Crescita e dinamica dei nutrienti di Ochromonas sp.,, ceppo BG-1
Si ritiene che la fagotrofia da parte dei flagellati fototrofi conferisca significativi vantaggi ecologici alle alghe che mostrano il comportamento (Flynn e Mitra, 2009), ma sembrano anche esserci limitazioni (sebbene in gran parte non caratterizzate) per condurre un’alimentazione mista simultaneamente in una singola cellula (Raven, 1997). Questi vincoli possono comportare costi o compromessi per il mantenimento di macchinari dual cellulari (rispetto ai concorrenti specializzati), o forse cross-talk tra percorsi biochimici anabolici e catabolici che confondono le prestazioni di entrambe le attività contemporaneamente., Sfortunatamente, non ci sono praticamente informazioni quantitative sui costi e sui benefici del comportamento mixotrofico, né se entrambi i processi siano eseguiti sequenzialmente o simultaneamente da queste specie. Il partizionamento temporale potrebbe essere un meccanismo per mantenere entrambe le abilità in celle minute (anche se mettere un processo ‘in attesa’ in un dato momento)., Valutare se entrambi i comportamenti si verificano contemporaneamente, i benefici fisiologici specifici per la nutrizione eterotrofica nelle alghe mixotrofiche e la reattività di questo comportamento alle variabili abiotiche e biotiche sono aspetti della nutrizione mixotrofica che sono stati difficili da stabilire utilizzando approcci e metodi tradizionali.
Abbiamo studiato il mixotrophic chrysophyte Ochromonas sp., ceppo BG-1 perché può essere coltivato in coltura axenica (senza batteri) ed è stato precedentemente segnalato come un organismo prevalentemente eterotrofico che raggiunge alti tassi di crescita solo in presenza di batteri (Sanders et al., 2001). La crescita nella coltura axenica ha impedito di complicare potenzialmente le interazioni biologiche e i flussi elementari derivanti dalle attività di altri microrganismi viventi nelle colture, consentendo in tal modo un confronto tra nanoSIMI e misurazioni IRMS di massa e una migliore comprensione delle fonti specifiche di carbonio e azoto utilizzate per la crescita dall’alga.,
Inoltre, l’uso di una singola fonte inorganica di azoto ha semplificato il nostro progetto sperimentale in modo che le uniche fonti di azoto nel mezzo fossero ammonio o HKB. Le alghe generalmente possiedono meccanismi per l’assorbimento e l’assimilazione di ammonio e nitrato, ma i dati trascrittomici indicano che alcuni crisofiti, tra cui Ochromonas sp. ceppo BG-1, potrebbe mancare la capacità genetica per l’assimilazione dei nitrati (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Inoltre, il tampone MES non è stato aggiunto al mezzo nei nostri esperimenti perché questo avrebbe potuto fornire una fonte alternativa di azoto. MES potrebbe anche aver costituito una fonte di carbonio organico per l’alga (Sanders et al., 2001), e la sua eliminazione ha assicurato che le uniche fonti di carbonio nel mezzo erano bicarbonato o HKB. L’analisi trascrittomica da esperimenti condotti allo stesso modo di quelli presentati in questo manoscritto mostra che il macchinario fotosintetico di Ochromonas sp. il ceppo BG-1 è espresso e sovraregolato in presenza di luce (Lie et al., 2017)., Questo approccio semplificato, combinato con l’etichettatura isotopica stabile, ci ha permesso di determinare quali fonti di azoto e carbonio sono state utilizzate per la crescita dall’alga.
Tassi di crescita significativi di Ochromonas nel presente studio sono stati raggiunti solo mentre gli HKB erano abbondanti come preda (Figura 1a). La dinamica di Chl a nella coltura riflette anche gli alti tassi di crescita dovuti al pascolo su HKB, poiché la concentrazione di Chl a cell−1 è diminuita di un ordine di grandezza durante le prime 48 ore di incubazione per colture coltivate alla luce e nell’oscurità continua (Figura 1d)., Questi cambiamenti nella clorofilla cellulare potrebbero essere correlati a una diluizione di Chl a all’interno delle cellule a causa degli alti tassi di crescita dell’alga (Hansen et al., 2000), in modo che la riduzione di Chl a cell−1 fosse una conseguenza dei tassi di crescita rapida dell’alga e non una riduzione diretta del tasso di biosintesi della clorofilla. Tuttavia, è anche possibile che ci fosse una certa regolazione della biosintesi della clorofilla quando erano presenti HKB poiché l’analisi trascrittomica su questa alga suggerisce una sovraregolazione dei geni legati alla sintesi della clorofilla in presenza di luce quando gli HKB erano esauriti (Lie et al., 2017)., In ogni caso, queste osservazioni sono in accordo con studi precedenti di Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) che ha osservato una capacità eterotrofica ben sviluppata, suggerendo che la fissazione del carbonio e forse altre strutture cellulari e processi coinvolti nella fotosintesi sono ridotti quando crescono mixotroficamente, come osservato per alcune altre alghe (Wan et al., 2011).
Ammonio disciolto, così come fosfato, accumulato nelle colture di ochromonas durante le prime 48 ore degli esperimenti, quando gli HKB sono stati attivamente sfiorati (Figura 2)., Questo risultato indica che l’eccesso di azoto e fosforo da HKB pascolato sono stati escreti dall’alga. I calcoli del bilancio di massa basati sulle variazioni dell’abbondanza di prede/alghe e del loro contenuto di azoto cellulare hanno indicato che fino al 50% dell’azoto contenuto nell’HKB consumato è stato assimilato dall’alga, mentre una notevole quantità dell’azoto in eccesso è stata rilasciata principalmente come ammonio durante il periodo di pascolo batterico attivo (Figura 2)., Questi valori per l’assimilazione dell’azoto (e l’escrezione) sono coerenti con le efficienze di assimilazione di protisti eterotrofi di dimensioni simili (Taylor, 1982; Caron e Goldman, 1990), coerenti con la conclusione che l’Ochromonas stava crescendo prevalentemente come eterotropo quando le prede erano abbondanti. Inoltre, le analisi trascrittomiche hanno dimostrato che diversi trasportatori di ammonio sono espressi da Ochromonas sp. ceppo BG-1 che cresce su HKB rispetto alla crescita dopo che i batteri sono stati sfiorati a abbondanze molto basse (Lie et al., 2017)., Sembra quindi che i trasportatori per l’esportazione di ammonio fuori dalla cellula possano essere diversi da quelli utilizzati per l’assorbimento di ammonio, come è stato osservato per altri organismi (Shnaiderman et al., 2013).
È interessante notare che le concentrazioni di ammonio, ma non di fosfato, diminuivano nel mezzo una volta che l’HKB era stato rimosso dal pascolo (cioè dopo 48 h; Figura 2) quando Ochromonas veniva coltivato nella luce., Questo risultato sembra indicare che l’alga ha assunto attivamente ammonio (ma non fosfato) dal mezzo quando i batteri non erano più disponibili e la fotosintesi è stata indotta (Figura 1d). Al contrario, sia l’ammonio che il fosfato nelle colture coltivate al buio hanno continuato a salire durante l’esperimento (linee tratteggiate in Figura 2). Nessuna significativa crescita netta della popolazione algale si è verificata dopo l’esaurimento delle prede anche alla luce, e la spiegazione della dicotomia nell’assorbimento di questi due elementi non è chiara., Ipotizziamo che l’ammonio sia stato preso perché era specificamente richiesto per ricostruire il macchinario fotosintetico della cellula.
La continua comparsa di fosfato nel terreno di coltura durante la parte successiva degli esperimenti contrasta con gli studi di alcune altre specie di Ochromonas che hanno riportato un assorbimento di fosfato quando l’alga sta crescendo autotroficamente (Rothhaupt, 1996)., La mancanza di assorbimento del fosfato da ceppo BG-1 potrebbe indicare che questo Ochromonas era incapace di un efficace assorbimento del fosfato (che potrebbe anche spiegare, in parte, i poveri phototrophic capacità di crescita di questo ceppo), o che il fosforo non era necessaria in quantità significative per il cellulare riorganizzazione connessi con il cambiamento phototrophic crescita, e quindi l’assorbimento non è stato stimolato la modifica phototrophy., È improbabile che i continui aumenti della concentrazione di fosfato siano dovuti alla decomposizione di composti organici del fosforo disciolti nel mezzo perché le colture non avevano batteri vivi.
Inferenze da esperimenti di sonda isotopica stabile
L’analisi isotopica stabile (nanoSIMS e bulk elemental analysis-IRMS) ha rivelato che entrambi i substrati inorganici (13C-bicarbonato e 15N-ammonio) e HKB marcato con 13C / 15N sono stati assimilati da Ochromonas, contribuendo all’arricchimento cellulare 15N e 13C dopo 48 ore di incubazione (Figura 4)., Tuttavia, l’entità dell’arricchimento da substrati inorganici o HKB ha indicato che, durante la crescita mixotrofica, le fonti primarie di carbonio e azoto erano derivate dalla fagotrofia. Il bilancio di massa isotopica indicava che l ’88-95% dell’azoto e l’ 84-99% del carbonio erano derivati da HKB quando Ochromonas cresceva mixotroficamente alla luce. Un arricchimento di 13C è stato osservato nelle alghe coltivate alla luce rispetto al buio (Esperimento 1 vs esperimento 3) quando era disponibile 13C-bicarbonato (Figura 4)., Tuttavia, il contributo calcolato della fissazione fotosintetica del carbonio era solo l ‘ 1-10% del carbonio assimilato alla biomassa. La maggiore efficienza di incorporazione di azoto dalla preda osservata nella luce rispetto all’oscurità continua (Figura 3; Esperimenti 1, 2 vs Esperimento 3) suggerisce che la luce ha giocato un ruolo, anche se minore, nell’efficienza fagotrofica dell’alga., Pertanto, nonostante le presunte riduzioni del macchinario fotosintetico di Ochromonas che cresce fagotroficamente su HKB (come evidenziato dalle basse quote cellulari di Chl a; Figura 1d), la luce ha avuto un impatto minore e positivo sulla nutrizione algale. Poiché la quantità di carbonio fissata dalla fotosintesi rappresentava una piccola frazione di carbonio assimilata dall’alga quando cresce su HKB, ipotizziamo che l’apparato fotosintetico potrebbe fornire energia piuttosto che carbonio per il materiale cellulare, come è stato ipotizzato per Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
I nostri calcoli del bilancio di massa isotopica hanno due avvertimenti. In primo luogo, non abbiamo controllato l’evoluzione del pH all’interno delle culture, che avrebbe dato migliori intuizioni sull’equilibrio carbonatico che potrebbe essere stato influenzato dalla respirazione e dalla fissazione del carbonio e dallo scambio con l’atmosfera. Come tale, la nostra stima basata sugli esperimenti che utilizzano carbonio inorganico etichettato potrebbe aver sottovalutato la quantità di carbonio inorganico fissato da Ochromonas sp. BG-1 (1% secondo il bilancio di massa isotopica)., In ogni caso, l’esperimento che utilizza HKB etichettato non dovrebbe essere stato influenzato da questo avvertimento e la stima del 10% di carbonio derivato dal substrato inorganico è probabilmente realistica. In secondo luogo, Ochromonas è considerato un fissatore di carbonio inefficiente a causa della mancanza di meccanismi di concentrazione del carbonio (Maberly et al. 2009) che aumentano la concentrazione di CO2 attraverso il trasporto di CO2 e / o bicarbonato all’enzima RubisCO (Raven et al., 2008). D’altra parte, l’analisi trascrittomica ha dimostrato che il macchinario fotosintetico del ceppo BG-1 è funzionale (Lie et al.,, 2017), e i nostri esperimenti con bicarbonato etichettato hanno mostrato un significativo arricchimento dell’abbondanza frazionaria 13C in Ochromonas (Figure 4 e 5); pertanto, Ochromonas sp. il ceppo BG-1 ha una certa capacità di utilizzare carbonio inorganico, anche se in modo inefficiente.
Tuttavia, la forte attività eterotrofica di ochromonas mentre cresce mixotroficamente è probabile che aumenti il pool intracellulare di CO2 e il suo flusso. Come regola generale, si ritiene che i protisti eterotrofi assimilino il 40% della materia organica ingerita, mentre rilasciano il 30% e respirano un altro 30% (Sleigh, 1989)., Sulla base di questo, la quantità totale di carbonio rilasciato da Ochromonas come CO2 durante la crescita esponenziale potrebbe essere alto come il bicarbonato totale aggiunto all “inizio dell” incubazione, che ha conseguenze per il bilancio di massa isotopica che abbiamo presentato. Se assumiamo che la CO2 isotopicamente arricchita derivata dalla respirazione HKB sia disponibile agli stessi livelli del carbonio inorganico disciolto, l’incubazione eseguita con Ochromonas e HKB etichettato ha indicato che ~84% di carbonio è stato derivato dall’HKB., Fino al 20% del carbonio assimilato derivato da HKB potrebbe effettivamente corrispondere al carbonio che è stato inizialmente respirato e poi fissato da Ochromonas. Se corretto, la respirazione derivata dall’attività fagotrofica agirebbe come un meccanismo di concentrazione di carbonio di sorta per questo Ochromonas. Mentre la fonte primaria di carbonio per Ochromonas che cresce mixotroficamente è stata derivata da HKB, una quantità non trascurabile potrebbe essere stata derivata dalla respirazione e quindi dalla fissazione di CO2 della biomassa batterica.,
Ochromonas ha spostato il suo metabolismo verso l’autotrofia quando incubato alla luce, ma solo dopo aver esaurito l’HKB nelle colture (≈ 48 h di crescita). Questo cambiamento si è riflesso nell’abbondanza frazionaria di massa IRMS 13C per il trattamento utilizzando HKB etichettato in cui è stata osservata una riduzione tra 48 h e 145 h (Esperimento 2 in Figura 5), indicativa dell’incorporazione di carbonio non etichettato nella biomassa algale tramite processi leggeri. I crisofiti sono generalmente considerati poveri fissatori autotrofi del carbonio a causa di meccanismi di concentrazione del carbonio poveri (Maberly et al., 2009)., Tuttavia, questi risultati indicano che c’era un livello significativo di assimilazione del carbonio inorganico. Un confronto tra culture coltivate nella luce (Esperimento 1 in Figura 5) e oscurità continua (Esperimento 3 in Figura 5) ha rivelato che l’abbondanza frazionaria 15N delle culture scure non è cambiata dopo 95 h mentre le culture nella luce hanno continuato ad arricchirsi in 15N, indicando che Ochromonas ha continuato ad assimilare l’azoto per mantenere il suo metabolismo una volta, Questi risultati sono stati coerenti con le diminuzioni osservate nella concentrazione di ammonio nel mezzo durante questo periodo di tempo (Figura 3a), sebbene la continua comparsa di fosfato nel mezzo durante questo periodo sia inspiegabile.
Abbiamo ottenuto un buon accordo generale tra le misurazioni degli isotopi di massa e le misurazioni dei nanosimi per l’azoto, in linea con le osservazioni in studi precedenti (Popa et al., 2007; Orfano e casa, 2009; Kopf et al., 2015; Figura 4c)., Tuttavia, le misurazioni di massa erano leggermente inferiori in termini di valori di abbondanza frazionaria per il carbonio, in particolare per i campioni altamente arricchiti (Figura 4d). Ipotizziamo che le differenze tra i nanoSIMI e le misurazioni degli isotopi di massa per il carbonio possano essere correlate al fatto che i campioni di nanoSIMI sono stati conservati con glutaraldeide, mentre i campioni per l’analisi di massa non lo erano. È stato dimostrato che la fissazione influenza il carbonio cellulare (Musat et al., 2014), anche se ci saremmo aspettati che questo diluisse il 13C nelle misurazioni dei nanoSIMI rispetto ai valori di massa., Una spiegazione più probabile è che le misurazioni a cella singola non siano influenzate da detriti cellulari nella coltura che potrebbero essere meno arricchiti. Il valore di massa 13C può essere diluito da questi componenti rispetto alle misurazioni NANOSIM, il che implica che i dati NANOSIM possono riflettere più accuratamente l’assorbimento di carbonio e azoto da parte delle alghe. Tuttavia, la variabilità da cellula a cellula può anche aver contribuito alle differenze minori tra le misurazioni di massa e nanoSIMI.,
L’uso di nanoSIMS in questo studio rappresenta la sua prima applicazione verso lo studio dei flussi di carbonio e nutrienti in un’alga mixotrofica, e ha permesso una migliore comprensione dell’acquisizione di carbonio ed energia da parte di questa specie e del metabolismo cellulare. I nostri risultati ampliano le informazioni disponibili dalle analisi tradizionali di Ochromonas sp. ceppo BG-1 coltivato in varie condizioni di luce e disponibilità di prede (Sanders et al., 2001), confermando che la maggior parte dell’azoto e del carbonio utilizzati per la crescita sono ottenuti attraverso la sua preda batterica., Sebbene i risultati non possano essere estrapolati direttamente a tutte le specie lungo il continuum delle alghe con diverse strategie mixotrofiche, il nostro lavoro convalida l’uso di esperimenti di sondaggio isotopico stabile e nanoSIMI per comprendere meglio le basi metaboliche della mixotrofia in una specie. Inoltre, fornisce un approccio per valutare la nutrizione mixotrofica nei campioni ambientali. Ochromonas sp. il ceppo BG-1 ha fornito un sistema modello ideale per confrontare l’analisi isotopica di massa con i nanoSIMI perché i batteri sono stati rapidamente rimossi dal pascolo entro le prime 48 ore degli esperimenti., L’accordo tra queste due misurazioni dimostra che i NANOSIM hanno catturato accuratamente la dinamica dell’acquisizione di carbonio e nutrienti in questo mixotrofo, e potrebbero quindi essere applicati in modo più ampio per esplorare la mixotrofia in comunità miste complesse in cui le misure di massa sarebbero insufficienti per catturare queste dinamiche. Questo e futuri studi dettagliati continueranno a produrre miglioramenti nella nostra comprensione della nutrizione delle alghe mixotrofiche.