Crearea unui contur complot directă a datelor experimentale necesită utilizarea unui posibil high-throughput metodă și un număr considerabil de probe. Prin urmare, testul trebuie să fie adecvat pentru utilizarea într-un design de placă cu 96 de puțuri., Avantajele generale ale acestei miniaturizări de la tuburi de reacție unice la plăci de 96 de puțuri au fost deja demonstrate pentru DNSA și alte teste colorimetrice . Toate testele utilizate în acest studiu au fost potrivite pentru formatul plăcii cu 96 de puțuri. Pentru a produce un complot contur, amestecurile de enzime și substrat au fost incubate la opt niveluri diferite de pH. Aceste opt niveluri de pH au fost incubate la 12 temperaturi diferite folosind un cicler PCR gradient, rezultând 96 de condiții unice de reacție. Un cititor de plăci a fost utilizat pentru a obține datele., Rezultatele au fost transformate în activități relative cu cea mai mare activitate pe fiecare placă fiind setată la 100%. Măsurarea a fost efectuată în trei exemplare, iar valorile medii au fost ulterior transformate într-o diagramă de contur folosind SigmaPlot, așa cum este descris în secțiunea materiale și metode. Activitatea (axa z) este reprezentată ca culoare de la violet la roșu în loc de o axă normală pentru a îmbunătăți vizualizarea parcelei contur.,o condiție prealabilă pentru determinarea fiabilă a pH-ului și a temperaturii optima este un sistem tampon stabil care este potrivit în ceea ce privește activitatea enzimatică și aproape rezistent la o schimbare a pH-ului odată cu creșterea temperaturii. Alternativ, acest efect ar putea fi luat în considerare în graficul conturului. Influența temperaturii asupra pKa a tampoanelor și, prin urmare, a pH-ului este un fapt care ar trebui luat în considerare, în special pentru tampoanele alcaline, cum ar fi Tris ., Ca cerință pentru test, toate variațiile de pH ale sistemului nostru tampon citrat-fosfat au fost testate pentru modificarea pH-ului între 35 °C și 80 °C (vezi fișierul suplimentar 4). Toate tampoanele prezintă o ușoară scădere a pH-ului odată cu creșterea temperaturii, tampoanele la valori mai mari ale pH-ului prezentând abateri mai mari. Dependența de temperatură crește cu cantitatea de fosfat, care se corelează cu coeficienții de temperatură ai fosfatului (− 0,0028) și citratului (0)., Deoarece variațiile de pH dependente de temperatură ale tuturor tampoanelor au fost doar minore, acestea ar putea fi neglijate în compilarea parcelelor de contur în intervalul de valori utilizate aici. Cu toate acestea, dacă se utilizează un alt sistem tampon cu un coeficient de temperatură mai ridicat, este ușor posibil să se adapteze graficul conturului pentru modificarea pH-ului, atribuind fiecărui tampon un pH individual la fiecare temperatură., Aceste valori sunt fie determinate experimental așa cum este descris în materialele respective și secțiunea metodă sau derivate din coeficienții de temperatură și pot fi apoi utilizate în consecință pentru a adapta axa x (pH) a fișierului Sigmaplot furnizat.
determinarea intervalului de activitate pentru Cel8A
o prezentare generală a diferitelor enzime, substraturi și teste utilizate în acest studiu pentru crearea parcelelor de contur respective este prezentată în tabelul 1.,
Cel8A este o celulază, mai precis un endo-glucanază, de la C. thermocellum și a fost prima enzimă de glicozide hidrolază familie 8 cu un rezolvate structura de cristal . În acest studiu, enzima a fost incubată cu BBG pentru a valida metoda propusă folosind testul DNSA. S-a raportat că Cel8A are temperatura optimă la 75 °C și pH optim între 5,5 și 6,5 ., Aceste valori sunt în conformitate cu rezultatele parcelei noastre de contur, deoarece se află în regiunea > 90% activitate (Fig. 1). Graficul nostru de contur, totuși, arată că enzima este foarte activă într-o gamă largă de condiții diferite. Enzima prezintă activități acceptabile la valori ale pH-ului mai mici atunci când între 60 °C și 65 °C și, de asemenea, efectuează cu mai mult de 60% din activitatea sa maximă atunci când la valori ale pH-ului sub 4.5. Metoda noastră oferă mijloacele de vizualizare a acestor efecte și de evaluare a performanței unei enzime în orice punct din parametrii testați dintr-o privire.,
Contur complot de Cel8A folosind DNSA test cu orz-β-glucan ca substrat
Pentru a testa dacă metoda noastră este potrivit pentru diferite hidrolază metode de testare, am produs un contur complot folosind Cel8A cu Azo-CM-celuloză ca substrat și respectiv testului (Fig. 2). Parcela arată optima similară la 75 °C și pH 5,5. Cu toate acestea, utilizarea Azo-cm-celulozei ca substrat a dus la o gamă de activitate puțin mai mică., Diferențele minore dintre cele două teste s-ar putea datora structurilor diferite și tipurilor de legătură ale ambelor substraturi, diferind astfel în ceea ce privește proprietățile lor de legare la enzimă. Azo-cm-celuloza este un substrat non-natural cu grupe de coloranți adăugate, care ar putea adăuga în continuare acest efect. Folosind Cel8A, am putea arăta că metoda noastră oferă date valide și este adecvată pentru utilizarea în două teste diferite stabilite pentru hidrolaze: DNSA și Azo-CM-celuloză.
Contur complot de Cel8A folosind Azo-CM-celuloză
aria de Activitate pentru determinarea Celluclast®
În plus față de o singură enzimă, o enzimă amestec a fost studiat. Celluclast® este un produs comercial de celulază utilizat pe scară largă derivat din Trichoderma reesei. Se compune în principal din cellobiohydrolases și de endo-1,4-β-glucanases, dar, de asemenea, caracteristici xylanases și cel puțin un β-xylosidase . Manualul produsului afirmă că activitățile optime sunt cuprinse între 50 °C și 60 °C și pH 4.,5 și 6.0 . În această lucrare, am realizat mai întâi un grafic de contur pentru Celluclast® cu BBG ca substrat folosind metoda DNSA (Fig. 3). Graficul conturului BBG a fost verificat printr-o curbă de temperatură standard (Fig. 4). Rezultatele curbei de temperatură la pH 5,5 sunt în conformitate cu rezultatele parcelei conturului, arătând același interval de activitate. Cu toate acestea, măsurarea curbelor separate este inadecvată pentru a descrie activitatea Celluclast® pe BBG. Intervalul de pH în care amestecul enzimatic prezintă o activitate ridicată este puternic dependent de temperatură., Cu cât temperatura este mai mare, cu atât pH-ul trebuie să fie mai mic pentru a obține o activitate ridicată. În jurul valorii de 45 °C, Celluclast® este extrem de activ (> 60%) până la un pH de 6,5, în timp ce la 65 °C, este foarte activ doar până la un pH de 5.0. Prin urmare, descrierea activității cu două curbe separate depinde strict de valoarea aleasă ca parametru static. Graficele de temperatură, de exemplu, cele luate la cele două extreme ale intervalului de pH declarat (4, 5 și 6, 0) ar trebui să dea rezultate semnificativ diferite. Același lucru este valabil și pentru graficele pH luate la temperaturi diferite., Pentru a face acest efect evident, am produs grafice standard de pH la 45 °C, 55 °C și 65 °C (Fig. 5). Aceste trei curbe de pH arată că, odată cu creșterea temperaturii, limita pH-ului pentru o activitate ridicată trece la valori mai acide ale pH-ului. Cele trei curbe verifică astfel rezultatele observate în graficul conturului. În plus, ele arată limitările determinării activității separate convenționale, care cel puțin pentru celluclast® este, în cazul curbelor de pH, dependentă de temperatura aleasă., Utilizarea metodei noastre de complot contur ocolește complet această problemă prin măsurarea efectului temperaturii și pH-ului într-o singură etapă.
Contur complot de Celluclast® folosind DNSA test cu orz-β-glucan ca substrat
Convenționale temperatura optimă de determinare a Celluclast® la pH 5.0., Optimul de temperatură al celluclast® pe orz-β-glucan a fost determinat la pH 5.0. Abordarea convențională prezintă activitate maximă în jurul valorii de 55 °C și este în conformitate cu rezultatele observate în corespunzătoare conturului parcelei
Convențional pH-ul optim de determinare de Celluclast® la trei temperaturi. Optimul de pH al Celluclast® asupra orzului-β-glucan a fost determinat la 45 °C, 55 °C și 65 °C., La temperaturi mai scăzute, enzima poate tolera valori mai mari ale pH-ului. Acest lucru este în conformitate cu contur corespunzătoare complot și arată impactul puternic a ales parametru fix atunci când se determină pH-ul sau temperatura optimă separat
raza de activitate a Celluclast® pe arabinoxilan (AX) (Fig. 6) diferă de cea cu BBG ca substrat. Activitatea este în special deplasată spre temperaturi mai scăzute, fără activități ridicate observate la peste 60 °C., Deoarece Celluclast® este un amestec de mai multe enzime, este foarte probabil ca aceste enzime diferite să aibă caracteristici diferite. Cu toate acestea, activitatea de model este similar cu cel al BBG; de exemplu, la pH 4,5, enzima amestecul este foarte activă până la aproape 60 °C, în timp ce la pH 6.5, este numai extrem de activă până la 50 °C. În literatura de specialitate, cea optimă de Celluclast® pe grâu solubil TOPOR a fost determinată de o reacție de suprafață model (RSM) și a fost găsit pentru a fi în jurul valorii de pH 4.4 și 39 °C ., Graficul nostru de contur prezintă cea mai mare activitate în același interval de temperatură și la un pH ușor mai ridicat, care este încă în cadrul optimului determinat de RSM. În timp ce optimă este aproape același pentru ambele metode de contur complot izbitor arată exact activitate de Celluclast® pe AX în întreaga gamă de testat condiții și prezintă o analiză mai detaliată dispoziție decât RSM. Cu parcelele noastre de contur Celluclast® pe BBG și AX, am putea arăta că amestecurile complexe de enzime pot fi analizate cu metoda propusă.
Contur complot de Celluclast® folosind DNSA test cu arabinoxilan ca substrat
Pentru a demonstra în continuare versatilitatea activitatea noastra gama de determinare, am evaluat utilizarea acestuia cu substraturi suplimentare și teste. A fost testată activitatea Celluclast® asupra P-NP-β-D-glucopiranozidei, iar graficul conturului este prezentat în Fig. 7. Activitatea ridicată pe acest substrat este limitată la un interval destul de îngust între pH 4, 0 și 5, 5 și 55 °C până la 70 °C., Acest lucru sugerează că numai una sau câteva enzime din amestecul de enzime celluclast® prezintă probabil activitate spre P-NP-β-D-glucopiranozid. glicozidele p-NP pot fi utilizate ca substraturi pentru prepararea parcelelor de contur. Cu toate acestea, nu toate glicozidele p-NP sunt substraturi adecvate în test, deoarece mai multe dintre ele prezintă un fundal ridicat din cauza instabilității (a se vedea fișierul suplimentar 5), în special atunci când temperaturile ridicate sunt combinate cu valori ridicate ale pH-ului.
Contur complot de Celluclast® folosind p-NP-β-d-glucopyranoside
Pentru a testa aplicarea metodei noastre naturale biomasă probă, am ales sa folosesc un pai pe bază de substrat. Eliberarea glucozei de către Celluclast® a fost detectată utilizând testul comercial D-glucose HK (Megazyme). Componenta principală din peretele celular al paielor este celuloza, care este principala sursă de glucoză eliberată enzimatic. Graficul conturului (Fig., 8), prin urmare, prezintă predominant activitatea Celluclast® asupra celulozei cristaline, care este recalcitrantă spre degradarea enzimatică . Cea mai mare eliberare de glucoză a fost observată la aproximativ pH 4, 0 până la 5, 5 și 40 °C până la 60 °C. intervalul cu activitate ridicată este, prin urmare, mai puțin larg decât cel determinat pentru BBG, care ar trebui luat în considerare pentru un proces care vizează în principal degradarea celulozei., Cu utilizarea de d-glucoză HK și p-NP-β-d-glucopyranoside ca alternativă teste, am putut demonstra adaptabilitatea metodei noastre la un total de patru diferite și frecvent utilizate glicozide hidrolază teste. Utilizarea paielor a arătat că metoda noastră este adecvată și pentru substraturi naturale de relevanță industrială și poate fi utilizată pentru evaluarea proceselor și substraturilor complexe. Celluclast® prezintă diferite profiluri de activitate pe diferite substraturi., În mod colectiv, pentru toate metodele, este, prin urmare, crucial să se determine datele privind pH-ul și intervalul de temperatură al unei enzime cu substratul de interes.
Contur complot de Celluclast® folosind d-glucoză HK test cu un pai naturale bazate pe substrat
Considerații atunci când se utilizează metoda
Atunci când un contur complot este produs cu metoda propusă, există mai multe considerente pe care ar trebui să fie luate în considerare., Substratul trebuie să fie stabil, iar fundalul măsurat să fie reproductibil pe întreaga gamă de condiții din placa de 96 de puțuri. Aceasta este o condiție prealabilă, deoarece controlul substratului trebuie scăzut din toate valorile înainte de conversia în activități relative, dar nu poate fi măsurat direct pe placă pentru fiecare dintre cele 96 de condiții. Mai multe substraturi glicozidice p-NP, de exemplu, nu pot fi utilizate, deoarece prezintă un fond extrem de dependent de temperatură și pH. Pipetarea foarte precisă este necesară pentru a obține niveluri acceptabile de abatere standard de la triplați., Se recomandă utilizarea pipetelor cu 96 de capete și 8 canale, deoarece acestea îmbunătățesc semnificativ precizia și accelerează procedura. Mai mult, cititorul de plăci și ciclistul PCR gradient sunt cerințe tehnice pentru a executa corect metoda. Intervalul de temperatură în care poate fi efectuată metoda poate fi adaptat în conformitate cu proprietățile tehnice ale ciclerului PCR gradient, care este de obicei limitat la 30 °C sau 40 °C și adesea nu poate include valori Sub 20 °C., Am transformat direct absorbanța în activitate relativă a unei enzime, deoarece valorile sunt toate pe o curbă de calibrare liniară (datele nu sunt prezentate). Dacă nu este cazul, totuși, activitatea trebuie calculată mai întâi, de exemplu, în U/mg, iar aceste valori pot fi apoi utilizate pentru a produce graficul conturului. Atunci când doresc să producă un complot contur pentru o enzimă care este puternic dependentă de ionii metalici bivalenți, trebuie utilizat un sistem tampon diferit, deoarece tampoanele pe bază de citrat–fosfat complexează acei ioni.,în timp ce abordările RSM sunt un instrument incontestabil de puternic pentru a evalua relații complexe, de exemplu, diverse variabile care afectează mai mulți factori, determinarea efectului numai a pH-ului și a temperaturii asupra activității nu este prea complexă pentru a fi obținută prin măsurarea directă. Determinarea valorilor de frontieră corecte ale modelului poate lua mai multe abordări și poate influența modelul rezultat. Modelul RSM este derivat dintr-un număr mic de măsurători în jurul punctului central al activității enzimei, iar precizia față de valorile experimentale reale trebuie testată ulterior., Rezoluția generală a RSM este, prin urmare, mai mici decât cele obținute cu metoda noastră, ceea ce face dificil de a vedea activitatea efecte după cum se arată pentru Celluclast® la temperaturi mai ridicate și/sau valori ale pH-ului. Metoda noastră nu necesită capacitatea de a proiecta modele statistice complexe și poate fi realizată cu cerințe tehnice minime și relativ standard. Un dezavantaj atât metoda noastră, cât și cota RSM este că vizualizarea directă a deviației standard în cadrul parcelei tridimensionale nu este posibilă., Cu toate acestea, metoda noastră permite calcularea deviației standard pentru fiecare punct de date individual. Majoritatea modelelor RSM determină abaterea standard pentru întregul model numai din datele punctului central de date al modelului, în timp ce celelalte puncte de date sunt măsurate o singură dată . Abaterile standard sunt în mod natural mai mari la granițele activității unei enzime și ilustrează un impact puternic asupra activității într-o ușoară schimbare a condițiilor. În jurul optimului și în zonele cu activitate scăzută sau scăzută, abaterile sunt semnificativ mai mici., Deoarece metoda propusă are ca rezultat un set complet de date factoriale, ar fi posibil să se calculeze un model statistic dacă este necesar pentru analize suplimentare. Modelul statistic derivat s-ar baza direct pe date experimentale, dar reprezintă o etapă suplimentară care nu ar trebui să fie necesară pentru aplicațiile standard ale metodei.în rezumat, evaluarea ușoară a adecvării unei enzime sau a unui amestec enzimatic pentru o combinație de parametri de proces este de o importanță crucială atunci când se proiectează procese biotehnologice la scară de laborator sau industrială., Temperatura și pH-ul sunt doi dintre cei mai importanți factori de proces care influențează activitatea enzimatică. Abordările convenționale pentru a testa efectul acestor factori asupra enzimelor se bazează pe presupunerea că există o corelație bidimensională între temperatură și activitate, precum și pH și activitate. În schimb, noi abordări determină relația în materie tridimensională, dar sunt bazate pe statistici, complexe pentru a proiecta și acuratețea lor la datele reale pot varia., Metoda introdus aici, pe de altă parte permite rapid și ușor de determinare a efectului că temperatura și pH-ului asupra enzimei de activitate simultan folosind plăci cu 96 de godeuri, pipete multicanal, și un gradient PCR cycler. Cu acest echipament tehnic de bază, este posibil să se producă parcele de contur ale pH-ului, temperaturii și activității care se bazează direct pe date experimentale. Metoda a fost testată pentru mai multe teste pe scară largă de hidrolază glicozidică, precum și pentru substraturi model și complexe.