Růst a živin dynamika Ochromonas sp.,, kmen BG-1
Phagotrophy tím, phototrophic bičíkovci se předpokládá, že poskytují významné ekologické výhody na řasy, které vykazují chování (Flynn a Mitra, 2009), ale také se zdají být omezení (i když do značné míry uncharacterized) pro vedení smíšené výživy současně v jedné buňce (Raven, 1997). Tato omezení mohou zahrnovat náklady nebo kompromisy pro zachování duální mobilní stroje (ve srovnání s specializované konkurentů), nebo možná cross-talk mezi anabolické a katabolické biochemické dráhy, které zmást výkon obou činností současně., Bohužel, tam je prakticky žádné kvantitativní údaje o nákladech a přínosech mixotrophic chování, ani to, zda oba procesy jsou prováděny postupně nebo současně podle těchto druhů. Časové rozdělení může být mechanismem pro udržení obou schopností v minutových buňkách (i když uvedení jednoho procesu „pozastaveno“ v daném okamžiku)., Posouzení, zda oba projevy se vyskytují současně, specifické fyziologické výhody(y) pro heterotrofní výživa v mixotrophic řasy, a reakce na toto chování na abiotické a biotické proměnné jsou aspekty mixotrophic výživy, které byly obtížné stanovit pomocí tradičních přístupů a metod.
studovali jsme mixotrofní chrysofyt Ochromonas sp., kmen BG-1, protože to může být pěstovány ve vhodné kultury (bakterie-free) a již dříve bylo uvedeno, být převážně heterotrofní organismus, který dosahuje vysoké tempo růstu pouze v přítomnosti bakterií (Sanders et al., 2001). Růst vhodné kultury zabránit potenciálně komplikující biologické interakce a elementární toky vyplývající z činností jiných živých mikroorganismů v kulturách, což umožňuje srovnání mezi nanoSIMS a hromadné IRMS měření a lepší pochopení specifických zdrojů uhlíku a dusíku se používá pro růst řas.,
navíc použití jediného anorganického zdroje dusíku zjednodušilo náš experimentální návrh tak, aby jedinými zdroji dusíku v médiu byly amonium nebo HKB. Řasy obecně mají mechanismy pro příjem a asimilaci jak amoniaku, tak dusičnanu, ale transkriptomické údaje naznačují, že některé chrysofyty, včetně Ochromonas sp. kmen BG-1 může postrádat genetickou schopnost asimilace dusičnanů (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Dále, mes pufr nebyl přidán do média v našich experimentech, protože to mohlo poskytnout alternativní zdroj dusíku. MES mohl také představovat zdroj organického uhlíku pro řasy (Sanders et al., 2001) a jeho eliminace zajistila, že jedinými zdroji uhlíku v médiu byly buď hydrogenuhličitan nebo HKB. Transkriptomická analýza z experimentů prováděných stejným způsobem jako ty, které jsou uvedeny v tomto rukopisu, ukazují, že fotosyntetické stroje Ochromonas sp. kmen BG – 1 je vyjádřen a upregulován za přítomnosti světla (Lie et al., 2017)., Tento zjednodušený přístup v kombinaci se stabilním označováním izotopů nám umožnil určit, který zdroj(zdroje) dusíku a uhlíku byly použity pro růst řasou.
významné míry růstu Ochromonas v této studii bylo dosaženo pouze tehdy, když HKB byly hojné jako kořist (obrázek 1a). Chl dynamika v kultuře také odráží vysokou míru růstu v důsledku pastvy na HKB, jako koncentrace Chl buňka−1 se snížila o jeden řád během prvních 48 h inkubaci kultur pěstovaných ve světle, stejně jako v neustálé temnotě (Obrázek 1d)., Tyto změny v buněčném chlorofylu mohou souviset s ředěním Chl a uvnitř buněk v důsledku vysoké rychlosti růstu řas (Hansen et al., 2000), takže snížení CHL a cell−1 bylo důsledkem rychle rostoucích rychlostí řas a nikoli přímého snížení rychlosti biosyntézy chlorofylu. Nicméně, to je také možné, že tam byla nějaká regulace biosyntézy chlorofylu, když HKB byli přítomni jako transcriptomic analýzu na tato řasa naznačuje, upregulace genů týkající se syntézy chlorofylu v přítomnosti světla, když HKB byly vyčerpány (Lie et al., 2017)., V každém případě jsou tato pozorování v souladu s předchozími studiemi Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), že pozorovat dobře vyvinuté heterotrofní schopnosti, což naznačuje, že uhlík fixaci a snad i jiné buněčné struktury a procesy fotosyntézy se snižuje při pěstování mixotrophically, jak bylo pozorováno u některých dalších řas (Wan et al., 2011).
rozpuštěné amonium, stejně jako fosfát, nahromaděné v ochromonových kulturách během prvních 48 hodin experimentů, kdy byly HKB aktivně spásány (Obrázek 2)., Tento výsledek naznačuje, že přebytečný dusík a fosfor ze spásaného HKB byly vylučovány řasou. Hmotnostní bilance výpočty na základě změny v kořisti/řas abundances a jejich buněčného obsahu dusíku ukázaly, že až 50% dusíku obsažených ve spotřebovaných HKB byla asimilována řasy, zatímco značné množství přebytečného dusíku bylo vydáno především jako amonný během období aktivního bakteriální pastvy (Obrázek 2)., Tyto hodnoty dusíku asimilace (a vylučování) jsou v souladu s asimilační účinnosti heterotrofní prvoci podobné velikosti (Taylor, 1982; Caron a Goldman, 1990), v souladu se závěrem, že Ochromonas roste převážně jako heterotroph, když kořist byla bohatá. Dále transkriptomické analýzy prokázaly, že různé transportéry amonia jsou vyjádřeny Ochromonas sp. kmen BG – 1 rostoucí na HKB ve srovnání s růstem po spásání bakterií na velmi nízké hojnosti (Lie et al., 2017)., Zdá se tedy, že transportéry pro vývoz amonia z buňky se mohou lišit od přepravců používaných pro příjem amoniaku, jak bylo pozorováno u jiných organismů (Shnaiderman et al., 2013).
zajímavé je, že koncentrace amoniaku, ale ne fosfátu, se v médiu snížily, jakmile byla HKB odstraněna pastvou (tj. po 48 h; Obrázek 2), Když byl Ochromonas pěstován ve světle., Zdá se, že tento výsledek naznačuje, že řasa aktivně převzala amonium (ale ne fosfát) z média, když bakterie již nebyly k dispozici a byla indukována fotosyntéza (obrázek 1D). Naproti tomu jak amonium, tak fosfát v kulturách pěstovaných ve tmě pokračovaly v průběhu experimentu (tečkované čáry na obrázku 2). Po vyčerpání kořisti ani ve světle nedošlo k významnému růstu populace řas a vysvětlení dichotomie při vychytávání těchto dvou prvků není jasné., Spekulujeme, že amonium bylo převzato, protože bylo specificky nutné pro přestavbu fotosyntetického stroje buňky.
pokračování vzhled z fosfátu v kultivačním médiu během pozdější části experimentů kontrastuje se studií nějaké jiné Ochromonas druhů, které informovaly o příjmu fosfátu, kdy řasa roste autotrophically (Rothhaupt, 1996)., Nedostatek fosfátu vychytávání kmen BG-1 by mohlo naznačovat, že tento Ochromonas byl schopen efektivní fosfát příjmu (což by mohlo také vysvětlit, v části, chudí phototrophic růst kapacity tohoto kmene), nebo, že fosfor není potřeba ve značném množství pro mobilní reorganizace spojená se změnou phototrophic růst, a proto příjem nebyl stimulován změna phototrophy., Je nepravděpodobné, že další zvýšení koncentrace fosfátu byla v důsledku rozkladu rozpuštěných organických sloučenin fosforu v médiu, protože kultur neměl žádné živé bakterie.
Závěry z stabilní izotop snímání experimentů
analýzu Stabilních izotopů (nanoSIMS a hromadné elementární analýza-IRMS) bylo zjištěno, že obě anorganické (13C-bikarbonátový a 15N-amonný) substráty a 13C/15N-značené HKB byly asimilovány Ochromonas, což přispívá k 15N a 13C mobilní obohacení po 48 h inkubace (Obrázek 4)., Velikost obohacení z anorganických substrátů nebo HKB však naznačila, že během mixotrofického růstu byly primární zdroje uhlíku a dusíku odvozeny z fagotrofie. Izotopové hmotnostní bilance vyplývá, že 88-95% dusíku a 84-99% uhlíku, byly odvozeny z HKB když Ochromonas byl rostoucí mixotrophically ve světle. Obohacení 13C bylo pozorováno u řas pěstovaných ve světle ve srovnání s temnotou (Experiment 1 vs Experiment 3), Když byl k dispozici 13C-hydrogenuhličitan (obrázek 4)., Vypočítaný přínos fotosyntetické fixace uhlíku však činil pouze 1-10% uhlíku asimilovaného na biomasu. Větší účinnosti dusíku začlenění z kořisti pozorován ve světle vzhledem k nepřetržité tmě (Obrázek 3; Experimenty 1, 2 vs Experiment 3) naznačuje, že světlo hraje roli, byť menšího rozsahu, v phagotrophic účinnost alga., Proto, navzdory domnělé snížení fotosyntetické stroje Ochromonas rostoucí phagotrophically na HKB (o čemž svědčí nízká buňky kvót Chl a; Obrázek 1d), lehké to mít menší a pozitivní dopad na řas výživy. Protože množství oxidu stanovena fotosyntéza představuje malý zlomek oxidu přizpůsobil alga při pěstování na HKB, domníváme se, že fotosyntetického aparátu může být poskytování energie, spíše než uhlíku pro buněčný materiál, jak bylo předpokládáno pro Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
naše výpočty izotopové hmotnostní bilance mají dvě námitky. Nejprve jsme neovládali vývoj pH v kulturách, což by poskytlo lepší poznatky o karbonátové rovnováze, která by mohla být ovlivněna dýcháním a fixací uhlíku, a výměna s atmosférou. Jako takový, náš odhad založený na experimentech s použitím značeného anorganického uhlíku mohl podcenit množství anorganického uhlíku fixovaného Ochromonas sp. BG – 1 (1% podle izotopové hmotnostní bilance)., V každém případě by experiment s použitím značeného HKB neměl být touto námitkou ovlivněn a odhad 10% uhlíku získaného z anorganického substrátu je pravděpodobně realistický. Za druhé, Ochromonas je považován za neefektivní uhlíkový fixátor kvůli chybějícím mechanismům koncentrace uhlíku (Maberly et al. 2009), které zvyšují koncentraci CO2 transportem CO2 a/nebo hydrogenuhličitanu do enzymu RubisCO (Raven et al., 2008). Na druhé straně transkriptomická analýza ukázala, že fotosyntetické stroje kmene BG-1 jsou funkční (Lie et al.,, 2017), a naše experimenty pomocí značeného bikarbonátu ukázal významné obohacení 13C frakční množství v Ochromonas (obrázky 4 a 5); proto, Ochromonas sp. kmen BG – 1 má určitou schopnost používat anorganický uhlík, i když neefektivně.
nicméně silná heterotrofní aktivita Ochromonů při růstu mixotropně pravděpodobně zvýší intracelulární CO2 i jeho tok. Obecně se má za to, že heterotrofní protisté asimilují 40% požité organické hmoty, zatímco uvolňují 30% a respektují dalších 30% (sáně, 1989)., Na základě tohoto, celkové množství uhlíku uvolněného Ochromonas jako CO2 během exponenciální růst může být stejně vysoká jako celková bikarbonátu přidán na začátku inkubace, což má důsledky pro izotopové hmotnostní bilance, který jsme předložili. Pokud budeme předpokládat, že isotopically obohacené CO2 odvozené z HKB dýchání je k dispozici na stejné úrovni, jako rozpuštěného anorganického uhlíku, inkubační provádí s Ochromonas a označeny HKB je uvedeno, že ~84% uhlíku byl odvozen od HKB., Až 20% asimilovali oxid odvozený od HKB mohl skutečně odpovídají uhlík, který byl původně respired a potom se připevní pomocí Ochromonas. Pokud je to správné, dýchání odvozené od fagotrofické aktivity by fungovalo jako mechanismus koncentrace uhlíku pro tento Ochromonas. Zatímco primární zdroj uhlíku pro Ochromonas rostoucí mixotrophically byl odvozen od HKB, nezanedbatelné množství by mohl být odvozen od dýchání a pak CO2 fixace bakteriální biomasy.,
Ochromonas posunul svůj metabolismus k autotrophy když inkubovány ve světle, ale pouze po vyčerpané HKB v kulturách (≈ 48 h růstu). Tento posun se odráží ve velkém IRMS 13C frakční množství pro léčbu pomocí označeny HKB kde bylo pozorováno snížení mezi 48 h a 145 h (Experiment 2 v Obrázku 5), svědčící o začlenění neznačený uhlíku do biomasy řas prostřednictvím světla procesů. Chrysofyty jsou obecně považovány za špatné autotrofní uhlíkové fixátory kvůli špatným mechanismům koncentrace uhlíku (Maberly et al., 2009)., Tyto výsledky však naznačují, že došlo k významné úrovni anorganické asimilace uhlíku. Srovnání kultur pěstovaných ve světle (Experiment 1 v Obrázek 5) a nepřetržité tmy (Experiment 3 Obrázek 5) bylo zjištěno, že 15N nepatrné množství temné kultur se nezměnil po 95 h, zatímco kultur ve světle pokračující k obohacení 15N, což naznačuje, že Ochromonas nadále asimilovat dusík pro udržení svého metabolismu jednou HKB byly vyčerpány., Tyto výsledky byly v souladu s pozorované snížení koncentrace dusičnanu v médiu během tohoto časového období (Obrázek 3a), i když pokračující vzhled fosfátů v médiu během tohoto období, je nevysvětlitelné.
získali Jsme dobré celkové dohody mezi hromadné izotop měření a nanoSIMS pro měření dusíku, v souladu s vyjádření v předchozích studiích (Popa et al., 2007; sirotek a Dům, 2009; Kopf et al., 2015; obrázek 4c)., Objemová měření však byla poněkud nižší, pokud jde o hodnoty frakční hojnosti uhlíku, zejména u vysoce obohacených vzorků (obrázek 4d). Domníváme se, že rozdíly mezi nanoSIMS a hromadné měření izotopu uhlíku může souviset s faktem, že nanoSIMS vzorky byly zachovány s glutaraldehyd, vzhledem k tomu, že vzorky pro hromadné analýzy nebyly. Bylo prokázáno, že fixace ovlivňuje buněčný uhlík (Musat et al., 2014), i když jsme mohli očekávat, že to zředí 13C v měření nanoSIMS vzhledem k objemovým hodnotám., Pravděpodobnějším vysvětlením je, že jednobuněčná měření nejsou ovlivněna buněčnými troskami v kultuře, které mohou být méně obohaceny. Objemová hodnota 13C může být zředěna těmito složkami vzhledem k měření nanoSIMS, což znamená, že data nanoSIMS mohou přesněji odrážet příjem uhlíku a dusíku řasami. Variabilita buněk na buňky však mohla také přispět k malým rozdílům mezi měřením objemu a nanosimů.,
použití nanoSIMS v této studii, představuje svou první aplikaci ke studiu uhlíku a živin tavidla v mixotrophic alga, a umožnila lepší pochopení uhlíku a energie akvizici tohoto druhu, a buněčný metabolismus. Naše zjištění rozšiřují informace dostupné z tradičních analýz Ochromonas sp. kmen BG – 1 pěstovaný za různých podmínek dostupnosti světla a kořisti (Sanders et al., 2001), což potvrzuje, že většina dusíku a uhlíku použitého pro růst se získává díky své bakteriální kořisti., I když výsledky nelze přímo extrapolovat na všechny druhy podél kontinua řas s různými mixotrophic strategie, naše práce potvrzuje použití stabilních izotopů sondování experimenty a nanoSIMS pro lepší pochopení metabolických základy mixotrophy v jeden druh. Kromě toho poskytuje přístup k hodnocení mixotrofické výživy ve vzorcích prostředí. Ochromonas sp. kmen BG-1 za předpokladu ideální modelový systém pro porovnávání hromadné izotopové analýzy nanoSIMS, protože bakterie byly rychle odstraněny tím, že pasoucí se během prvních 48 h experimentů., Dohoda mezi těmito dvěma měřeními ukazuje, že nanoSIMS přesně zachytil dynamiku uhlíku a živin akvizice v tomto mixotroph, a mohl by proto být široce aplikován, aby prozkoumala mixotrophy ve složitých smíšených komunitách, kde hromadné opatření by byla dostatečná k zachycení této dynamiky. Tyto a budoucí podrobné studie budou i nadále přinášet zlepšení v našem chápání výživy mixotrofních řas.