Raccolta ed elaborazione del sangue
Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta di sangue umano da volontari sani erano in conformità con il Comitato etico di ricerca umana dell’Università di Sydney (approvazione HREC 2014/244) e, Tutte le procedure che coinvolgono la raccolta di sangue umano da pazienti ECMO erano in conformità con l’etica Alfred Hospital, Monash University Comitato permanente per la ricerca negli esseri umani (approvazione 388/13) e il consenso informato è stato ottenuto da tutti gli individui. Tutte le procedure erano conformi alla Dichiarazione di Helsinki del 1983. Il sangue è stato raccolto da venesection utilizzando un ago Terumo a farfalla da 21 g da 10 donatori sani senza farmaci (quattro maschi, sei femmine, 22-58 anni)., I primi 5 ml di sangue sono stati scartati per evitare qualsiasi trombina che potrebbe essere stata generata intorno al sito di inserimento dell’ago e quindi aspirata in provette contenenti 3,2% v/v citrato di sodio. Il sangue di otto pazienti di un singolo centro che avevano il supporto ECMO (quattro maschi, quattro femmine, 34-67 anni) è stato prelevato nei tubi ACD-A (BD Vacutainer)., I pazienti con supporto ECMO hanno ricevuto farmaci anti-coagulazione e/o anti-piastrinici basati su a discrezione dei medici o linee guida istituzionali in cui i pazienti in genere hanno iniziato a prendere warfarin, target international Normalized ratio (INR) 2-3, con infusione di eparina e terapia con aspirina, nonché dipiridamolo per coloro che sono considerati ad alto rischio di trombosi. Il plasma è stato preparato mediante centrifugazione due volte a 800 × g per 20 min a temperatura ambiente., In alcune occasioni, il plasma donatore sano è stato tosato a velocità di 2000 s−1 o 10000 s-1 per 5 min a temperatura ambiente utilizzando un reometro Kinexus pro+.
Raccolta del fibrinogeno degli epatociti
La linea cellulare HepG2 del cancro del fegato umano (ATCC, HB-8065) è stata coltivata in DMEM, siero di vitello fetale al 10% e glutamax al 5% di CO2 e 37 °C. Le cellule alla confluenza 80-90% sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato, incubate per 18 h in DMEM senza siero al 5% di CO2 e 37 °C o in una camera ipossica all ‘ 1% di O2, 5% CO2 e 37 °C., Il mezzo condizionato è stato raccolto (1 mL per 4 × 106 cellule) e il fibrinogeno secreto immediatamente elaborato come descritto di seguito.
Test di fibrinogeno e fibrina
I campioni di plasma non sono stati trattati o incubati con trombina e / o l’inibitore della polimerizzazione della fibrina, GPRP (Sigma). La fibrina è stata preparata in 1 mL di plasma aggiungendo 50 unità di trombina bovina (Sigma) e 10 mm CaCl2 e MgCl2 per 40 min a 22 °C. I polimeri di fibrina sono stati raccolti utilizzando un’asta di plastica., In un esperimento, il plasma (2 mL) è stato incubato con 27 unità/mL di trombina e 10 mm CaCl2 e MgCl2 per 40 min a 22 °C e il polimero di fibrina raccolto su un’asta di plastica e rimosso. Il plasma impoverito è stato incubato con un’altra aliquota di 27 unità/ml di trombina e il nuovo polimero di fibrina raccolto e rimosso. Un’aliquota di plasma (0,2 mL) è stata campionata prima e dopo l’aggiunta di entrambe le partite di trombina, 150 µM di d-fenilalanil-prolil-arginil clorometilchetone (PPACK, Sigma) aggiunto per inibire l’attività della trombina e i campioni incubati per 16 ore a 22 °C., Il contenuto di fibrinogeno dei campioni plasmatici è stato stimato raccogliendo la proteina su perle policlonali rivestite con anticorpi anti-fibrinogeno (vedere la sezione seguente), risolvendo il fibrinogeno su SDS-PAGE e colorando con Coomassie colloidale. In un altro esperimento, il plasma è stato incubato con 8 mM GPRP (Sigma) per 5 min a 22 °C prima dell’aggiunta di 50 unità/mL di trombina per 60 min a 22 °C. La reazione è stata bloccata con 150 µM di PPACK per 10 minuti a 22 °C. Purificato fibrinogens sono state isolate da donatori sani di plasma fresco congelato da beta-alanina precipitation32 o reperibili in commercio (Sigma F4883).,
Quantificazione degli stati redox dei legami fibrinogeno e disolfuro di fibrina
Le Dynabeads (2 mg, Life Technologies) sono state rivestite con 16 µg di anticorpi anti-fibrinogeno policlonali (Dako, Cat A0080, Lot 00015063) in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato su una ruota rotante per 1 ora a 22 °C e l’anticorpo in eccesso rimosso lavando tre volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato. Il plasma (0,7 mL) o il mezzo condizionato da HepG2 (4,5 mL) è stato incubato con 2 mg di perle rivestite su una ruota rotante per 1 ora a 22 °C., Le perle sono state raccolte usando un magnete, il plasma in eccesso aspirato per ridurre il volume e incubate in 0,3 ml di 5 mM 12C-IPA in soluzione salina tamponata con fosfato contenente 10% DMSO per 1 ora a 22 °C al buio per alchilare i cistioli non accoppiati nelle proteine. I supernatanti sono stati aspirati e le perle incubate con tampone campione NuPAGE LDS (Life Technologies) contenente ulteriori 5 mM 12C-IPA per 30 min a 60 °C. I supernatanti sono stati risolti su SDS-PAGE., I polimeri di fibrina generati nel plasma sono stati raccolti su un’asta di plastica e immediatamente immersi in 1 mL di 5 mM 12C-IPA in soluzione salina tamponata con fosfato contenente 10% DMSO per 1 ora a 22 °C al buio. La fibrina è stata lavata 3 volte con soluzione salina tampone fosfato prima di sciogliere il polimero in 1 mL di acido acetico da 20 mm per 24 ore a 22 °C. Venti microlitri della soluzione sono stati incubati con tampone campione NuPAGE LDS (Life Technologies) contenente 5 mM 12C-IPA per 30 min a 60 °C e le proteine sono state risolte su SDS-PAGE., Il fibrinogeno purificato (12 µg) è stato incubato con 5 mM 12C-IPA in soluzione salina tamponata con fosfato contenente 10% DMSO per 1 ora a 22 °C al buio e la proteina si è risolta su SDS-PAGE.
I gel SDS-PAGE sono stati colorati con coomassie colloidale (Sigma) e le bande di fibrina(ogen) asportate, destinate, essiccate, incubate con ditiotreitolo di 40 mm e lavate14. Le fette di gel sono state incubate con 5 mM 13C-IPA (Isotopi Cambridge) per 1 h a 22 °C al buio per alchilare il legame disolfuro Cys, lavato e asciugato prima della digestione delle proteine con 12.,5 ng/µL di tripsina (Promega) in 25 mm NH4CO2 durante la notte a 25 °C. I peptidi sono stati eluiti dalle fette con acido formico al 5%, acetonitrile al 50%. La cromatografia nano-liquida (nano-LC) è stata eseguita utilizzando un sistema Ultimate 3000 HPLC e autocampionatore (Dionex). I campioni sono stati iniettati in una colonna nano-LC senza frit (75 µm x ~ 12 cm) contenente media C18 (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) e riscaldati a 45 °C per tutte le esecuzioni. I peptidi sono stati eluiti utilizzando un gradiente lineare su 52 min, ad una portata di 0,2 µL / min. Fase mobile A consisteva di 0.,acido formico all ‘ 1% in H2O, mentre la fase mobile B consisteva in acetonitrile:H2O (8:2) con acido formico allo 0,1%. Il gradiente era: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B e 52 min 2% B. L’alta tensione (2000 V) è stata applicata a un tee a basso volume (Upchurch Scientific) e la punta della colonna posizionata a ~0,5 cm dal capillare riscaldato (T = 275 °C) di uno spettrometro di massa LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron). Gli ioni positivi sono stati generati dalla ionizzazione elettrospray e lo spettrometro di massa ha funzionato in modalità di acquisizione dipendente dai dati., Gli spettri MS a scansione completa sono stati acquisiti (m/z 350-1750) dall’Orbitrap ad una risoluzione di 30.000. I 15 ioni più abbondanti (>5000 conteggi) con stati di carica ≥ +2 sono stati sequenzialmente isolati e frammentati all’interno della trappola ionica lineare utilizzando dissociazione collisionalmente indotta con un’attivazione q = 0,25 e un tempo di attivazione di 10 ms ad un valore target di 30.000 ioni. M / z rapporti selezionati per MS / MS sono stati esclusi dinamicamente per 35 s. Ion Trap Zoom AGC Target: 3000.00. Trappola ionica pieno AGC Target: 30000.00. Trappola Ionica SIM AGC Target: 10000.00. Trappola ionica MSn AGC Target: 10000.00., I dati sono stati analizzati utilizzando Mascot Daemon (versione 2.5.0, Matrix Science) contro il database Swissprot. I parametri di ricerca erano tolleranza precursore di 6 ppm e tolleranze ioniche del prodotto di ±0,6 Da, e derivato iodoacetanilide (Cys), derivato iodoacetanilide 13C (Cys), ossidazione (Met) selezionati come modifiche variabili con scissione triptica completa fino a tre scollature mancate. Con l’elenco dei peptidi contenenti cisteina identificati utilizzando Mascot, il loro rapporto massa/carica monoisotopica (m / z) di +2, +3 e +4 viene calcolato utilizzando MS-Product (Versione v 6.2.2, Protein Prospector Tools)., Cys etichettato con 12C-IPA o 13C-IPA ha una massa di 133.05276 o 139.07289, rispettivamente. Sono stati analizzati trenta peptidi contenenti Cys (tabelle supplementari 1 e 2). Le diverse forme redox dei residui di Cys sono state quantificate dall’abbondanza di ioni relativi di peptidi etichettati con 12C-IPA e / o 13C-IPA. Per calcolare l’abbondanza di ioni di peptidi, i cromatogrammi ionici estratti sono stati generati utilizzando Xcalibur Qual Browser (v2.1.0; Thermo Scientific). L’area è stata calcolata utilizzando la funzione di rilevamento automatico dei picchi integrata nel software., I dati sono stati regolarmente ricercati per peptidi contenenti Cys tioli liberi e questi non sono stati rilevati, il che indica che l’alchilazione di residui di Cys non accoppiati da 12C-IPA o 13C-IPA era completa nella proteina.
Analisi del peptide legato al disolfuro di fibrinogeno
Il plasma donatore sano (0,7 ml) è stato incubato con Dynabeads policlonali anti-fibrinogeno rivestite con anticorpi su una ruota rotante per 1 ora a 22 °C. Le perle sono state raccolte, il plasma in eccesso aspirato e 0,3 ml di 5 mM 12C-IPA in soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 10% di DMSO è stato aggiunto e incubato per 1 ora a 22 °C al buio., Quindi il surnatante è stato aspirato, le perle incubate con tampone di campione NuPAGE LDS per 30 min a 60 °C e i supernatanti risolti su SDS-PAGE. Le fette di gel contenenti il fibrinogeno sono state lavate e asciugate prima della digestione con tripsina 12 ng / µL (Promega) per 4 h a 37 °C. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo acido formico 5% (v/v) e peptidi eluiti dalle fette di gel con acido formico 5% e acetonitrile 50% (v/v). Peptidi in 0.,l ‘ 1% di acido formico (volume finale 12 µL) è stato risolto su una colonna analitica in fase inversa C18 di 35 cm × 75 µm utilizzando un gradiente di acetonitrile del 2-35% su 22 min ad una portata di 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) e analizzato su uno spettrometro di massa LTQ Orbitrap Velos come descritto sopra. I peptidi legati al disolfuro sono stati ricercati contro la sequenza di fibrinogeno umano utilizzando il software di analisi Byonic (versione 3.9-7, metriche proteiche) con un tasso di scoperta falsa dell ‘ 1%. Tutti i peptidi legati al disolfuro sono stati controllati manualmente per la precisione., La tolleranza di massa del precursore e la tolleranza del frammento sono state fissate rispettivamente a 10 ppm e 0,6 Da. Le modificazioni variabili sono state definite come ossidato Met, ossidato Cys (mono, di e tri) e glutationylated Cys con scissione completa della tripsina di fino a tre fenditure mancate.
Test di funzionalità del fibrinogeno
Il fibrinogeno purificato (0,2 ml di 10 mg / mL in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) è stato incubato con 5 mM 12C-IPA per 1 ora a 22 °C al buio per alchilare i cistioli non accoppiati nella proteina., L’IPA non reagito è stato rimosso utilizzando una colonna di dissalazione spin Zeba da 7 kDa MWCO (Thermo Fisher). Fibrinogeno o fibrinogeno-IPA (1,1 mg/mL in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) è stato incubato con 1 unità/mL di trombina bovina (Sigma) per 5 ore a 22 °C in un volume totale di 0,2 mL in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. I polimeri di fibrina sono stati pellettati a 13.000 × g per 15 minuti e misurata la concentrazione di fibrinogeno rimanente nel surnatante. La funzionalità è espressa al % di fibrinogeno consumato nella formazione di polimeri di fibrina.,
La formazione di polimeri di fibrina misurata mediante dispersione della luce
Fibrinogeno purificato o fibrinogeno-IPA (1 mg/mL in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) è stata incubata con 1 unità / mL di trombina bovina (Sigma). L’aumento dell’assorbanza a 350 nm è stato registrato ogni 30 s per 15 min.
La struttura del polimero di fibrina misurata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
Fibrinogeno o fibrinogeno-IPA (1 mg/mL in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) è stata incubata con 1 unità / mL di trombina bovina (Sigma) per 2 ore a 22 °C in un volume totale di 0,2 mL., I polimeri di fibrina sono stati risciacquati due volte con soluzione salina tampone fosfato da 0,1 M (PBS), fissati con glutaraldeide al 2,5% in PBS durante la notte a 4 °C, post-fissati con OsO4 all ‘ 1% in PBS, disidratati con una serie graduata di etanolo e successivamente essiccati con un Leica EM CPD300. I campioni sono stati ricoperti di sputter con oro a 15 nm (K550X, Emitech) e fotografati con un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo Zeiss SigmaHD. I micrografi SEM sono stati registrati con una tensione di accelerazione di 5 kV e una distanza di lavoro di 5 mm. I diametri delle fibre sono stati misurati utilizzando ImageJ.,
Fibrina polimero test di permeazione
il Fibrinogeno o fibrinogeno-IPA (1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) è stato incubato con 1 unità/mL di trombina bovina (Sigma) per 2 ore a 22 °C in un volume totale di 0,2 mL in polipropilene colonne per cromatografia, con un diametro interno di 4,6 mm. Le colonne sono state sovrapposte con 0,8 mL di Hepes buffer e luminoso (J) è stata calcolata in base al peso delle gocce che pullulavano in 20 min., La permeazione (Darcy) constant33 è stato calcolato dal rapporto, Ks = JƞA/LP, dove J è il flusso (cm3/s), è la viscosità del buffer (0.01 equilibrio a temperatura ambiente), A è la sezione del coagulo (0.17 cm2), L è la lunghezza del coagulo (1.1 cm), e P è la pressione idrostatica (1,018,218 dyne/cm2).
Test di compattazione dei polimeri di fibrina
Fibrinogeno o fibrinogeno-IPA (1 mg/mL in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) è stato incubato con 1 unità / mL di trombina bovina (Sigma) per 16 h a 22 °C in un volume totale di 0,5 mL in 1.,Provette per microcentrifuga da 5 mL precedentemente rivestite con 10 mg/mL PEG-20000 in acqua e asciugate all’aria. I polimeri di fibrina sono stati centrifugati a 13.000 × g per 5-2400 s e il volume del fluido estruso dal polimero misurato.
Fibrinolisi dosaggio
il Fibrinogeno o fibrinogeno-IPA (1,8 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) è stato incubato con 1 unità/mL di trombina bovina (Sigma) per 2 ore a 22 °C in un volume totale di 0,5 mL in 24 piastre (15.6 mm di diametro) per 2 h a 22 °C. Un’aliquota della plasmina (5 µL di 0.,59 µM) è stato aggiunto al centro dei pozzetti e le piastre incubate per 18 h a 37 °C in un ambiente umido. Le aree di lisi sono state determinate dalla media di due diametri misurati ad angolo retto.
Quantificazione degli stati redox dei legami disolfuro di α2-macroglobulina
I 10 plasmi donatori sani sopra descritti per l’analisi del fibrinogeno sono stati impiegati per l’analisi di α2-macroglobulina utilizzando le stesse procedure. Plasma (0.,7 ml) è stato incubato con anticorpi policlonali anti-α2-macroglobulina (Dako, Cat Q0102, Lot 20068567)-rivestiti Dynabeads (Life Technologies) su una ruota rotante per 1 h a 22 °C. Le perle sono state raccolte, il plasma in eccesso aspirato e incubato in 0,3 ml di 5 mM 12C-IPA in soluzione salina tamponata con fosfato contenente 10% DMSO per 1 h a 22 °C al buio per alchilare i citioli non accoppiati nelle proteine. I supernatanti sono stati aspirati e le perle incubate con tampone campione NuPAGE LDS (Life Technologies) contenente ulteriori 5 mM 12C-IPA per 30 min a 60 °C. I supernatanti sono stati risolti su SDS-PAGE., I gel SDS-PAGE sono stati colorati con coomassie colloidale (Sigma) e la banda α2-macroglobulina è stata asportata, destinata, essiccata, incubata con ditiotreitolo 40 mm e lavata14. Le fette di gel sono state incubate con 5 mm 13C-IPA (Isotopi Cambridge) per 1 h a 22 °C al buio per alchilare il legame disolfuro Cys, lavato e asciugato prima della digestione delle proteine con 12,5 ng/µl di tripsina (Promega) in 25 mm NH4CO2 durante la notte a 25 °C. I peptidi sono stati eluiti dalle fette con acido formico al 5%, acetonitrile al 50%., La cromatografia liquida, la spettrometria di massa e l’analisi dei dati sono state eseguite come descritto per il fibrinogeno34. Sono stati analizzati 17 peptidi contenenti Cys (tabelle supplementari 2 e 4). Le diverse forme redox dei residui di Cys sono state quantificate dall’abbondanza di ioni relativi di peptidi etichettati con 12C-IPA e / o 13C-IPA.
Reporting summary
Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.