stworzenie wykresu konturu na podstawie bezpośrednich danych doświadczalnych wymaga zastosowania wykonalnej metody o dużej przepustowości i znacznej liczby próbek. W związku z tym test musi być odpowiedni do stosowania w konstrukcji płyty 96-studziennej., Ogólne zalety tej miniaturyzacji z rurek jedno-reakcyjnych do płytek 96-studziennych zostały już pokazane dla DNSa i innych testów kolorymetrycznych . Wszystkie testy użyte w tym badaniu były odpowiednie dla formatu płyty 96-studziennej. Aby uzyskać Wykres konturu, mieszaniny enzymu i substratu inkubowano przy ośmiu różnych poziomach pH. Te osiem poziomów pH inkubowano w 12 różnych temperaturach za pomocą gradientowego cyklera PCR, co dało 96 unikalnych warunków reakcji. Do pozyskania danych użyto czytnika płyt., Wyniki zostały przekształcone w działania względne z najwyższą aktywnością na każdej płycie ustawiono na 100%. Pomiar przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a uśrednione wartości zostały następnie przekształcone w Wykres konturowy przy użyciu SigmaPlot, jak opisano w sekcji Materiały i metody. Aktywność (oś z) jest reprezentowana jako kolor od fioletowego do czerwonego zamiast normalnej osi, aby poprawić widok wykresu konturu.,
system buforowy
warunkiem niezawodnego określenia pH i temperatury optima jest stabilny system buforowy, który jest odpowiedni pod względem aktywności enzymu i prawie odporny na zmianę pH ze wzrostem temperatury. Alternatywnie efekt ten można uwzględnić na wykresie konturowym. Wpływ temperatury na pKa buforów i tym samym pH jest faktem, który należy wziąć pod uwagę, szczególnie w przypadku buforów alkalicznych, takich jak Tris ., W celu przeprowadzenia testu wszystkie zmiany pH naszego systemu buforu cytrynianowo–fosforanowego zostały przebadane pod kątem zmiany pH między 35 °C a 80 °C (patrz plik dodatkowy 4). Wszystkie bufory wykazują nieznaczny spadek pH wraz ze wzrostem temperatury, a bufory o wyższych wartościach pH wykazują większe odchylenia. Zależność temperaturowa wzrasta wraz z ilością fosforanu, co koreluje ze współczynnikami temperaturowymi fosforanu (−0,0028) i cytrynianu (0)., Ponieważ zależne od temperatury wahania pH wszystkich buforów były tylko niewielkie, można je pominąć przy kompilacji Wykresów konturu w zakresie stosowanych tu wartości. Niemniej jednak, jeśli należy zastosować inny system buforowy o wyższym współczynniku temperaturowym, łatwo jest dostosować wykres konturu dla zmiany pH, przypisując każdemu buforowi Indywidualne pH w każdej temperaturze., Wartości te są ustalane doświadczalnie zgodnie z opisem w odpowiednich materiałach i metodzie lub pochodzą ze współczynników temperatury i mogą być odpowiednio wykorzystane do dostosowania osi x (pH) dostarczonego pliku Sigmaplot.
wyznaczanie zakresu aktywności dla Cel8A
przegląd różnych enzymów, substratów i testów stosowanych w tym badaniu do tworzenia odpowiednich wykresów konturu podano w tabeli 1.,
Cel8A jest celulazą, a dokładniej endo-glukanazą, pochodzącą z C. thermocellum i był pierwszym enzymem z rodziny hydrolazy glikozydowej 8 .rozwiązana Struktura kryształu. W tym badaniu enzym inkubowano z BBG w celu walidacji proponowanej przez nas metody za pomocą testu DNSA. Stwierdzono, że Cel8A ma optymalną temperaturę 75 °C i optymalne pH między 5,5 a 6,5 ., Wartości te są zgodne z wynikami naszego wykresu konturu, ponieważ znajdują się w obszarze > 90% aktywności (rys. 1). Nasz wykres konturu pokazuje jednak, że enzym jest bardzo aktywny w wielu różnych warunkach. Enzym wykazuje akceptowalną aktywność przy niższych wartościach pH w temperaturze od 60 °C do 65 °C, a także wykazuje ponad 60% swojej maksymalnej aktywności przy wartościach pH poniżej 4,5. Nasza metoda umożliwia wizualizację takich efektów i ocenę działania enzymu w dowolnym momencie w ramach testowanych parametrów na pierwszy rzut oka.,
Wykres konturowy Cel8A z użyciem testu DNSA z β-glukanem jęczmienia jako substratem
aby sprawdzić, czy nasza metoda jest odpowiednia dla różnych metody analizy hydrolazy, wykonaliśmy wykres konturowy za pomocą cel8a z azo-cm-celulozy jako substratu i odpowiedniego testu (rys. 2). Wykres pokazuje podobną optima przy temperaturze 75 °C i pH 5,5. Jednak zastosowanie Azo-cm-celulozy jako substratu spowodowało nieco mniejszy zakres aktywności., Niewielkie różnice między dwoma testami mogą być spowodowane odmiennymi strukturami i rodzajami połączeń obu substratów, a tym samym różniącymi się ich właściwościami wiązania z enzymem. Azo-cm-celuloza jest nienaturalnym substratem z dodanymi grupami barwników, które mogą dodatkowo zwiększyć ten efekt. Używając Cel8A, możemy pokazać, że nasza metoda dostarcza ważnych danych i jest odpowiednia do stosowania w dwóch różnych ustalonych testach dla hydrolaz: DNSA i Azo-cm-celulozy.
Wykres konturowy Cel8A przy użyciu celulozy Azo-CM
wyznaczanie zakresu aktywności dla Celluclast®
oprócz pojedynczego enzymu badano mieszaninę enzymów. Celluclast® jest szeroko stosowanym komercyjnym produktem celulazy pochodzącym z Trichoderma reesei. Składa się głównie z celobiohydrolaz i endo-1,4-β-glukanaz, ale zawiera również ksylanazy i co najmniej jedną β-ksylozydazę . W podręczniku produktu podano, że optymalne działanie wynosi od 50 °C do 60 °C i pH 4.,5 i 6.0 . W tej pracy najpierw wykonaliśmy Wykres konturowy dla Celluclast® z BBG jako podłożem metodą DNSA (rys. 3). Wykres konturu BBG został zweryfikowany za pomocą standardowej krzywej temperatury (rys. 4). Wyniki krzywej temperatury przy pH 5,5 są zgodne z wynikami wykresu konturu, pokazując ten sam zakres aktywności. Jednak pomiar oddzielnych krzywych jest niewystarczający do opisania aktywności Celluclast® na BBG. Zakres pH, w którym mieszanina enzymu wykazuje wysoką aktywność, jest silnie zależny od temperatury., Im wyższa temperatura, tym niższe pH musi być, aby osiągnąć wysoką aktywność. Około 45 °C Celluclast® jest wysoce aktywny (> 60%) do pH 6,5, podczas gdy w temperaturze 65 °C jest bardzo aktywny tylko do pH 5,0. Opisanie działania za pomocą dwóch oddzielnych krzywych jest więc ściśle zależne od wartości wybranej jako parametr statyczny. Wykresy temperatury, na przykład te wykonane w dwóch skrajnych zakresach pH (4,5 i 6,0) powinny dawać znacznie różne wyniki. To samo dotyczy Wykresów pH pobranych w różnych temperaturach., Aby ten efekt był widoczny, wyprodukowaliśmy standardowe wykresy pH w temperaturze 45 °C, 55 °C i 65 °C (rys. 5). Te trzy krzywe pH pokazują, że wraz ze wzrostem temperatury granica pH dla wysokiej aktywności zmienia się na bardziej kwaśne wartości pH. W ten sposób trzy krzywe weryfikują wyniki widoczne na wykresie konturu. Ponadto wykazują one ograniczenia konwencjonalnego oznaczania odrębnej aktywności, która przynajmniej dla Celluclast® jest, w przypadku krzywych pH, zależna od wybranej temperatury., Zastosowanie naszej metody wykresu konturowego całkowicie omija ten problem, mierząc wpływ temperatury i pH w jednym kroku.
konwencjonalne określenie optymalnej temperatury Celluclast® przy pH 5,0., Optimum temperaturowe Celluclast® na β-glukanie jęczmienia określono przy pH 5,0. Metoda konwencjonalna pokazuje maksymalną aktywność około 55 °C i jest zgodna z wynikami widocznymi na odpowiednim wykresie konturowym
konwencjonalne pH optymalne oznaczanie Celluclast® w trzech temperaturach. Optymalne pH preparatu Celluclast® dla β-glukanu jęczmienia oznaczono w temperaturze 45 °C, 55 °C i 65 °C., W niższych temperaturach enzym może tolerować wyższe wartości pH. Jest to zgodne z odpowiednim wykresem konturu i pokazuje silny wpływ wybranego stałego parametru przy oddzielnym określaniu optymalnego pH lub temperatury
zakres aktywności Celluclast® na arabinoksylan (AX) (rys. 6) różni się od tego z BBG jako substratem. Aktywność jest znacznie przesunięta w kierunku niższych temperatur, przy czym nie obserwuje się wysokiej aktywności powyżej 60 °C., Ponieważ Celluclast® jest mieszaniną kilku enzymów, jest najbardziej prawdopodobne, że te różne enzymy mają różne cechy. Jednak wzór aktywności jest podobny do BBG; na przykład przy pH 4,5 mieszanina enzymu jest wysoce aktywna do prawie 60 °C, podczas gdy przy pH 6,5 jest wysoce aktywna tylko do 50 °C. W literaturze optimum Celluclast® na rozpuszczalnym w pszenicy AX określono za pomocą modelu powierzchni odpowiedzi (RSM) i stwierdzono, że wynosi około pH 4,4 i 39 °C., Nasz wykres konturu pokazuje najwyższą aktywność w tym samym zakresie temperatur i przy nieco wyższym pH, które nadal mieści się w optimum określonym przez RSM. Podczas gdy optimum jest prawie takie samo dla obu metod, nasz wykres konturu uderzająco pokazuje dokładną aktywność Celluclast® na AX w całym zakresie testowanych warunków i wykazuje bardziej szczegółowe rozmieszczenie niż RSM. Dzięki naszym wykresom konturowym Celluclast® na BBG i AX, możemy pokazać, że złożone mieszaniny enzymów mogą być analizowane za pomocą proponowanej metody.
Wykres konturowy produktu Celluclast® z zastosowaniem metody DNSA z arabinoksylanem jako substratem
w celu dalszego wykazania wszechstronności naszej działalności określenie zasięgu, oceniliśmy jego zastosowanie z dodatkowymi podłożami i testami. Zbadano aktywność Celluclast® na P-NP-β-D-glukopiranozyd, a Wykres konturowy przedstawiono na Rys. 7. Wysoka aktywność na tym podłożu jest ograniczona do dość wąskiego zakresu od pH 4,0 do 5,5 i 55 °C do 70 °C., Sugeruje to, że tylko jeden lub kilka enzymów w mieszaninie enzymu Celluclast® prawdopodobnie wykazuje aktywność w kierunku P-NP-β-D-glukopiranozydu. glikozydy p-NP mogą być stosowane jako substraty do przygotowania powierzchni konturowych. Jednakże nie wszystkie glikozydy p-NP są odpowiednimi substratami w teście, ponieważ kilka z nich wykazuje wysokie tło z powodu niestabilności (zob. dodatkowy plik 5), zwłaszcza gdy wysokie temperatury są połączone z wysokimi wartościami pH.
Wykres konturowy Celluclast® przy użyciu P-NP-β-D-glukopiranozydu
aby przetestować zastosowanie naszej metody na naturalnej próbce biomasy wybraliśmy podłoże na bazie słomy. Wyzwolenie glukozy przez Celluclast ® zostało wykryte przy użyciu komercyjnego testu D-glucose HK (Megazyme). Głównym składnikiem ściany komórkowej słomy jest celuloza, która jest głównym źródłem enzymatycznie wyzwolonej glukozy. Wykres konturowy (rys., 8), dlatego przede wszystkim wykazuje aktywność Celluclast® na krystalicznej celulozie, która jest oporna na degradację enzymatyczną . Najwyższe uwalnianie glukozy obserwowano przy pH od 4,0 do 5,5 oraz od 40 °C do 60 °C. Zakres o wysokiej aktywności jest więc mniej szeroki niż określony dla BBG, co należy uwzględnić w procesie mającym na celu głównie degradację celulozy., Dzięki zastosowaniu D-glukozy HK I P-NP-β – D-glukopiranozydu jako alternatywnych testów, mogliśmy wykazać zdolność adaptacji naszej metody do czterech różnych i powszechnie stosowanych testów hydrolazy glikozydowej. Wykorzystanie słomy wykazało, że nasza metoda nadaje się również do naturalnych podłoży o znaczeniu przemysłowym i może być stosowana do oceny złożonych procesów i podłoży. Celluclast ® wykazuje różne profile aktywności na różnych podłożach., Zbiorczo dla wszystkich metod, jest, zatem, kluczowe dla określenia pH i temperatury zakres danych enzymu z substratem zainteresowania.
Wykres konturowy produktu Celluclast® z wykorzystaniem testu d-glukozy HK z naturalnym substratem na bazie słomy
rozważania podczas stosowania metody
w przypadku wytworzenia wykresu konturowego proponowaną metodą należy wziąć pod uwagę kilka czynników., Podłoże musi być stabilne, a zmierzone tło odtwarzalne w pełnym zakresie warunków w płytce 96-studziennej. Jest to warunek wstępny, ponieważ kontrola podłoża musi być odjęta od wszystkich wartości przed konwersją na działania względne, ale nie może być bezpośrednio zmierzona na płycie dla każdego z 96 warunków. Na przykład nie można użyć kilku substratów glikozydowych p-NP, ponieważ wykazują one silnie zależne od temperatury i pH podłoże. Bardzo precyzyjne pipetowanie jest konieczne, aby uzyskać akceptowalny poziom odchylenia standardowego od triplikatów., Zdecydowanie zaleca się stosowanie pipet 96-głowicowych i 8-kanałowych, ponieważ znacznie poprawiają one dokładność i przyspieszają zabieg. Ponadto, czytnik płyt i gradientowy PCR cycler są wymaganiami technicznymi do prawidłowego wykonania metody. Zakres temperatury, w którym można przeprowadzić metodę, można dostosować zgodnie z właściwościami technicznymi gradientowego cyklera PCR, który jest zwykle ograniczony do 30 °C lub 40 °C i często nie może obejmować wartości poniżej 20 °C., Bezpośrednio przekonwertowaliśmy absorbancję na względną aktywność enzymu, ponieważ wszystkie wartości są na liniowej krzywej kalibracji (dane nie są pokazane). Jeśli jednak tak nie jest, aktywność musi być najpierw obliczona, na przykład w U/mg, a wartości te mogą być następnie wykorzystane do wytworzenia wykresu konturu. Chcąc wytworzyć Wykres konturu dla enzymu silnie zależnego od dwuwartościowych jonów metali, należy użyć innego układu buforowego, ponieważ bufory na bazie cytrynianu i fosforanu kompleksują te jony.,
podczas gdy podejścia RSM są bezsprzecznie potężnym narzędziem do oceny złożonych relacji, na przykład różnych zmiennych wpływających na wiele czynników, określanie wpływu tylko pH i temperatury na aktywność nie jest zbyt skomplikowane, aby można było osiągnąć przez bezpośredni pomiar. Określenie prawidłowych wartości granicznych modelu może mieć kilka podejść i może mieć wpływ na powstały model. Model RSM pochodzi tylko z niewielkiej liczby pomiarów wokół centralnego punktu aktywności enzymu, a dokładność względem rzeczywistych wartości eksperymentalnych musi zostać następnie przetestowana., Ogólna rozdzielczość RSM jest zatem niższa niż uzyskana w naszej metodzie, co utrudnia obserwację efektów aktywności, jak pokazano dla Celluclast® w wyższych temperaturach i / lub wartościach pH. Nasza metoda nie wymaga umiejętności projektowania złożonych modeli statystycznych i może być wykonywana przy minimalnych i stosunkowo standardowych wymaganiach technicznych. Wadą zarówno naszej metody, jak i RSM jest to, że bezpośrednia wizualizacja odchylenia standardowego w trójwymiarowym wykresie nie jest możliwa., Nasza metoda umożliwia jednak obliczenie odchylenia standardowego dla każdego punktu danych. Większość modeli RSM określić odchylenie standardowe dla całego modelu tylko z danych centralnego punktu danych modelu, podczas gdy inne punkty danych są mierzone tylko raz . Odchylenia standardowe są naturalnie wyższe na granicy aktywności enzymu i ilustrują silny wpływ na aktywność w niewielkiej zmianie warunków. W okolicach optymalnych i w obszarach o zerowej lub niskiej aktywności odchylenia są znacznie niższe., Ponieważ proponowana metoda daje pełny zestaw danych czynnikowych, w razie potrzeby do dalszej analizy możliwe byłoby obliczenie modelu statystycznego. Pochodny model statystyczny opierałby się bezpośrednio na danych eksperymentalnych, ale stanowi dodatkowy krok, który nie powinien być konieczny dla standardowych zastosowań metody.
podsumowując, łatwa ocena przydatności enzymu lub mieszaniny enzymatycznej do kombinacji parametrów procesu ma kluczowe znaczenie przy projektowaniu procesów biotechnologicznych na skalę laboratoryjną lub przemysłową., Temperatura i pH to dwa z najważniejszych czynników procesowych wpływających na aktywność enzymów. Konwencjonalne podejścia do badania wpływu tych czynników na enzymy opierają się na założeniu, że istnieje dwuwymiarowa korelacja między temperaturą i aktywnością oraz pH i aktywnością. Natomiast nowe podejścia określają związek w materii trójwymiarowej, ale są oparte na statystykach, złożone w projektowaniu, a ich dokładność do rzeczywistych danych może się różnić., Metoda ta pozwala na szybkie i łatwe określenie wpływu temperatury i pH na aktywność enzymu jednocześnie za pomocą płyt 96-studziennych, pipet wielokanałowych i gradientowego cyklera PCR. Za pomocą tego podstawowego wyposażenia technicznego możliwe jest wytworzenie konturowych Wykresów pH, temperatury i aktywności, które są oparte bezpośrednio na danych eksperymentalnych. Metoda została przebadana pod kątem kilku szeroko rozpowszechnionych testów hydrolazy glikozydowej, a także substratów modelowych i złożonych.