Creșterea economică și dinamica nutrienților de Ochromonas sp.,, tulpina BG-1
Phagotrophy de phototrophic flagelate este considerat a conferi semnificative avantaje ecologice pe alge care prezintă comportament (Flynn și Mitra, 2009), dar există, de asemenea, pare a fi limitări (deși în mare măsură uncharacterized) pentru efectuarea amestecat nutriție simultan într-o singură celulă (Raven, 1997). Aceste constrângeri pot implica costuri sau compromisuri pentru menținerea mașinilor celulare duale (în comparație cu concurenții specializați) sau poate discuții încrucișate între căile biochimice anabolice și catabolice care confundă performanța ambelor activități simultan., Din păcate, nu există practic informații cantitative privind costurile și beneficiile comportamentului mixotrofic și nici dacă ambele procese sunt efectuate secvențial sau simultan de către aceste specii. Partiționarea temporală ar putea fi un mecanism pentru menținerea ambelor abilități în celulele minute (deși punerea unui proces „în așteptare” la un moment dat)., Evaluează dacă ambele comportamente au loc simultan, fiziologice specifice beneficiu(s) pentru nutriție heterotrofă în mixotrophic alge, și capacitatea de reacție a acestui comportament abiotice și biotice variabile sunt aspecte ale mixotrophic nutritie care au fost dificil de a stabili folosind abordări tradiționale și metode.am studiat chrysophyte ochromonas SP., tulpina BG-1 deoarece poate fi cultivată în culturi axenice (fără bacterii) și a fost raportată anterior ca fiind un organism predominant heterotrofic care atinge rate mari de creștere numai în prezența bacteriilor (Sanders et al., 2001). Creșterea în axenic cultură a împiedicat potențial complică interacțiuni biologice și elementar fluxurile care rezultă din activitățile de alte microorganisme vii în culturi, permițând astfel o comparație între nanoSIMS și în vrac ȘI măsurători și o mai bună înțelegere de anumite surse de carbon și azot utilizate pentru creșterea de alge.,în plus, utilizarea unei singure surse anorganice de azot a simplificat proiectul nostru experimental, astfel încât singurele surse de azot din mediu au fost amoniul sau HKB. Alge, în general, posedă mecanisme pentru absorbția și asimilarea atât de amoniu și de nitrat, dar transcriptomica datele indică faptul că unele chrysophytes, inclusiv Ochromonas sp. tulpina BG-1, ar putea lipsi capacitatea genetică de asimilare a nitraților (Terrado et al., 2015; Lie și colab., 2017)., În plus, tamponul MES nu a fost adăugat la mediu în experimentele noastre, deoarece acest lucru ar fi putut oferi o sursă alternativă de azot. MES ar fi putut constitui, de asemenea, o sursă de carbon organic pentru alga (Sanders et al., 2001), iar eliminarea sa a asigurat că singurele surse de carbon din Mediu erau fie bicarbonatul, fie HKB. Transcriptomica analiza de experimente efectuate în același mod ca și cele prezentate în acest manuscris arată că fotosintetice utilaje de Ochromonas sp. tulpina BG-1 este exprimată și reglată în prezența luminii (Lie et al., 2017)., Această abordare simplificată, combinată cu etichetarea izotopilor stabili, ne-a permis să determinăm ce sursă(surse) de azot și carbon au fost utilizate pentru creșterea algei.ratele semnificative de creștere a Ochromonilor în studiul de față au fost obținute numai în timp ce HKB au fost abundente ca pradă (figura 1a). Dinamica Chl a în cultură a reflectat, de asemenea, ratele ridicate de creștere datorate pășunatului pe HKB, deoarece concentrația celulei Chl a−1 a scăzut cu un ordin de mărime în primele 48 de ore de incubare pentru culturile cultivate atât în lumină, cât și în întuneric continuu (figura 1D)., Aceste modificări ale clorofilei celulare ar putea fi legate de o diluție a Chl a în interiorul celulelor datorită ratelor mari de creștere ale algei (Hansen et al., 2000), astfel încât reducerea Chl a cell−1 a fost o consecință a ratelor de creștere rapidă a algei și nu o reducere directă a ratei de biosinteză a clorofilei. Cu toate acestea, este posibil, de asemenea, că există un regulament de biosinteza clorofilei când HKB au fost prezenți ca transcriptomica analiza pe aceasta alga sugerează supraexprimarea genelor legate de clorofilă sinteză în prezența luminii atunci când HKB au fost epuizate (Lie et al., 2017)., În orice caz, aceste observații sunt în acord cu studiile anterioare ale Ochromonilor (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), care a observat-o bine dezvoltat heterotrofe capacitate, ceea ce sugerează că fixarea dioxidului de carbon și poate și în alte structuri celulare și procese implicate în fotosinteză sunt reduse atunci când în creștere mixotrophically, cum s-a observat pentru alte alge (Wan et al., 2011).amoniu dizolvat, precum și fosfat, acumulate în culturile de Ochromoni în primele 48 de ore ale experimentelor, când HKB au fost pășunate activ (Figura 2)., Acest rezultat indică faptul că excesul de azot și fosfor din HKB pășunat a fost excretat de alga. Bilanțul masic calcule bazate pe schimbări în prada/alge abundența și lor celulare azot conținutul indicat că până la 50% din azotul conținut în consumată HKB a fost asimilat de alge, în timp ce o cantitate considerabilă de excesul de azot a fost lansat în primul rând de amoniu în timpul perioadei de activ bacteriene pășunat (Figura 2)., Aceste valori de asimilare de azot (și excreția) sunt în concordanță cu asimilarea eficiența heterotrofe protistele de dimensiuni similare (Taylor, 1982; Caron și Goldman, 1990), în concordanță cu concluzia că Ochromonas a fost în creștere în mod predominant ca un heterotroph când prada au fost abundente. În plus, analizele transcriptomice au demonstrat că diferiți transportori de amoniu sunt exprimați prin Ochromonas sp. tulpina BG-1 care crește pe HKB în comparație cu creșterea după ce bacteriile au fost pășunate la abundențe foarte scăzute (Lie et al., 2017)., Prin urmare, se pare că transportorii pentru exportul de amoniu din celulă pot fi diferiți de cei utilizați pentru absorbția amoniului, așa cum s-a observat pentru alte organisme (Shnaiderman et al., 2013).interesant este că concentrațiile de amoniu, dar nu fosfat, au scăzut în mediu odată ce HKB a fost îndepărtat prin pășunat (adică după 48 h; Figura 2) Când Ochromonas a fost crescut în lumină., Acest rezultat pare să indice faptul că alga a preluat în mod activ amoniu (dar nu fosfat) din mediu atunci când bacteriile nu mai erau disponibile și a fost indusă fotosinteza (figura 1D). În schimb, atât amoniul, cât și fosfatul din culturile cultivate în întuneric au continuat să crească pe tot parcursul experimentului (linii punctate în Figura 2). Nu s-a înregistrat o creștere semnificativă a populației de alge după epuizarea prăzii, chiar și în lumină, iar explicația dihotomiei în absorbția acestor două elemente este neclară., Speculăm că amoniul a fost preluat deoarece a fost necesar în mod special pentru reconstruirea mașinilor fotosintetice ale celulei.
În continuare aspectul de fosfat în mediul de cultură în timpul mai târziu o parte din experimente contrastează cu studii din alte Ochromonas specii care au raportat o absorbție de fosfat când alga este în creștere autotrophically (Rothhaupt, 1996)., Lipsa de fosfat absorbția prin tulpină BG-1 ar putea indica faptul că acest Ochromonas a fost incapabil de eficiente fosfat de absorbție (care s-ar putea explica, în parte, cei săraci phototrophic creșterea capacității de această tulpină), sau că fosforul nu a fost nevoie în cantități semnificative pentru celulare reorganizare asociate cu schimbarea phototrophic de creștere, și, prin urmare, absorbția nu a fost stimulat de schimbare a phototrophy., Este puțin probabil ca creșterile continue ale concentrației de fosfat să se datoreze descompunerii compușilor organici fosforici dizolvați în mediu, deoarece culturile nu aveau bacterii vii.
Inferențe de izotop stabil de sondare experimente
analiză cu izotopi stabili (nanoSIMS și în vrac analiza elementală-SMRI) a arătat că atât anorganice (13C-bicarbonat și 15N-amoniu) substraturi și 13C/15N-etichetate HKB au fost asimilate de către Ochromonas, contribuind la 15N și 13C celulare îmbogățire după 48 h de incubare (Figura 4)., Cu toate acestea, magnitudinea de îmbogățire din substraturi anorganice sau HKB a indicat că, în timpul mixotrophic creștere, principalele surse de carbon și azot au fost derivate din phagotrophy. Izotopică a masei de echilibru a indicat că 88-95% din azot și de 84-99% de carbon au fost derivate din HKB când Ochromonas a fost în creștere mixotrophically în lumină. O îmbogățire a 13C a fost observată la algele cultivate în lumină comparativ cu întunericul (experimentul 1 vs experimentul 3) când bicarbonatul de 13C a fost disponibil (Figura 4)., Cu toate acestea, contribuția calculată a fixării fotosintetice a carbonului a fost de numai 1-10% din carbonul asimilat în biomasă. Eficiența mai mare a încorporării azotului din pradă observată în lumină în raport cu întunericul continuu (Figura 3; experimentele 1, 2 vs experimentul 3) sugerează că lumina a jucat un rol, deși minor, în eficiența fagotrofică a algei., Prin urmare, în ciuda prezumtiv reducerea fotosintetică utilaje de Ochromonas în creștere phagotrophically pe HKB (după cum reiese din celule scăzut cotele de Chl o; Figura 1d), lumina a avut un minor si un impact pozitiv asupra algelor nutriție. Deoarece cantitatea de carbon fixată prin fotosinteză reprezentat o mică parte din carbon asimilat de alge atunci când în creștere pe HKB, putem specula că fotosintetice, aparatul poate fi furnizarea de energie, mai degrabă decât de carbon pentru material celular, ca acesta a fost emis ipoteza pentru Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
calculele noastre de echilibru izotopic de masă au două avertismente. În primul rând, nu am controlat evoluția pH-ului în cadrul culturilor, ceea ce ar fi oferit perspective mai bune asupra echilibrului carbonatului care ar fi putut fi afectat de respirație și fixarea carbonului și de schimbul cu atmosfera. Ca atare, estimarea noastră bazată pe experimentele care utilizează carbon anorganic etichetat ar fi putut subestimat cantitatea de carbon anorganic fixată de Ochromonas sp. BG-1 (1% conform balanței masei izotopice)., În orice caz, experimentul care utilizează HKB etichetat nu ar fi trebuit să fie afectat de această avertizare, iar estimarea a 10% din carbonul derivat din substratul anorganic este probabil realistă. În al doilea rând, Ochromonas este considerat un fixator ineficient de carbon din cauza lipsei mecanismelor de concentrare a carbonului (Maberly et al. 2009) care cresc concentrația de CO2 prin transportul de CO2 și / sau bicarbonat către enzima RubisCO (Raven et al., 2008). Pe de altă parte, analizele transcriptomice au arătat că mecanismul fotosintetic al tulpinii BG-1 este funcțional (Lie et al.,, 2017), și experimente folosind etichetate bicarbonat arătat o semnificativă îmbogățirea 13C fracționată abundență în Ochromonas (Figurile 4 și 5); prin urmare, Ochromonas sp. tulpina BG-1 are o anumită capacitate de a utiliza carbonul anorganic, deși ineficient.cu toate acestea, activitatea heterotrofică puternică a Ochromonilor în timp ce crește mixotrofic este probabil să crească CO2 intracelular, precum și fluxul său. De regulă, se consideră că protiștii heterotrofici asimilează 40% din materia organică ingerată, în timp ce eliberează 30% și respir încă 30% (Sleigh, 1989)., Pe baza acestui fapt, cantitatea totală de carbon eliberată de Ochromonas ca CO2 în timpul creșterii exponențiale ar putea fi la fel de mare ca bicarbonatul total adăugat la începutul incubării, ceea ce are consecințe asupra echilibrului masei izotopice pe care l-am prezentat. Dacă presupunem că CO2 îmbogățit izotopic derivat din respirația HKB este disponibil la aceleași niveluri ca și carbonul anorganic dizolvat, incubarea efectuată cu Ochromonas și HKB etichetat a indicat că ~84% din carbon a fost derivat din HKB., Până la 20% din carbonul asimilat derivat din HKB ar putea corespunde de fapt carbonului care a fost inițial respirat și apoi fixat de Ochromoni. Dacă este corect, respirația derivată din activitatea fagotrofică ar acționa ca un mecanism de concentrare a carbonului pentru acest Ochromonas. În timp ce sursa primară de carbon pentru Ochromonas în creștere mixotrofic a fost derivată din HKB, o cantitate non-neglijabilă ar fi putut fi derivată din respirație și apoi CO2 fixarea biomasei bacteriene.,
Ochromonas schimbat metabolismul spre autotrophy când incubate în lumină, dar numai după ce a epuizat HKB în culturi (≈ 48 h de creștere). Această schimbare a fost reflectată în abundența fracționată IRMS 13C în vrac pentru tratamentul folosind HKB marcat unde s-a observat o reducere între 48 h și 145 h (experimentul 2 din Figura 5), indicând încorporarea carbonului neetichetat în biomasa algală prin procese ușoare. Crisofitele sunt în general considerate Fixatori autotrofici săraci de carbon datorită mecanismelor slabe de concentrare a carbonului (Maberly et al., 2009)., Cu toate acestea, aceste rezultate indică faptul că a existat un nivel semnificativ de asimilare a carbonului anorganic. O comparație a culturilor cultivate în lumină (Experimentul 1 din Figura 5) și continuă întuneric (Experimentul 3 în Figura 5) a arătat că 15N fracționată abundenta de întuneric culturi nu se schimba dupa 95 h, în timp ce culturile în lumina a continuat să se îmbogățească în 15N, indicând faptul că Ochromonas continuat să asimileze azotul pentru a menține metabolismul odată HKB au fost epuizate., Aceste rezultate au fost în concordanță cu scăderile observate ale concentrației de amoniu în mediu în această perioadă de timp (figura 3a), deși apariția continuă a fosfatului în mediu în această perioadă este inexplicabilă.
am obținut un acord general bun între măsurătorile izotopilor în vrac și măsurătorile nanosimelor pentru azot, în concordanță cu observațiile din studiile anterioare (Popa et al., 2007; orfan și casă, 2009; Kopf și colab., 2015; figura 4c)., Cu toate acestea, măsurătorile în vrac au fost ceva mai mici în ceea ce privește valorile abundenței fracționate pentru carbon, în special pentru probele puternic îmbogățite (figura 4d). Speculăm că diferențele dintre nanosimuri și măsurătorile izotopilor în vrac pentru carbon pot fi legate de faptul că probele de nanosimuri au fost păstrate cu glutaraldehidă, în timp ce probele pentru analiza în vrac nu au fost. S-a demonstrat că fixarea influențează carbonul celular (Musat et al., 2014), deși ne-am fi așteptat ca acest lucru să dilueze 13C în măsurătorile nanoSIMS în raport cu valorile în vrac., O explicație mai probabilă este că măsurătorile cu o singură celulă nu sunt influențate de resturile celulare din cultură care pot fi mai puțin îmbogățite. Valoarea 13C în vrac poate fi diluată de aceste componente în raport cu măsurătorile nanoSIMS, ceea ce înseamnă că datele nanoSIMS pot reflecta mai precis absorbția carbonului și azotului de către alge. Cu toate acestea, variabilitatea de la celulă la celulă poate, de asemenea, să fi contribuit la diferențele minore dintre măsurătorile în vrac și nanosimuri.,
utilizarea nanoSIMS în acest studiu reprezintă prima aplicare a acesteia față de studiul de carbon și nutrienți fluxuri într-un mixotrophic alga, și-a permis o mai bună înțelegere de carbon și energie achiziționarea de această specie, și metabolismul celular. Descoperirile noastre extind informațiile disponibile din analizele tradiționale ale Ochromonas sp. tulpina BG-1 cultivată în diferite condiții de disponibilitate a luminii și a prăzii (Sanders et al., 2001), confirmând că cea mai mare parte a azotului și carbonului utilizat pentru creștere sunt obținute prin prada sa bacteriană., Deși rezultatele nu pot fi extrapolate direct la toate speciile de-a lungul continuum-ului de alge cu diferite mixotrophic strategii, munca noastră validează utilizarea de izotopi stabili de sondare experimente și nanoSIMS pentru a înțelege mai bine metabolice bazele de mixotrophy într-o singură specie. Mai mult, oferă o abordare pentru evaluarea nutriției mixotrofice în probele de mediu. Ochromonas sp. tulpina BG-1 a oferit un sistem model ideal pentru compararea analizei izotopilor în vrac cu nanosimi, deoarece bacteriile au fost îndepărtate rapid prin pășunat în primele 48 de ore ale experimentelor., Acordul între aceste două măsurători demonstrează că nanoSIMS capturate cu precizie dinamica de carbon și nutrienți achiziție în acest mixotroph, și ar putea fi, prin urmare, în sens mai larg aplicată pentru a explora mixotrophy în complex comunități mixte unde vrac măsuri ar fi insuficientă pentru a capta aceste dinamici. Acest lucru și viitoarele studii detaliate vor continua să aducă îmbunătățiri în înțelegerea noastră a nutriției algelor mixotrofice.