odběr Krve a zpracování
Veškeré postupy zahrnující odběr lidské krve od zdravých dobrovolníků byly v souladu s Lidskou Etiku Výzkumu Výbor z University of Sydney (schválení HREC 2014/244) a informovaný souhlas byl získán od všech jedinců., Všechny postupy zahrnující odběr lidské krve z ECMO pacientů byly v souladu s Alfred Nemocnice Etiky, Monash University Stálý Výbor pro Výzkum v Člověka (schválení 388/13) a informovaný souhlas byl získán od všech jedinců. Všechny postupy byly v souladu s Helsinskou deklarací z roku 1983. Krev byla odebrána venesekcí pomocí jehly 21 g motýla Terumo od 10 zdravých dárců bez léků(čtyři muži, šest žen, 22-58 let)., Prvních 5 mL krve byl vyřazen, aby se zabránilo jakékoli trombinu, které mohou být generovány po vpichu jehly a pak vtažen do zkumavek obsahujících 3.2% v/v citrát sodný. Krev od osmi pacientů v jednom centru, kteří měli podporu ECMO (čtyři muži, čtyři ženy, 34-67 let), byla vtažena do zkumavek ACD-a (BD Vacutainer)., Pacienti s ECMO podpory obdržel anti-koagulační a/nebo anti-destiček léky založené na kliničtí lékaři podle svého uvážení, nebo institucionální směry, kde pacienti obvykle zahájena na warfarinem, cílové INR (international normalized ratio) 2-3, s překlenovací infuze heparinu a aspirinu terapie, stejně jako dipyridamol pro ty, kteří jsou považovány za vysoce rizikové pro vznik trombózy. Plazma byla připravena dvakrát odstředěním při 800 × g po dobu 20 minut při pokojové teplotě., Při některých příležitostech byla zdravá dárcovská plazma stříhána rychlostí 2000 s−1 nebo 10000 s−1 po dobu 5 minut při pokojové teplotě pomocí reometru Kinexus pro+.
Hepatocytů fibrinogenu kolekce
lidské rakoviny jater buněčné linii HepG2 (ATCC HB-8065) byly kultivovány v DMEM, 10% fetální telecí sérum a glutamax v 5% CO2 a 37 °C. Buňky na 80-90% konfluence se promyjí fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru, inkubovány po dobu 18 h v DMEM bez séra v 5% CO2 a 37 °C nebo v hypoxické komoře při 1% O2, 5% CO2 a 37 °C., Bylo shromážděno podmíněné médium (1 mL na 4 × 106 buněk) a sekretovaný fibrinogen okamžitě zpracován, jak je popsáno níže.
testy fibrinogenu a fibrinu
plazmatické vzorky byly neléčeny nebo inkubovány s trombinem a/nebo inhibitorem polymerace fibrinu, gprp (Sigma). Fibrin byl připraven v 1 mL plazmy s přídavkem 50 jednotek bovinní trombin (Sigma) a 10 mM CaCl2 a MgCl2 pro 40 min při 22 °C. polymery fibrinu byly shromážděny pomocí plastové tyčinky., V jednom experimentu byla plazma (2 mL) inkubována s 27 jednotkami/mL trombinu a 10 mM CaCl2 a MgCl2 po dobu 40 minut při 22 °C a fibrinový polymer se shromáždil na plastové tyči a odstranil. Vyčerpaná plazma byla inkubována s dalším alikvotem 27 jednotek / mL trombinu a nový fibrinový polymer se shromáždil a odstranil. Alikvot plazmy (0,2 mL) byla ve vzorku před a po přidání oba hodně trombinu, 150 µM, d-phenylalanyl-prolyl-arginyl chlormethyl keton (PPACK, Sigma) dodal, že inhibuje aktivitu trombinu a vzorky inkubovány po dobu 16 h při teplotě 22 °C., Fibrinogen obsah vzorků plazmy byla odhadnuta shromážděním bílkovin na polyklonální anti-fibrinogen protilátkami potažené korálky (viz následující oddíl), řešení fibrinogenu na SDS-PAGE a barvení pomocí koloidní Coomassie. V dalším experimentu, plazmy bylo inkubováno s 8 mM GPRP (Sigma) po dobu 5 min při 22 °C před přidáním 50 jednotek/mL trombinu po dobu 60 min při teplotě 22 °C. reakce byla ukončena s 150 µM PPACK dobu 10 min při 22 °C. Přečištěné fibrinogens byly izolované od zdravého dárce čerstvé mražené plazmy β-alanin precipitation32 nebo získat komerčně (Sigma F4883).,
Vyčíslení redoxní státy fibrinogenu a fibrinu disulfidové vazby
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) byly potaženy 16 µg polyklonální anti-fibrinogen protilátky (Dako, Kočka A0080, Hodně 00015063) v 1 mL fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku na rotující kolo za 1 h při 22 °C a přebytek protilátky odstraněny promytím třikrát s 1 mL fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku. Plazma (0, 7 mL) nebo médium podmíněné HepG2 (4, 5 mL) byly inkubovány s 2 mg potažených kuliček na rotujícím kole po dobu 1 hodiny při 22 °C., Korálky byly shromážděny pomocí magnetu, přebytek plazmy sáním ke snížení objemu, a inkubovány v 0,3 mL 5 mM 12C-IPA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím 10% DMSO po dobu 1 h při 22 °C ve tmě alkylát nepárové Cys thioly v proteiny. Supernatant byl odsát a korálky inkubovány s NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), které obsahují dalších 5 mM 12C-IPA za 30 min při 60 °C. supernatanty byly vyřešeny na SDS-PAGE., Fibrinové polymery vytvořené v plazmě byly shromážděny na plastové tyči a okamžitě ponořeny do 1 mL 5 mM 12C-IPA ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem obsahujícím 10% DMSO po dobu 1 hodiny při 22 ° C ve tmě. Fibrin se promyje 3 krát s fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, než rozpouštění polymeru v 1 mL 20 mM kyselině octové po dobu 24 h při 22 °C. Dvacet mikrolitrů roztoku byl inkubován s NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies) obsahující 5 mM 12C-IPA za 30 min při 60 °C a proteiny vyřešen na SDS-PAGE., Čistí fibrinogenu (12 µg) byly inkubovány s 5 mM 12C-IPA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím 10% DMSO po dobu 1 h při 22 °C ve tmě a bílkovin vyřešen na SDS-PAGE.
gely SDS-PAGE byly obarveny koloidní coomasií (Sigma) a pásy fibrinu(ogen) vyříznuty, odfiltrovány, vysušeny, inkubovány 40 mM dithiothreitolem a omyty14. Gel řezy byly inkubovány s 5 mM 13C-IPA (Cambridge Izotopy) po dobu 1 h při 22 °C ve tmě alkylát disulfide bond Cys, umýt a sušené před trávení bílkovin s 12.,5 ng/µL trypsinu (Promega) v 25 mM NH4CO2 přes noc při 25 °C. Peptidy byly eluovány z plátků s 5% kyselinou mravenčí, 50% acetonitril. Nano-kapalinová chromatografie (nano-LC) byla provedena pomocí systému Ultimate 3000 HPLC a autosampleru (Dionex). Vzorky byly injikovány do fritless nano-LC kolona (75 µm x ~12 cm) obsahující C18 média (1.9 µm 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr. Maisch GmbH) a zahřívá na 45 °C pro všechny běhy. Peptidy byly eluovány pomocí lineárního gradientu nad 52 min při průtoku 0,2 µL / min. Mobilní fáze a se skládala z 0.,1% kyseliny mravenčí v H2O, zatímco mobilní fáze B sestávala z acetonitrilu: H2O (8:2) s 0, 1% kyselinou mravenčí. Gradient: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37.5 min 80% B, 39 min 2% B a 52 min 2% B. Vysoké napětí (2000 V.) byl aplikován na nízké hlasitosti tee (Upchurch Scientific) a sloupec tip umístěn ~0,5 cm od vyhřívaná kapilára (T = 275 °C) z LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) hmotnostní spektrometr. Pozitivní ionty byly generovány ionizací elektrospray a hmotnostní spektrometr fungoval v režimu získávání závislého na datech., Úplné skenování MS spectra bylo získáno (m/z 350-1750) Orbitrap v rozlišení 30 000. 15 nejhojnější ionty (>5000 cyklů) s nábojem státy ≥ +2 byly postupně izolované a roztříštěné v rámci lineární iontová past pomocí collisionally indukované disociace s aktivační q = 0,25 a aktivace čas 10 ms při cílové hodnotě 30.000 ionty. M / z poměry vybrané pro MS / MS byly dynamicky vyloučeny pro 35 s. ion Trap Zoom AGC cíl: 3000.00. Ion Trap plný AGC cíl: 30000.00. Ion Trap SIM AGC cíl: 10000.00. Ion Trap MSn AGC cíl: 10000.00., Data byla analyzována pomocí Mascot Daemon (verze 2.5.0, Matrix Science) proti databázi Swissprot. Parametry vyhledávání byly předchůdce tolerance 6 ppm a produktový ion tolerance ±0.6 Da, a iodoacetanilide derivát (Cys), iodoacetanilide 13C derivát (Cys), oxidace (Met) vybrán jako variabilní modifikace s plnou tryptic štěpení až tři minul štěpení. Seznam cystein obsahující peptidy identifikované pomocí Maskot, jejich monoisotopická poměr hmotnost/náboj (m/z) z +2, +3 a +4 jsou vypočteny pomocí MS-Produkt (Verze v 6.2.2, Protein Prospector Nástroje)., Cys označené 12C-IPA nebo 13C-IPA má hmotnost 133.05276 nebo 139.07289. Bylo analyzováno třicet peptidů obsahujících Cys (doplňkové tabulky 1 a 2). Různé redoxní formy reziduí Cys byly kvantifikovány z relativního množství iontů peptidů značených 12C-IPA a / nebo 13C-IPA. Pro výpočet množství iontů peptidů byly extrahované iontové chromatogramy generovány pomocí XCalibur Qual Browser (V2.1.0; Thermo Scientific). Oblast byla vypočtena pomocí automatizované funkce detekce špiček zabudované do softwaru., Data byla rutinně hledána pro peptidy obsahující volné CYS thioly a ty nebyly detekovány, což naznačuje, že alkylace nepárových reziduí Cys 12C-IPA nebo 13C-IPA byla v proteinu dokončena.
Fibrinogen disulfid-spojený peptid analýzy
Zdravé dárce plazmy (0.7 mL) byly inkubovány s polyklonální anti-fibrinogen antibody-coated Dynabeads na rotující kolo za 1 h při 22 °C. korálky byly shromážděny, přebytek plazmy sáním a 0,3 mL 5 mM 12C-IPA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím 10% DMSO bylo přidáno a inkubovány po dobu 1 h při 22 °C ve tmě., Poté byl supernatant aspirován, kuličky inkubovány s pufrem vzorku NuPAGE LDS po dobu 30 minut při 60 °C a supernatanty vyřešeny na SDS-PAGE. Gel plátky obsahující fibrinogen byly umýt a sušené před trávení potravin s 12 ng/µL trypsinu (Promega) po dobu 4 h při teplotě 37 °C. Reakce byla zastavena přidáním 5% (v/v) kyseliny mravenčí a peptidy eluovány z gelu plátky s 5% kyselinou mravenčí a 50% (v/v) acetonitrilu. Peptidy v 0.,1% kyselina mravenčí (konečný objem 12 µL) byly vyřešeny na 35 cm × 75 µm, C18 reverzní fáze analytické kolony pomocí 2-35% acetonitril gradient více než 22 min při průtoku 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) a analyzovány na LTQ Orbitrap Velos hmotnostní spektrometr, jak je popsáno výše. Peptidy navázané na disulfid byly prohledávány proti sekvenci lidského fibrinogenu pomocí softwaru Byonic analysis (verze 3.9-7, proteinové metriky) s mírou falešného objevu 1%. Všechny peptidy navázané na disulfid byly ručně zkontrolovány pro přesnost., Tolerance prekurzorové hmoty a tolerance fragmentů byly stanoveny na 10 ppm a 0, 6 Da. Variabilní modifikace byly definovány jako oxidované met, oxidované Cys (mono, di a tri) a glutathionylované Cys s plným štěpením trypsinu až o tři Zmeškané štěpení.
Fibrinogen funkce test
Čištěná fibrinogenu (0,2 mL 10 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byly inkubovány s 5 mM 12C-IPA za 1 h při 22 °C ve tmě alkylát nepárové Cys thioly v proteinu., Nereagovaná IPA byla odstraněna pomocí 7 kDa mwco Zeba spin desalting column (Thermo Fisher). Fibrinogen nebo fibrinogen-IPA (1.1 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma) po dobu 5 h při 22 °C v celkovém objemu 0,2 mL do 1,5 mL mikrocentrifugačních zkumavek. Fibrinové polymery byly peletovány při 13 000 × g po dobu 15 minut a měřena koncentrace fibrinogenu zbývajícího v supernatantu. Funkčnost je vyjádřena v % fibrinogenu spotřebovaného při tvorbě fibrinového polymeru.,
Fibrin polymer tvorba měří rozptyl světla
Čištěná fibrinogenu nebo fibrinogen-IPA (1 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma). Zvýšení absorbance při 350 nm bylo zaznamenáno každých 30 s po dobu 15 minut.
Fibrin polymer strukturu měřené pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM)
Fibrinogenu nebo fibrinogen-IPA (1 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma) po dobu 2 h při 22 °C v celkovém objemu 0,2 ml., Polymery fibrinu byly opláchnuty dvakrát s 0,1 M fosfátový pufr, fyziologický roztok (PBS), pevné s 2,5% glutaraldehyd v PBS přes noc ve 4 °C, post-fixovány 1% OsO4 v PBS, dehydratované s odstupňované řady ethanolu, a další kritický bod sušené s Leica EM CPD300. Vzorky byly naprašovány 15 nm zlatem (k550x, Emitech)a zobrazovány elektronovým mikroskopem pro snímání emisí Zeiss SigmaHD. SEM mikroskopie byly zaznamenány u urychlovací napětí 5 kV a pracovní vzdálenosti 5 mm. Vlákno průměry byly měřeny pomocí ImageJ.,
Fibrin polymer permeační test
Fibrinogenu nebo fibrinogen-IPA (1 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma) po dobu 2 h při 22 °C v celkovém objemu 0, 2 mL v polypropylenu chromatografické kolony s vnitřním průměrem 4,6 mm. Sloupce jsou překryty s 0,8 mL Hepes pufru a tok (J) byla vypočtena z hmotnosti kapky, které prosakovaly do 20 min., Pronikání (Darcy) constant33 byla vypočtena ze vztahu Ks = JƞA/LP, kde J je tok (cm3/s), ƞ je viskozita pufru (0.01 držení těla při pokojové teplotě), je průřez sraženina (0.17 cm2), L je délka sraženinu (1,1 cm), a P je hydrostatický tlak (1,018,218 dyn/cm2).
Fibrin polymer zhutnění test
Fibrinogenu nebo fibrinogen-IPA (1 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma) po dobu 16 h při 22 °C v celkovém objemu 0,5 mL, v 1.,5 mL mikrocentrifuge zkumavky dříve potažené 10 mg/mL PEG-20000 ve vodě a na vzduchu se suší. Fibrinové polymery byly centrifugovány na 13 000 × g po dobu 5 až 2400 s a objem kapaliny vytlačované z měřeného polymeru.
Fibrinolýzy test
Fibrinogenu nebo fibrinogen-IPA (1,8 mg/mL v 50 mM Hepes, Je 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) byl inkubován s 1 jednotka/mL bovinní trombin (Sigma) po dobu 2 h při 22 °C v celkovém objemu 0,5 mL ve 24-desky (15.6 mm průměr) po dobu 2 h při 22 °C. poměrné části plasmin (5 µL 0.,59 µM) byl přidán do středu jamek a desky inkubovány po dobu 18 h při 37 °C ve vlhkém prostředí. Oblasti lýzy byly stanoveny z průměru dvou průměrů měřených v pravém úhlu.
Vyčíslení redoxní státy α2-makroglobulin disulfidové vazby
10 zdravých dárců plazmy je popsáno výše pro analýzu fibrinogenu byly použity pro analýzu α2-makroglobulin pomocí stejných postupů. Plasma (0.,7 mL) byly inkubovány s polyklonální anti-α2-makroglobulin protilátky (Dako, Kočka Q0102, Hodně 20068567)-coated Dynabeads (Life Technologies) na rotující kolo za 1 h při 22 °C. korálky byly shromážděny, přebytek plazmy sáním, a inkubovány v 0,3 mL 5 mM 12C-IPA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím 10% DMSO po dobu 1 h při 22 °C ve tmě alkylát nepárové Cys thioly v proteiny. Supernatant byl odsát a korálky inkubovány s NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), které obsahují dalších 5 mM 12C-IPA za 30 min při 60 °C. supernatanty byly vyřešeny na SDS-PAGE., SDS-PAGE gely byly barveny koloidní coomassie (Sigma) a α2-makroglobulin kapela vyříznut, destained, sušené, inkubovány s 40 mM dithiothreitolu a washed14. Gel řezy byly inkubovány s 5 mM 13C-IPA (Cambridge Izotopy) po dobu 1 h při 22 °C ve tmě alkylát disulfide bond Cys, umýt a sušené před trávení bílkovin s 12,5 ng/µl trypsinu (Promega) v 25 mM NH4CO2 přes noc při 25 °C. Peptidy byly eluovány z plátků s 5% kyselinou mravenčí, 50% acetonitril., Kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie a analýza dat byly provedeny tak, jak je popsáno pro fibrinogen34. Bylo analyzováno 17 peptidů obsahujících Cys (doplňkové tabulky 2 a 4). Různé redoxní formy reziduí Cys byly kvantifikovány z relativního množství iontů peptidů značených 12C-IPA a / nebo 13C-IPA.
souhrn zpráv
Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody propojeném s tímto článkem.