badanych
kobiety zostały zrekrutowane z fabryki w miejskiej społeczności Cuernavaca, 89 km na południe od miasta Meksyk., Stężenie hemoglobiny u wszystkich kobiet w fabryce oznaczano na podstawie próbek krwi ukłucia palcem, a następnie próbki krwi żylnej w celu określenia stężenia ferrytyny w surowicy u kobiet bez anemii. W sumie 20 kobiet bez anemii z niskim zapasem żelaza rekrutowano na podstawie stężenia hemoglobiny ⩾125 g/l i stężenia ferrytyny w surowicy <25 µg / l. kryteria wykluczenia obejmowały ciążę i laktację, zaburzenia żołądkowo-jelitowe lub metaboliczne (zapalenie jelit, przewlekła biegunka, mukowiscydoza), inne choroby przewlekłe i osoby przyjmujące suplementy żelaza., W sumie 20 pozornie zdrowych niemowląt (w wieku 6-24 miesięcy) i 20 pozornie zdrowych dzieci (w wieku 2-5 lat) rekrutowano z matek z odpowiednim poziomem hemoglobiny. Uczestnicy i rodzice dzieci zostali w pełni poinformowani o celach i procedurach badania oraz uzyskali pisemną zgodę. Komitet etyczny przy Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca, Meksyk oraz Szwajcarski Federalny Instytut Technologii, Zürich, Szwajcaria dokonały przeglądu i zatwierdziły protokół.,
wielkość próbki
obliczenia wielkości próbki zostały oparte na różnicach międzyosobniczych i wewnątrzosobniczych w wchłanianiu żelaza, jak obserwowano we wcześniejszych badaniach biodostępności żelaza u niemowląt i małych dzieci (Davidsson et al., 1994, 1997, 2000, 2004). Oszacowano, że minimalna wielkość próbki dla 20 dzieci pozwoli wykryć 50% istotną różnicę w średniej logarytmicznej absorpcji żelaza od średniej arytmetycznej początkowej absorpcji żelaza wynoszącej 7%, przy mocy 90%, poziomie istotności 0,05 (niesparowany test t) i wskaźniku błędu typu I wynoszącym 5%., Przewidując odsetek osób porzucających naukę na poziomie 10%, szacunki te wskazywały, że do ukończenia badań wymagane będzie co najmniej 20 osób z każdej grupy.
projekt badania
kobiety, Niemowlęta i dzieci zostały losowo przydzielone do otrzymania posiłku testowego z siarczanem żelaza lub fumaranem żelaza w kolejnych dniach. Testowy posiłek podawano jako śniadanie po nocnym poście. Akceptowalność testowego posiłku została potwierdzona u każdego niemowlęcia i dziecka przed włączeniem do badania. Nie wolno było jeść ani pić przez 3 godziny po całkowitym spożyciu oznaczonego posiłku., Niemowlęta i dzieci pozostawały pod ścisłym nadzorem podczas i po spożyciu posiłku testowego.
w sumie do probówek leczonych EDTA pobrano 5 ml krwi żylnej tuż przed przyjęciem pierwszego testowego posiłku i ponownie 14 dni później. Próbki krwi analizowano pod kątem wskaźników stanu żelaza (hemoglobiny i ferrytyny w surowicy) oraz składu izotopowego żelaza. Zmierzono masę ciała i wzrost w każdym punkcie pobierania krwi.
posiłek testowy
posiłek testowy był słodzonym napojem z mleka kukurydzianego na bazie lokalnego meksykańskiego napoju z kaszy kukurydzianej „atole”. Wytwarzano ją z odcedzonej mąki kukurydzianej (24.,7%), mleko pełne w proszku (11,7%), „piloncillo” (stała postać nierafinowanego brązowego cukru; 63,5%) i woda oczyszczona (200 ml) bez dodatku żelaza i kwasu askorbinowego. Standaryzowane posiłki testowe przygotowywano specjalnie na potrzeby badania z lokalnie dostępnych produktów spożywczych zakupionych luzem, z wyjątkiem odcedzonej mąki kukurydzianej, która była niedostępna w Meksyku i została otrzymana ze Szwajcarii (Swiss Mill, Zurych, Szwajcaria). Odtłuszczona mąka kukurydziana została wykorzystana do zminimalizowania zawartości kwasu fitynowego w mące, co w przeciwnym razie zmniejszyłoby biodostępność żelaza z mączki testowej (Hurrell et al., 2002)., Testowy posiłek był gotowany w obiekcie kuchennym i transportowany na gorąco do centrum żywienia w fabryce, gdzie porcja 220 g na kobietę i 60 g na niemowlę i dziecko była przygotowana jako śniadanie, a następnie spożycie wody. Wszystkie posiłki testowe były identyczne z wyjątkiem 4 mg Fe (kobiety) lub 2,5 mg Fe (Niemowlęta i dzieci) jako fumaran żelaza lub siarczan żelaza, które zostały dodane do posiłku testowego bezpośrednio przed podaniem. Proszek fumaranu żelaza dodawano bezpośrednio do mączki testowej, a siarczan żelaza dodawano jako roztwór.,
stabilne etykiety izotopowe
fumaran żelazawy został wyprodukowany przez dr Paul Lohmann GmbH (Emmerthal, Niemcy) z wzbogaconego żelaza elementarnego przy użyciu zmniejszonej procedury ich równoważnego komercyjnego procesu produkcyjnego. Ta sama procedura została wykorzystana w poprzednich badaniach (Davidsson et al., 2000, 2001, 2002; Fidler et al., 2003; Sarker et al., 2004). Poszczególne dawki fumaranu żelaza były wstępnie ważone w probówkach polietylenowych, przy czym dokładną ilość dodanego leku określano na podstawie masy probówki, a następnie przechowywano., – siarczan żelaza został przygotowany z izotopowo wzbogaconego żelaza pierwiastkowego (Chemgas, Boulogne, Francja), który rozpuszczono w 0,1 mol H2SO4/l i uzupełniono do odpowiedniego stężenia. Roztwór przechowywano w atmosferze argonu w butelce polietylenowej do czasu potrzebnego i ważono w pojedynczych dawkach przed karmieniem.,
skład izotopowy obu etykiet został zmierzony w trzech egzemplarzach za pomocą spektrometrii mas ujemnej jonizacji termicznej przy użyciu spektrometru mas sektora magnetycznego (MAT262; Finnigan MAT, Brema, Niemcy) wyposażonego w wielokolorowy system kubków Faradaya do wykrywania jonów. Stężenie żelaza w każdej etykiecie mierzono w trzech egzemplarzach metodą odwrotnej analizy rozcieńczenia izotopowego (Walczyk, 1997). Fumaran żelaza rozpuszczono w stężonym kwasie azotowym przed rozcieńczeniem izotopowym., Norma żelaza o naturalnym składzie izotopowym została przygotowana grawimetrycznie z izotopowego materiału odniesienia (IRMM – 014; E. U. Institute of Reference Materials and Measurements, Geel, Belgia). Wskaźniki izotopowe mierzono za pomocą spektrometrii mas jonizacji termicznej ujemnej (Walczyk, 1997).
skład izotopowy próbek krwi
wzbogacone próbki krwi pełnej zostały mineralizowane przez trawienie mikrofalowe przy użyciu mieszaniny stężonego HNO3 i H2O2 (30%) jako utleniaczy., Żelazo zostało oddzielone od matrycy chromatografią wymiany anionów i etapem ekstrakcji ciecz-ciecz do eteru dietylowego (Walczyk et al., 1997). Podczas całej procedury przetwarzane były puste środki chemiczne. Skład izotopowy oddzielonego żelaza mierzono za pomocą spektrometrii mas ujemnej jonizacji termicznej.
Stan żelaza
świeżo pobrane próbki krwi pełnej zostały rozdzielone do pomiaru stężenia hemoglobiny za pomocą przenośnego fotometru HemoCue (Hemocue Inc., Angelholm, Szwecja) i znormalizowanych technik., Odpowiedni materiał kontroli jakości analizowano na początku każdego dnia pobierania próbek (Hemocue Inc., Angelholm, Szwecja). W ETH w Zurychu oddzielono podlicznik pełnej krwi do pomiarów stężenia ferrytyny w surowicy za pomocą zautomatyzowanego testu immunologicznego (Immulite One; DPC, Los Angeles, CA, USA), a pozostała krew pełna została zamrożona do późniejszej analizy składu izotopowego.,
Obliczanie absorpcji żelaza
ilości etykiet izotopowych 57fe i 58fe we krwi, 14 dni po podaniu, obliczono na podstawie przesunięcia stosunku izotopowego Fe i szacowanej ilości żelaza krążącego w organizmie. Obliczenia opierały się na zasadach rozcieńczania izotopowego, biorąc pod uwagę, że oznaczenia izotopowe żelaza nie były monoizotopowe. Krążące żelazo obliczono na podstawie objętości krwi i stężenia hemoglobiny. Obliczenia objętości krwi zostały oparte na masie ciała i wzroście według Brown et al. (1962) for women and Linderkamp et al., (1977) dla dzieci. Dla obliczenia ułamkowej absorpcji żelaza, 80% włączenie wchłoniętego żelaza do erytrocytów przyjęto dla kobiet (Hosein et al., 1967) i 90% dla dzieci (9). RBV fumaranu żelaza obliczono dla każdego zestawu danych.
analiza statystyczna
ułamkowe wartości absorpcji żelaza są przedstawione jako środki geometryczne i s.D. wszystkie badania statystyczne były zasilane w 80% i wykonywane z 95% przedziałem ufności na danych log-transformowanych, ponieważ wartości absorpcji żelaza nie są normalnie rozłożone., Test t-sparowany ucznia został użyty do porównania danych w każdej grupie wiekowej. RBV fumaranu żelaza między grupami wiekowymi porównywano za pomocą testu t Nieparowanego przez ucznia. Statystyczna analiza mocy została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego oprogramowania (StatMate 2; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Regresja liniowa została użyta do oceny zależności między wchłanianiem żelaza a zapasami żelaza (reprezentowanymi przez ferrytynę w surowicy), a korelacja Pearsona została użyta do zbadania zależności między ferrytyną w surowicy a RBV.