Vytvoření obrysu plot z přímých experimentálních dat vyžaduje použití proveditelné vysokou propustností metody a značný počet vzorků. Test proto musí být vhodný pro použití v designu desky 96-well., Obecné výhody této miniaturizace z jednotlivých reakčních zkumavek 96-well plates již bylo prokázáno, že pro DNSA a další kolorimetrické testy . Všechny testy použité v této studii byly vhodné pro formát desky 96-well. Pro vytvoření konturového grafu byly enzymové a substrátové směsi inkubovány při osmi různých hladinách pH. Těchto osm úrovní pH byly inkubovány ve 12 různých teplotách pomocí gradient PCR cycler, což v 96 unikátní reakční podmínky. K získání dat byla použita čtečka desek., Výsledky byly transformovány do relativních aktivit s nejvyšší aktivitou na každé desce nastavenou na 100%. Měření byla provedena ve trojím vyhotovení a v průměru hodnoty byly následně transformovány do obrysu plot pomocí SigmaPlot, jak je popsáno v materiálech a metodách části. Činnost (z-osa) je reprezentován jako barvu z fialové do červené, místo normální osa pro zlepšení zobrazení obrysu plot.,
Vyrovnávací paměť systému
Jedním z předpokladů pro spolehlivé stanovení pH a teplotní optima je stabilní vyrovnávací systém, který je vhodný, pokud jde o aktivitu enzymu a téměř odolný vůči pH posun s rostoucí teplotou. Alternativně by tento efekt mohl být zvážen v obrysovém grafu. Vliv teploty na pKa pufrů a tím pH je skutečnost, která by měla být zvážena, zejména u alkalických pufrů, jako je Tris ., Jako požadavek na test, všechny kolísání pH našeho citrát–fosfátový pufr systému byly testovány pro změnu v pH mezi 35 °C a 80 °C (viz Další soubor 4). Všechny nárazníky vykazují mírný pokles pH při stoupající teplotě, přičemž nárazníky při vyšších hodnotách pH vykazují vyšší odchylky. Teplotní závislost se zvyšuje s množstvím fosfátu, které koreluje s teplotními koeficienty fosfátu (−0,0028) a citrátu (0)., Vzhledem k tomu, že změny pH závislé na teplotě všech nárazníků byly jen malé, mohly být zanedbány při sestavování obrysových parcel v rozsahu zde používaných hodnot. Nicméně, pokud jiný nárazníkový systém, s vyšší teplotní koeficient by měl být využit, je možné snadno přizpůsobit obrysu obrázku pro změnu v pH tím, že přiřadí každé vyrovnávací paměti individuální pH při každé teplotě., Tyto hodnoty jsou buď experimentálně stanoveny, jak je popsáno v příslušné části materiálů a metody, nebo odvozeny z teplotních koeficientů, a mohou být proto použity k přizpůsobení osy x (pH) poskytnutého souboru Sigmaplot.
Činnost rozmezí pro stanovení Cel8A
přehled různých enzymů, substrátů, a testy použité v této studii pro vytvoření příslušných contour zkusných ploch je uveden v Tabulce 1.,
Cel8A je celuláza, konkrétně endo-glukanázy z C. thermocellum a byl první enzym glykosid hydrolázy rodina 8 s vyřešena krystalová struktura . V této studii byl enzym inkubován s BBG, aby se ověřila naše navrhovaná metoda pomocí testu DNSA. Cel8A bylo hlášeno, že má optimální teplotu při 75 °C a pH optimální mezi 5,5 a 6,5 ., Tyto hodnoty jsou v souladu s výsledky naší contour plot, jak jsou v rámci regionu > 90% aktivitu (Obr. 1). Náš konturový graf však ukazuje, že enzym je vysoce aktivní za širokého spektra různých podmínek. Enzym vykazuje přijatelné činnosti při nižších hodnotách pH, kdy mezi 60 °C a 65 °C a provádí také s více než 60% jeho maximální aktivity, kdy při hodnotách pH pod 4,5. Naše metoda poskytuje prostředky k vizualizaci těchto účinků a vyhodnocení výkonu enzymu v jakémkoli bodě v rámci testovaných parametrů na první pohled.,
Contour plot z Cel8A pomocí DNSA testu s ječmene-β-glukan jako podklad
testovat, zda naše metoda je vhodná pro různé hydrolázy, metody stanovení, připravili jsme contour plot pomocí Cel8A s Azo-CM-celulóza jako substrátu a příslušného testu (Obr. 2). Na pozemku je podobná optima při 75 °C a pH 5,5. Použití Azo-CM-celulózy jako substrátu však vedlo k o něco menšímu rozsahu aktivity., Drobné rozdíly mezi těmito dvěma testy mohou být způsobeny odlišnými strukturami a typy vazeb obou substrátů, čímž se liší jejich vazebnými vlastnostmi vůči enzymu. Azo-CM-celulóza je nepřirozený substrát s přidanými skupinami barviv, které by mohly k tomuto efektu dále přidat. Pomocí Cel8A, jsme mohli ukázat, že naše metoda poskytuje platná data a je vhodný pro použití ve dvou různých zavedených testů pro hydroláz: DNSA a Azo-CM-celulóza.
Contour plot z Cel8A pomocí Azo-CM-celulóza
Činnost rozmezí pro stanovení Celluclast®
kromě jediného enzymu, enzym směs byla studována. Celluclast® je široce používaný komerční celulázový produkt odvozený od Trichoderma reesei. Skládá se převážně z celobiohydroláz a endo-1,4-β-glukanáz, ale také obsahuje xylanázy a alespoň jednu β-xylosidázu . Příručka k produktu uvádí, že optimální aktivity jsou mezi 50 ° C a 60 ° C a pH 4.,5 a 6.0 . V této práci jsme nejprve produkoval contour plot pro Celluclast® s BBG jako substrát pomocí DNSA metoda (Obr. 3). Konturový graf BBG byl ověřen standardní teplotní křivkou (obr. 4). Výsledky teplotní křivky při pH 5,5 jsou v souladu s výsledky obrysového grafu, které ukazují stejný rozsah aktivity. Měření samostatných křivek je však nedostatečné k popisu aktivity Celluclast® na BBG. Rozsah pH, ve kterém enzymová směs vykazuje vysokou aktivitu, je silně závislý na teplotě., Čím vyšší je teplota, tím nižší je pH, aby se dosáhlo vysoké aktivity. Kolem 45 °C, Celluclast® je vysoce aktivní (> 60%) až do pH 6.5, kdežto na 65 °C, je vysoce aktivní pouze do pH 5.0. Popis aktivity se dvěma samostatnými křivkami je proto přísně závislý na hodnotě zvolené jako statický parametr. Teplota grafy, například, ty, které si vzali na dva extrémy uvedeno rozmezí pH (4,5 a 6.0) by měly dát výrazně jiný výsledek. Totéž platí pro pH grafy pořízené při různých teplotách., Aby byl tento efekt zřejmý, vytvořili jsme standardní pH grafy při 45 °C, 55 ° C a 65 °C (obr. 5). Tyto tři křivky pH ukazují, že se zvyšující se teplotou se hranice pH pro vysokou aktivitu přesouvá na kyselejší hodnoty pH. Tři křivky tak ověřují výsledky viditelné na obrysovém grafu. Dále ukazují omezení konvenčního samostatného stanovení aktivity, které je alespoň pro Celluclast® v případě křivek pH závislé na zvolené teplotě., Použití naší metody obrysového grafu tento problém zcela obchází měřením účinku teploty a pH v jednom kroku.
Contour plot z Celluclast® pomocí DNSA testu s ječmene-β-glukan jako podklad
Konvenční teplota optimální stanovení Celluclast® při pH 5.0., Teplotní optimum Celluclast® na ječmeni-β-glukanu bylo stanoveno na pH 5.0. Konvenční přístup ukazuje, že maximální aktivity kolem 55 °C a je v souladu s výsledky viděn v odpovídající kontury spiknutí
Konvenční pH optimální stanovení Celluclast® na tři teploty. Optimální hodnota pH Celluclast® na ječmeni-β-glukanu byla stanovena při 45 °C, 55 ° C a 65 ° C., Při nižších teplotách může enzym tolerovat vyšší hodnoty pH. To je v souladu s odpovídajícím obrysu plot a ukazuje silný vliv zvolené fixní parametr při určování pH nebo teplota optimální odděleně.
činnost škálu Celluclast® na arabinoxylan (AX) (Obr. 6) liší se od toho s BBG jako substrátem. Aktivita je výrazně posunuta směrem k nižším teplotám, bez vysokých aktivit pozorovaných nad 60 °C., Protože Celluclast® je směs několika enzymů, je nejpravděpodobnější, že tyto různé enzymy mají různé vlastnosti. Nicméně, aktivita vzor je podobný BBG; například, při pH 4.5, enzym směs je vysoce aktivní až téměř 60 °C, vzhledem k tomu, že při pH 6.5, je to jen vysoce aktivní až do 50 °C. V literatuře, optimální z Celluclast® na pšenici rozpustné AX byla stanovena podle reakce surface model (RSM) a zjistil, že je kolem pH 4. 4 a 39 °C ., Naše contour plot vykazuje nejvyšší aktivitu ve stejném rozsahu teplot a na mírně vyšší pH, což je stále v optimální určena RSM. Přičemž optimální je téměř stejný pro obě metody, naše contour plot nápadně ukazuje přesnou činnost Celluclast® na AX v celém rozsahu testovaných podmínek a vykazuje podrobnější dispozice než RSM. S našimi konturovými grafy Celluclast® na BBG a AX bychom mohli ukázat, že komplexní enzymové směsi lze analyzovat navrhovanou metodou.
Contour plot z Celluclast® pomocí DNSA testu s arabinoxylanu jakožto podkladu
prokázat další všestrannost naší činnosti, rozsah stanovení, jsme hodnotili jeho použití s dalšími substráty a testy. Aktivita Celluclast® na P-NP-β-d-glukopyranosidu byla testována a konturový graf je znázorněn na obr. 7. Vysoká aktivita na tomto substrátu je omezena na poměrně úzký rozsah mezi pH 4,0 až 5,5 A 55 °C až 70 °C., To naznačuje, že pouze jeden nebo několik enzymů v enzymové směsi Celluclast® pravděpodobně vykazuje aktivitu vůči P-NP-β-d-glukopyranosidu. P-NP glykosidy mohou být použity jako substráty pro přípravu obrysových parcel. Ne všechny p-NP glykosidy jsou však vhodnými substráty v testu, protože některé z nich vykazují vysoké pozadí kvůli nestabilitě (viz další soubor 5), zejména pokud jsou vysoké teploty kombinovány s vysokými hodnotami pH.
Contour plot z Celluclast® pomocí p-NP-β-d-glucopyranoside,
testovat aplikace naší metody na přírodní biomasy vzorek, rozhodli jsme se použít slámy založené na substrát. Osvobození glukózy pomocí Celluclast® bylo zjištěno pomocí komerčního testu d-glukóza HK (Megazyme). Hlavní složkou buněčné stěny slámy je celulóza, která je hlavním zdrojem enzymaticky uvolněné glukózy. Obrysový plot(obr., 8), proto, převážně ukazuje aktivitu Celluclast® na krystalické celulózy, který je nevypočitatelný vůči enzymatické degradaci . Nejvyšší uvolňování glukózy byla pozorována přibližně při pH 4.0 až 5.5 a 40 °C až 60 °C, rozsah s vysokou aktivitou, je tedy méně široké, než je určeno pro BBG, které by měly být vzaty v úvahu pro proces zaměřen především na degradaci celulózy., S využitím d-glukózy HK a p-NP-β-d-glucopyranoside jako alternativní testy, mohli bychom prokázat, přizpůsobivost naše metoda celkem čtyři různé a běžně používané glykosid hydrolázy testy. Použití slámy ukázalo, že naše metoda je také vhodná pro přírodní substráty průmyslového významu a může být použita pro hodnocení složitých procesů a substrátů. Celluclast® zobrazuje různé profily aktivity na různých substrátech., Souhrnně pro všechny metody je proto zásadní stanovit údaje o pH a teplotním rozsahu enzymu se substrátem zájmu.
Contour plot z Celluclast® pomocí d-glukózy HK test s brčkem na bázi přírodní substrát,
Úvahy při použití metody
Když contour plot je vyroben s navrhovanou metodou, existuje několik úvah, které by měly být vzaty v úvahu., Substrát musí být stabilní a naměřené pozadí reprodukovatelné v celém rozsahu podmínek v desce 96-well. To je předpoklad, protože kontrola substrátu musí být odečtena od všech hodnot před přeměnou na relativní aktivity, ale nemůže být přímo měřena na desce pro každou z 96 podmínek. Několik P-NP glykosidových substrátů například nelze použít, protože vykazují vysoce závislé na teplotě a pH pozadí. Velmi přesné pipetování je nezbytné pro dosažení přijatelných úrovní směrodatné odchylky od triplikátů., Důrazně se doporučuje použití 96-hlavových a 8-kanálových pipet, protože výrazně zlepšují přesnost a urychlují postup. Čtečka desek a gradient PCR cycler jsou navíc technické požadavky na správné provedení metody. Teplotní rozsah, ve kterém tato metoda může být provedena, může být upravena v souladu s technickými vlastnosti gradient PCR cycler, který je obvykle omezena na 30 °C nebo 40 °C a často nemohou obsahovat hodnoty pod 20 °C., Absorbanci jsme přímo převedli na relativní aktivitu enzymu, protože hodnoty jsou všechny na lineární kalibrační křivce (data nejsou zobrazena). Pokud tomu tak není, musí se však nejprve vypočítat aktivita, například v U / mg, a tyto hodnoty pak mohou být použity k vytvoření obrysového grafu. Pokud chtějí produkovat contour plot pro enzym, který je silně závislá na dvojmocné kovové ionty, jiný nárazníkový systém má být použit, protože citrát–fosfátové pufry komplex těchto iontů.,
Zatímco RSM přístupy jsou bezesporu mocný nástroj k posouzení komplexních vztahů, například, různé proměnné, které ovlivňují více faktory, určující vliv pouze pH a teploty na aktivitu není příliš složité být dosaženo pomocí přímého měření. Stanovení správných hodnot okrajů modelu může mít několik přístupů a může ovlivnit výsledný model. Model RSM je odvozen pouze z malého počtu měření kolem centrálního bodu aktivity enzymu a přesnost vůči skutečným experimentálním hodnotám musí být následně testována., Celkové rozlišení RSM je proto nižší, než získá s našimi metoda, která dělá to těžké vidět aktivitu účinky, jak je znázorněno na Celluclast® při vyšších teplotách a/nebo pH hodnoty. Naše metoda nevyžaduje schopnost navrhnout složité statistické modely a může být provedena s minimálními a relativně standardními technickými požadavky. Nevýhodou naší metody i podílu RSM je, že přímá vizualizace směrodatné odchylky v trojrozměrném grafu není možná., Naše metoda však umožňuje výpočet směrodatné odchylky pro každý jednotlivý datový bod. Většina modelů RSM určuje směrodatnou odchylku pro celý model pouze z dat centrálního datového bodu modelu, zatímco ostatní datové body se měří pouze jednou . Standardní odchylky jsou přirozeně vyšší na hranicích aktivity enzymu a ilustrují silný dopad na aktivitu při mírné změně podmínek. Kolem Optima a v oblastech bez nebo nízké aktivity jsou odchylky výrazně nižší., Vzhledem k tomu, že navrhovaná metoda má za následek úplnou faktoriální datovou sadu, bylo by možné v případě potřeby vypočítat statistický model pro další analýzu. Odvozený statistický model by vycházel přímo z experimentálních dat, ale je dalším krokem, který by neměl být nezbytný pro standardní aplikace metody.
stručně řečeno, snadné vyhodnocení enzymu nebo enzymu, směsi, vhodnost pro kombinaci parametrů procesu, má zásadní význam při navrhování biotechnologických procesů na obou laboratorním nebo průmyslovém měřítku., Teplota a pH jsou dva z nejdůležitějších procesních faktorů ovlivňujících enzymovou aktivitu. Konvenční přístupy k testování účinku těchto faktorů na enzymy jsou založeny na předpokladu, že existuje dvourozměrná korelace mezi teplotou a aktivitou, stejně jako pH a aktivitou. Naproti tomu nové přístupy určují vztah v trojrozměrné hmotě, ale jsou založeny na statistikách, složité pro návrh a jejich přesnost vůči skutečným datům se může lišit., Metoda zavedena na druhé straně umožňuje rychlé a snadné stanovení vlivu teploty a pH na enzymová aktivita současně pomocí 96jamkové destičky, vícekanálové pipety a gradient PCR cycler. S tímto základním technickým vybavením je možné vytvářet konturové grafy pH, teploty a aktivity, které jsou založeny přímo na experimentálních datech. Metoda byla testována na několik rozšířených glykosidových hydrolázových testů, jakož i modelových a komplexních substrátů.