Sange de colectare și prelucrare
Toate procedurile care implică colectarea de sânge uman de la voluntari sănătoși au fost în conformitate cu cele Umane de Cercetare Comisia de Etică de la Universitatea din Sydney (aprobarea HREC 2014/244) și a fost obținut consimțământul informat de la toți indivizii., Toate procedurile care implică colectarea de sânge uman de la pacienții ECMO au fost în conformitate cu etica Spitalului Alfred, Comitetul Permanent al Universității Monash pentru cercetare la om (aprobarea 388/13) și consimțământul informat a fost obținut de la toate persoanele. Toate procedurile au fost în conformitate cu declarația de la Helsinki din 1983. Sângele a fost colectat prin venezecție folosind un ac fluture Terumo de 21 g de la 10 donatori sănătoși fără medicamente (patru bărbați, șase femei, 22-58 ani)., Primii 5 mL de sânge au fost aruncați pentru a evita trombina care ar fi putut fi generată în jurul locului de introducere a acului și apoi trasă în tuburi care conțineau citrat de sodiu 3,2% v/V. Sângele de la opt pacienți dintr-un singur centru care a avut suport ECMO (patru bărbați, patru femei, 34-67 ani) a fost tras în tuburi ACD-a (BD Vacutainer)., Pacienții cu suport ECMO au primit medicamente anti-coagulare și / sau antiplachetare bazate pe la discreția clinicienilor sau orientări instituționale în care pacienții au început de obicei cu warfarină, target International normalized ratio (INR) 2-3, cu perfuzie cu heparină și terapie cu aspirină, precum și dipiridamol pentru cei care sunt considerați cu risc ridicat de tromboză. Plasma a fost preparată prin centrifugare de două ori la 800 × g timp de 20 min la temperatura camerei., În unele ocazii, donator sănătos cu plasmă fost tunsă la prețurile din 2000 s−1 sau 10000 s−1 pentru 5 min la temperatura camerei, folosind un Kinexus pro+ rheometer.
Hepatocitelor fibrinogen colecție
uman cancer la ficat linia celulară HepG2 (ATCC, HB-8065) a fost cultivat în DMEM, 10% fetal de vițel ser și glutamax la 5% CO2 și 37 °C. Celulele de la 80-90% confluența au fost spălate cu ser fiziologic tamponat cu fosfat, incubate timp de 18 h în DMEM fără ser la 5% CO2 și 37 °C sau într-un hipoxice camera la 1% O2, 5% CO2 și 37 °C., Mediul condiționat a fost colectat (1 mL pe 4 × 106 celule), iar fibrinogenul secretat a fost prelucrat imediat după cum este descris mai jos.probele de plasmă au fost netratate sau incubate cu trombină și / sau cu inhibitorul de polimerizare a fibrinei, Gprp (Sigma). Fibrina a fost preparată în 1 mL de plasmă prin adăugarea a 50 de unități de trombină bovină (Sigma) și 10 mM CaCl2 și MgCl2 timp de 40 min la 22 °C. polimerii de fibrină au fost colectați folosind o tijă de plastic., Într-un experiment, plasma (2 mL) a fost incubată cu 27 Unități/mL de trombină și 10 mM CaCl2 și MgCl2 timp de 40 min la 22 °C, iar polimerul fibrinic colectat pe o tijă de plastic și îndepărtat. Plasma sărăcită a fost incubată cu o altă alicotă de 27 Unități/mL de trombină și Noul polimer fibrinic colectat și îndepărtat. O porțiune de plasmă (0,2 mL) a fost prelevate înainte și după adăugarea a două loturi de trombină, 150 µM d-fenilalanil-prolil-arginyl clorometil-cetonă (PPACK, Sigma) adăugat de a inhiba trombina activitate și probele incubate timp de 16 ore la 22 °C., Fibrinogenul conținutul probele de plasmă a fost estimat prin colectarea de proteine pe policlonali anti-fibrinogen anticorpi acoperite cu margele (a se vedea secțiunea următoare), rezolvarea de fibrinogen pe SDS-PAGE și colorare cu coloidal Coomassie. Într-un alt experiment, plasma a fost incubate cu 8 mM GPRP (Sigma) pentru 5 min la 22 °C înainte de adăugarea de 50 de unități/mL de trombină pentru 60 de minute la 22 °C. reacția A fost stins cu 150 µM de PPACK pentru 10 min la 22 °C. Purificat fibrinogens au fost izolate de la donator sănătos plasmă proaspătă congelată de β-alanina precipitation32 sau obținute din punct de vedere comercial (Sigma F4883).,
Cuantificarea redox membre ale fibrinogenului și fibrinei legăturile disulfurice
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) au fost acoperite cu 16 µg de policlonali anti-fibrinogen anticorpi (Dako, Cat A0080, Mult 00015063) în 1 mL de ser fiziologic tamponat cu fosfat pe o roată de rotație, timp de 1 h la 22 °C și excesul de anticorpi eliminate de spălat de trei ori cu 1 mL de ser fiziologic tamponat cu fosfat. Plasma (0,7 mL) sau mediul condiționat HepG2 (4,5 mL) a fost incubat cu 2 mg de margele acoperite pe o roată rotativă timp de 1 oră la 22 °C., Bilele au fost colectate folosind un magnet, excesul de plasmă aspirat pentru a reduce volumul și incubat în 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA în soluție salină tamponată cu fosfat conținând 10% DMSO timp de 1 oră la 22 °C în întuneric pentru a alchila Tiolii Cys nepereche în proteine. Supernatantul a fost aspirat, si margele incubate cu NuPAGE LDS eșantion tampon (Life Technologies), care conține o suplimentare de 5 mM 12C-IPA pentru 30 de minute la 60 °C. supernatantele au fost rezolvate la SDS-PAGE., Polimerii de fibrină generați în plasmă au fost colectați pe o tijă de plastic și imediat scufundați în 1 mL de 5 mM 12C-IPA în soluție salină tamponată cu fosfat conținând 10% DMSO timp de 1 oră la 22 °C în întuneric. Fibrină fost spălate de 3 ori cu ser fiziologic tamponat cu fosfat înainte de dizolvarea polimerului în 1 mL de 20 mM de acid acetic pentru 24 de ore la 22 °C. Douăzeci de microlitri de soluție a fost incubate cu NuPAGE LDS eșantion tampon (Life Technologies), care conține 5 mM 12C-IPA pentru 30 min la 60 °C și proteine rezolvate pe SDS-PAGE., Fibrinogenul purificat (12 µg) a fost incubat cu 5 mM 12C-IPA în soluție salină tamponată cu fosfat conținând 10% DMSO timp de 1 oră la 22 °C la întuneric, iar proteina S-a rezolvat pe pagina SDS.
SDS-PAGE gelurile au fost colorate cu coloidal coomassie (Sigma) și fibrin(ogen) benzi excizate, destained, uscate, incubate cu 40 mM dithiothreitol și washed14. Feliile de gel au fost incubate cu 5 mM 13C-IPA (izotopi Cambridge) timp de 1 h la 22 °C în întuneric pentru a alchila legătura disulfidică Cys, spălate și uscate înainte de digestia proteinelor cu 12.,5 ng/µL de tripsină (Promega) în 25 mM NH4CO2 peste noapte la 25 °C. Peptidele au fost eluate din felii cu 5% acid formic, 50% acetonitril. Cromatografia Nano-lichidă (nano-LC) a fost realizată utilizând un sistem de autosampler final 3000 HPLC (dionex). Probele au fost injectate într-un fritless nano-LC coloana (75 µm x ~12 cm) conțin C18 mass-media (de 1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) și încălzită la 45 °C pentru toate ruleaza. Peptidele au fost eluate folosind un gradient liniar peste 52 min, la un debit de 0,2 µL/min. Faza mobilă A a constat din 0.,1% acid formic în H2O, în timp ce faza mobilă B a constat din acetonitril:H2O (8:2) cu 0,1% acid formic. Gradientul fost: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37.5 min 80% B, 39 min 2% B și 52 min 2% B. Înaltă tensiune (2000 V) a fost aplicat la un volum redus tee (Upchurch Științifice) și coloana sfat poziționat ~0,5 cm de încălzit capilar (T = 275 °C) de o LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) spectrometru de masă. Ionii pozitivi au fost generați prin ionizare prin electrospray, iar spectrometrul de masă a funcționat în modul de achiziție dependent de date., Spectrele MS scan complete au fost achiziționate (m / z 350-1750) de către Orbitrap la o rezoluție de 30.000. 15 cele mai abundente ioni (>5000 capete de acuzare), cu taxă membre ≥ +2 au fost secvențial izolate și fragmentate în cadrul liniare capcană de ioni folosind collisionally induse de disociere cu o activare q = 0,25 și de activare timp de 10 ms la o țintă valoare de 30.000 de ioni. Raporturile m / z selectate pentru MS / MS au fost excluse dinamic pentru 35 s. Ion Trap Zoom AGC Target: 3000.00. Ion Trap full AGC țintă: 30000.00. Ion Trap SIM AGC țintă: 10000.00. Ion Trap MSn AGC țintă: 10000.00., Datele au fost analizate folosind Mascot Daemon (versiunea 2.5.0, Matrix Science) împotriva bazei de date Swissprot. Parametrii de căutare au fost precursor toleranță de 6 ppm și ion produs toleranțe de ±0.6 Da, și iodoacetanilide derivate (Cys), iodoacetanilide 13C derivate (Cys), de oxidare (Met) selectate ca variabile modificări cu deplină tryptic clivaj de până la trei ratat clivaje. Cu lista peptidelor care conțin cisteină identificate folosind Mascot, raportul lor monoisotopic masă/încărcare (M / z) de +2, +3 și +4 sunt calculate utilizând produsul MS (versiunea v 6.2.2, instrumente de prospectare a proteinelor)., Cys etichetate cu 12C-IPA sau 13C-IPA are o masă de 133.05276 sau 139.07289, respectiv. Au fost analizate treizeci de peptide care conțin Cys (tabelele suplimentare 1 și 2). Diferitele forme redox ale reziduurilor Cys au fost cuantificate din abundența relativă a ionilor de peptide marcate cu 12C-IPA și/sau 13C-IPA. Pentru a calcula abundența ionilor de peptide, cromatogramele ionice extrase au fost generate folosind browserul Xcalibur Qual (v2.1. 0; Thermo Scientific). Zona a fost calculată folosind funcția de detectare automată a vârfului încorporată în software., Datele au fost căutate în mod obișnuit pentru peptide care conțin tioli Cys liberi și acestea nu au fost detectate, ceea ce indică faptul că alchilarea reziduurilor Cys nepereche de către 12C-IPA sau 13C-IPA a fost completă în proteină.
Fibrinogen disulfură legate de peptida analiza
donator Sănătos plasmă (0.7 mL) a fost incubate cu policlonali anti-fibrinogen anticorpi acoperite Dynabeads pe o roată de rotație, timp de 1 h la 22 °C. margele au fost colectate, excesul de plasmă aspirat și 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA în ser fiziologic tamponat cu fosfat care conține 10% DMSO a fost adăugat și incubate timp de 1 h la 22 °C, la întuneric., Apoi supernatantul a fost aspirat, perlele incubate cu tampon de probă NUPAGE LDS timp de 30 min la 60 °C și supernatantele rezolvate pe SDS-PAGE. Feliile de gel care conțin fibrinogen au fost spălate și uscate înainte de digestie cu 12 ng/µL tripsină (Promega) timp de 4 ore la 37 °C. reacțiile au fost oprite prin adăugarea de acid formic 5% (v/v) și peptide eluate din feliile de gel cu acid formic 5% și acetonitril 50% (v/v). Peptide în 0.,1% acid formic (volum final 12 µL) au fost rezolvate la 35 cm × 75 µm C18 cu fază inversă coloană analitică folosind un 2-35% acetonitril gradient de peste 22 de minute la un debit de 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) și analizate pe un LTQ Orbitrap Velos spectrometru de masă așa cum este descris mai sus. Peptidele legate de disulfură au fost căutate împotriva secvenței fibrinogenului uman folosind software de analiză bionică (versiunea 3.9-7, Metrici de proteine) cu o rată de descoperire falsă de 1%. Toate peptidele legate de disulfură au fost inspectate manual pentru acuratețe., Toleranța la masa precursorilor și toleranța fragmentelor au fost stabilite la 10 ppm și, respectiv, 0,6 Da. Modificările variabile au fost definite ca Cys oxidat met, oxidat (mono, di și tri) și CYS glutationilat cu scindare completă a tripsinei de până la trei clivaje ratate.
Fibrinogen funcționalitate test
fibrinogen Purificat (0.2 mL 10 mg/mL în 50 mM Hepes, Cu 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) a fost incubate cu 5 mM 12C-IPA pentru 1 h la 22 °C în întuneric pentru a alchila nepereche Cys tiolilor în proteine., IPA nereacționată a fost eliminată folosind o coloană de desalinizare a spinului de 7 kDa mwco Zeba (Thermo Fisher). Fibrinogenul sau fibrinogenul-IPA (1,1 mg/mL în 50 mM Hepes, 0,14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a fost incubat cu 1 unitate/mL de trombină bovină (Sigma) timp de 5 ore la 22 °C într-un volum total de 0,2 mL în 1,5 mL tuburi microcentrifuge. Polimerii de fibrină au fost peletați la 13.000 × g timp de 15 minute, iar concentrația de fibrinogen rămasă în supernatant a fost măsurată. Funcționalitatea este exprimată la % din fibrinogenul consumat în formarea polimerilor de fibrină.,
formarea polimerului fibrinic măsurată prin împrăștierea luminii
fibrinogen purificat sau fibrinogen-IPA (1 mg/mL în Hepes 50 mM, 0,14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a fost incubat cu 1 unitate/mL de trombină bovină (Sigma). Creșterea absorbanței la 350 nm a fost înregistrată la fiecare 30 s timp de 15 min.
structura polimerului fibrinic măsurată prin microscopie electronică cu baleiaj (SEM)
fibrinogenul sau fibrinogenul-IPA (1 mg/mL în Hepes 50 mM, 0,14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a fost incubat cu 1 unitate / mL trombină bovină (Sigma) timp de 2 ore la 22 °C într-un volum total de 0,2 mL., Fibrină polimeri au fost spălate de două ori cu fosfat 0.1 M-tampon salin (PBS), fixate cu 2,5% glutaraldehidă în PBS peste noapte la 4 °C, post-fix cu 1% OsO4 în PBS, deshidratat, cu serie gradată de etanol, și următorul punct critic uscate cu un Leica LE CPD300. Probele au fost acoperite prin pulverizare cu 15 nm aur (K550X, Emitech) și sonda cu un Zeiss SigmaHD Domeniul de Emisie Microscop electronic de Scanare. SEM micrographs au fost înregistrate la 5 kV tensiune de accelerare si o distanta de lucru de 5 mm. Fibre cu diametre au fost măsurate folosind ImageJ.,
Fibrină polimer permeabilitate test
Fibrinogen sau fibrinogen-IPA (1 mg/mL în 50 mM Hepes, Cu 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) a fost incubate cu 1 unitate/mL de trombina bovină (Sigma) pentru 2 ore la 22 °C într-un volum total de 0,2 mL din polipropilena cromatografie pe coloane cu un diametru interior de 4,6 mm. Coloanele au fost innobilate cu 0,8 mL de tampon Hepes și flux (J) a fost calculată la greutatea de picături care s-a infiltrat în 20 min., De permeație (Darcy) constant33 a fost calculată din relația, Ks = JƞA/LP, unde J este fluxul (cm3/s), ƞ este vâscozitatea tampon (0.01 echilibru la temperatura camerei), a este secțiunea transversală de cheag (0.17 cm2), L este lungimea de cheag (1,1 cm), iar P este presiunea hidrostatică (1,018,218 dyne/cm2).
testul de compactare a polimerilor de fibrină
Fibrinogen sau fibrinogen-IPA (1 mg/mL în Hepes 50 mM, 0,14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a fost incubat cu 1 unitate / mL trombină bovină (Sigma) timp de 16 ore la 22 °C într-un volum total de 0,5 mL în 1.,5 mL tuburi microcentrifuge acoperite anterior cu 10 mg/mL PEG-20000 în apă și uscate la aer. Polimerii de fibrină au fost centrifugați la 13,000 × g timp de 5 până la 2400 s și volumul fluidului extrudat din polimer măsurat.
testul de fibrinoliză
fibrinogenul sau fibrinogenul-IPA (1,8 mg/mL în Hepes 50 mM, 0,14 m NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a fost incubat cu 1 unitate/mL de trombină bovină (Sigma) timp de 2 ore la 22 °C într-un volum total de 0,5 mL în plăci cu 24 de puțuri (15,6 mm diametru) timp de 2 plasmină (5 µl de 0.,59 µM) a fost adăugat în centrul puțurilor și plăcile incubate timp de 18 ore la 37 °C într-un mediu umed. Zonele de liză au fost determinate din media a două diametre măsurate în unghi drept.
Cuantificarea redox membre ale α2-macroglobulin legăturile disulfurice
10 donator sănătos plasme descrise mai sus pentru analiza fibrinogenului au fost utilizate pentru analiza de α2-macroglobulin folosind aceleași proceduri. Plasmă (0.,7 mL) a fost incubate cu policlonali anti-α2-macroglobulin anticorp (Dako, Cat Q0102, Mult 20068567)-acoperite Dynabeads (Life Technologies) pe o roată de rotație, timp de 1 h la 22 °C. margele au fost colectate, excesul de plasmă aspirat, și incubate în 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA în ser fiziologic tamponat cu fosfat care conține 10% DMSO pentru 1 h la 22 °C în întuneric pentru a alchila nepereche Cys tiolilor în proteine. Supernatantul a fost aspirat, si margele incubate cu NuPAGE LDS eșantion tampon (Life Technologies), care conține o suplimentare de 5 mM 12C-IPA pentru 30 de minute la 60 °C. supernatantele au fost rezolvate la SDS-PAGE., SDS-PAGE gelurile au fost colorate cu coloidal coomassie (Sigma) și α2-macroglobulin trupa excizate, destained, uscate, incubate cu 40 mM dithiothreitol și washed14. Gel felii au fost incubate cu 5 mM 13C-IPA (Cambridge Izotopi) pentru 1 h la 22 °C în întuneric pentru a alchila disulfurice bond Cys, spălate și uscate înainte de digestie de proteine, cu 12, 5 ng/µl de tripsină (Promega) în 25 mM NH4CO2 peste noapte la temperatura de 25 °C. Peptide au fost eluat din felii cu 5% acid formic, 50% acetonitril., Cromatografia lichidă, spectrometria de masă și analiza datelor au fost efectuate conform descrierii pentru fibrinogen34. Au fost analizate 17 peptide care conțin Cys (tabelele suplimentare 2 și 4). Diferitele forme redox ale reziduurilor Cys au fost cuantificate din abundența relativă a ionilor de peptide marcate cu 12C-IPA și/sau 13C-IPA.
Rezumatul raportării
informații suplimentare despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul raportării cercetării naturii legat de acest articol.