassumere, sia il leader del test che il gestore sono stati accecati nella posizione dei campioni bersaglio ed erano presenti nella posizione del test solo quando i cani stavano lavorando. I cani sono stati testati in due serie. La serie I copriva 4 giorni (2 giorni per occasione), mentre la serie II copriva 2 giorni., Dieci corse sono state eseguite ogni giorno, ad eccezione di un giorno nella serie I quando sono state eseguite 11 corse. Ogni corsa comprendeva sette scatole, poste in un cerchio a circa 2 m l’una dall’altra. Ogni scatola conteneva una goccia di plasma; cinque contenevano materiali di controllo, uno conteneva un campione di prova e uno conteneva un campione di riferimento. I materiali di riferimento sono stati presi prima, o poco dopo l’operazione primaria, e quindi avevano un’alta concentrazione di molecole di odore. Il posizionamento delle caselle di destinazione e di riferimento è stato modificato da un assistente tra ogni esecuzione. Ogni scatola è stata pulita con alcool tra le corse., I test sono stati documentati su carta e DVD dal leader del test e da un assistente .
Risposte del cane
Una risposta positiva è stata definita come indicante la scatola bersaglio grattando con la zampa anteriore, sdraiandosi e annusandola (e non indicando i campioni di controllo). Una risposta negativa è stata definita come sniffing e indicando una scatola di controllo e non indicando il bersaglio. Una risposta incerta è stata definita come fermarsi alla scatola, annusarla, graffiarla e possibilmente abbaiare, ma andare dritto e non sdraiarsi.,
Trattamento dei carcinomi ovarici
In linea con il programma di trattamento standard in Svezia occidentale, i pazienti sono stati trattati con isterectomia totale, salpingo-ooforectomia bilaterale, omentectomia, biopsie peritoneali multiple e lavaggi peritoneali con citologia. Circa 4 settimane dopo l’intervento chirurgico primario è stata somministrata la prima combinazione di carboplatino, ciclofosfamide ed epirubicina. Un totale di sei corsi sono stati somministrati a intervalli di 4 settimane.,
Metodi statistici
I dati grezzi sono stati riassunti come sensibilità (la probabilità condizionale del cane che indica il cancro quando la condizione era presente) e specificità del test (la probabilità condizionale del cane che ignora un campione da un donatore sano). Sensibilità e specificità forniscono informazioni sulla capacità di classificazione generale dei cani.
Sono state calcolate anche le probabilità predittive positive e negative che il test avrebbe dato la diagnosi corretta. Le stime puntuali sono state calcolate con intervalli di confidenza del 95%., Sia la sensibilità che la specificità sono state espresse come proporzioni, quindi le tecniche standard per le proporzioni potrebbero essere applicate per l’inferenza statistica. Gli intervalli di confidenza sono stati basati sull’approssimazione normale, p ± 1,96 p 1 − p / n dove p è la sensibilità stimata, la rispettiva specificità e n è il numero di cicli di test.