pobieranie i przetwarzanie krwi
wszystkie procedury związane z pobieraniem krwi ludzkiej od zdrowych ochotników były zgodne z Komitetem etyki badań ludzkich Uniwersytetu w Sydney (zatwierdzenie HREC 2014/244) i uzyskano świadomą zgodę wszystkich osób., Wszystkie procedury związane z pobieraniem ludzkiej krwi od pacjentów ECMO były zgodne z Alfred Hospital Ethics, Monash University Standing Committee for Research in Humans (zatwierdzenie 388/13), a świadomą zgodę uzyskano od wszystkich osób. Wszystkie procedury były zgodne z deklaracją Helsińską z 1983 roku. Krew została pobrana przez wenesekcję za pomocą igły Terumo 21 g motyla od 10 zdrowych dawców bez leków (czterech mężczyzn, sześć kobiet, 22-58 lat)., Pierwsze 5 mL krwi wyrzucono, aby uniknąć powstawania trombiny wokół miejsca wkłucia igły, a następnie pobrano do probówek zawierających 3,2% obj./obj. cytrynianu sodu. Krew ośmiu pacjentów z jednego ośrodka, którzy mieli wsparcie ECMO (czterech mężczyzn, cztery kobiety, 34-67 lat) została pobrana do probówek ACD-a (BD Vacutainer)., Pacjenci ze wsparciem ECMO otrzymywali leki przeciwzakrzepowe i (lub) przeciwpłytkowe w oparciu o decyzję lekarza lub wytyczne instytucjonalne, w których pacjenci zazwyczaj rozpoczynali leczenie warfaryną, docelowym międzynarodowym współczynnikiem znormalizowanym (INR) 2-3, z pomostowym wlewem heparyny i terapią Aspiryną, a także dipirydamolem dla osób, które są uważane za wysokie ryzyko zakrzepicy. Osocze przygotowywano przez dwukrotne odwirowanie w temperaturze 800 × g przez 20 min w temperaturze pokojowej., W niektórych przypadkach zdrowe osocze dawcy było ścinane z szybkością 2000 s−1 lub 10000 s-1 przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu reometru Kinexus pro+.
zbiór fibrynogenu hepatocytów
w DMEM, 10% surowicy płodowej cieląt i glutamaxie w temperaturze 5% CO2 i 37 °C. komórki w 80-90% zbiegu przemyto roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, inkubowano przez 18 godzin w DMEM bez surowicy w temperaturze 5% CO2 i 37 °C lub w komorze niedotlenienia w temperaturze 1% O2, 5% CO2 i 37 °C., Zebrano uwarunkowane podłoże (1 mL na 4 × 106 komórek), a wydzielony fibrynogen natychmiast przetworzono, jak opisano poniżej.
testy fibrynogenu i fibryny
próbki osocza były nieleczone lub inkubowane z trombiną i / lub inhibitorem polimeryzacji fibryny, GPRP (Sigma). Fibryna była przygotowywana w 1 mL osocza przez dodanie 50 jednostek trombiny bydlęcej (Sigma) oraz 10 mM CaCl2 i MgCl2 przez 40 minut w temperaturze 22 °C. polimery fibryny zostały zebrane za pomocą plastikowego pręta., W jednym z eksperymentów osocze (2 mL) inkubowano z 27 jednostek/mL trombiny i 10 mm CaCl2 i MgCl2 przez 40 minut w temperaturze 22 °C, a polimer fibrynowy zebrał się na plastikowym pręcie i usunął. Zubożone osocze inkubowano z inną podwielokrotnością 27 jednostek/mL trombiny i zebrano i usunięto nowy polimer fibrynowy. Przed i po dodaniu obu partii trombiny pobrano podwielokrotność osocza (0,2 mL), dodano 150 µM ketonu chlorometylowego d-fenyloalanylo-prolilo-arginylo (PPACK, Sigma) w celu zahamowania aktywności trombiny, a próbki inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 22 °C., Zawartość fibrynogenu w próbkach osocza oszacowano poprzez pobranie białka na poliklonalnych koralikach pokrytych przeciwciałami antyfibrynogenu( patrz niżej), rozdzielenie fibrynogenu na stronie SDS i barwienie koloidalnym Coomassie. W innym eksperymencie plazmę inkubowano za pomocą 8 mM GPRP (Sigma) przez 5 minut w temperaturze 22 °C przed dodaniem 50 jednostek/mL trombiny przez 60 minut w temperaturze 22 °C. reakcję hartowano za pomocą 150 µM PPACK przez 10 minut w temperaturze 22 °C. oczyszczone fibrynogeny wyizolowano ze zdrowego dawcy świeżo mrożonego osocza przez wytrącanie β-alaniny32 lub otrzymano komercyjnie (Sigma F4883).,
oznaczanie Stanów redoks wiązań dwusiarczkowych fibrynogenu i fibryny
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) powlekano 16 µg poliklonalnych przeciwciał przeciw fibrynogenowi (DAKO, Cat A0080, Lot 00015063) w 1 mL buforowanej fosforanem soli fizjologicznej na obracającym się kole przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C, a nadmiar przeciwciał usuwano przez trzykrotne przemywanie 1 mL buforowanej fosforanem soli fizjologicznej. Osocze (0,7 mL) lub podłoże uwarunkowane HepG2 (4,5 mL) inkubowano 2 mg powlekanych kulek na obracającym się kole przez 1 h w temperaturze 22 °C., Koraliki zebrano za pomocą magnesu, nadmiar osocza zasysano w celu zmniejszenia objętości i inkubowano w 0,3 mL 5 mM 12C-IPA w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 10% DMSO przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności do alkilowania niesparowanych tioli Cys w białkach. Supernatanty zasysano, a Kulki inkubowano buforem próbki nupage LDS (Life Technologies) zawierającym dalsze 5 mM 12C-IPA przez 30 minut w temperaturze 60 °C. supernatanty rozwiązano na stronie SDS., Polimery fibryny wytworzone w osoczu zostały zebrane na plastikowym prętu i natychmiast zanurzone w 1 mL 5 mM 12C-IPA w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 10% DMSO przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C w ciemności. Fibrynę przemyto trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przed rozpuszczeniem polimeru w 1 mL 20 mM kwasu octowego przez 24 h w temperaturze 22 °C. dwadzieścia mikrolitrów roztworu inkubowano z buforem próbki nupage LDS (Life Technologies) zawierającym 5 mm 12C-IPA przez 30 min w temperaturze 60 °C, a białka rozwiązano na stronie SDS., Oczyszczony fibrynogen (12 µg) inkubowano z 5 mM 12C-IPA w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 10% DMSO przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności, a białko uległo ustąpieniu na stronie SDS.
żele na stronie SDS zostały zabarwione koloidalnym coomassie (Sigma), a pasma fibryny(ogen) zostały wycięte, odsączone, wysuszone, inkubowane ditiotreitolem o średnicy 40 mM i przemyte14. Plastry żelu inkubowano 5 mM 13C-IPA (izotopy Cambridge) przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności w celu alkilowania Cys wiązania dwusiarczkowego, przemyto i osuszono przed trawieniem białek z 12.,5 ng/µL trypsyny (Promega) w 25 mM NH4CO2 przez noc w temperaturze 25 °C. peptydy eluowano z plastrów 5% kwasem mrówkowym, 50% acetonitrylem. Chromatografia Nano-cieczowa (nano-LC) została wykonana przy użyciu systemu Ultimate 3000 HPLC i autosamplera (Dionex). Próbki wstrzyknięto do kolumny nano-LC bez prętów (75 µm x ~12 cm) zawierającej media C18 (1,9 µm, 120 Å ReproSil-PUR 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) i podgrzano do 45 °C we wszystkich cyklach. Peptydy eluowano przy użyciu gradientu liniowego przez 52 min, przy natężeniu przepływu 0,2 µL / min. Ruchoma faza A składała się z 0.,1% kwasu mrówkowego w H2O, natomiast Faza ruchoma B składała się z acetonitrylu:H2O (8:2) z 0,1% kwasu mrówkowego. Gradient wynosił: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B i 52 min 2% B. wysokie napięcie (2000 V) zostało zastosowane do tee o małej objętości (Upchurch Scientific), a końcówka kolumny umieszczona ~0,5 cm od podgrzewanej kapilary (T = 275 °C) spektrometru mas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron). Jony dodatnie były generowane przez jonizację elektrozaczepu, a spektrometr mas działał w trybie akwizycji zależnej od danych., Pełne skanowanie widma MS zostało pozyskane (m / z 350-1750) przez Orbitrap w rozdzielczości 30 000. 15 najobficiej występujących jonów (>5000 liczeń) ze Stanami naładowania ≥ +2 było sekwencyjnie izolowanych i fragmentowanych w liniowej pułapce jonowej przy użyciu kolizyjnie indukowanej dysocjacji z aktywacją q = 0,25 i czasem aktywacji 10 ms przy docelowej wartości 30 000 jonów. Współczynniki m / z wybrane dla MS / MS zostały dynamicznie wyłączone dla 35 s. cel AGC: 3000.00. Pułapka jonowa Pełna cel AGC: 30000,00. Pułapka jonowa Sim AGC Target: 10000.00. Pułapka jonowa MSn AGC Target: 10000.00., Dane analizowano przy użyciu demona maskotki (Wersja 2.5.0, Matrix Science) na bazie danych Swissprot. Parametry wyszukiwania to tolerancja prekursorów 6 ppm i tolerancja jonów produktu ±0,6 Da, oraz pochodna jodoacetanilidu (Cys), pochodna jodoacetanilidu 13C (Cys), utlenianie (Met) wybrane jako zmienne modyfikacje z pełnym rozszczepieniem tryptycznym do trzech pominiętych rozszczepień. Na podstawie listy peptydów zawierających cysteinę zidentyfikowanych za pomocą maskotki, ich monoizotopowy stosunek masy do ładunku (m/z) wynoszący +2, +3 i +4 oblicza się za pomocą MS-Product (Wersja v 6.2.2, narzędzia do poszukiwania białek)., Cys oznaczony jako 12C-IPA lub 13C-IPA ma masę odpowiednio 133,05276 lub 139,07289. Przeanalizowano trzydzieści peptydów zawierających Cys (tabele uzupełniające 1 i 2). Różne formy redoks pozostałości Cys zostały określone ilościowo na podstawie względnej obfitości jonów peptydów oznaczonych 12C-IPA i/lub 13C-IPA. Aby obliczyć obfitość jonów peptydów, wygenerowano ekstrahowane chromatogramy jonowe przy użyciu Kwalifiku XCalibur (v2.1.0; Thermo Scientific). Obszar został obliczony przy użyciu automatycznej funkcji wykrywania pików wbudowanej w oprogramowanie., Dane były rutynowo poszukiwane w poszukiwaniu peptydów zawierających wolne tiole Cys i nie zostały one wykryte, co wskazuje, że alkilacja niesparowanych pozostałości Cys przez 12C-IPA lub 13C-IPA była kompletna w białku.
analiza peptydów związanych z disiarczkiem fibrynogenu
zdrowe osocze dawcy (0,7 mL) inkubowano za pomocą poliklonalnych głowic Dynabeads pokrytych przeciwciałami fibrynogenu na obracającym się kole przez 1 h w temperaturze 22 °C. kulki zebrano, odsysano nadmiar osocza i dodano 0,3 mL 5 mM 12C-IPA w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 10% DMSO i inkubowano przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności., Następnie odsysano supernatant, kulki inkubowano buforem próbki NuPAGE LDS przez 30 minut w temperaturze 60 °C, a supernatanty rozwiązano na stronie SDS. Plastry żelu zawierające fibrynogen przemywano i suszono przed trawieniem 12 ng/µL trypsyny (Promega) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. reakcje zatrzymywano przez dodanie 5% (v/v) kwasu mrówkowego i peptydów eluowanych z plastrów żelu 5% kwasem mrówkowym i 50% (V/v) acetonitrylem. Peptydy w 0.,1% kwasu mrówkowego (końcowa objętość 12 µL) rozwiązano w kolumnie analitycznej o wymiarach 35 cm × 75 µm C18 z zastosowaniem gradientu acetonitrylu 2-35% w ciągu 22 minut przy natężeniu przepływu 300 nL / min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) i poddano analizie za pomocą spektrometru masowego LTQ Orbitrap Velos, jak opisano powyżej. Peptydy związane z disiarczkami były wyszukiwane przeciwko sekwencji ludzkiego fibrynogenu za pomocą oprogramowania do analizy Byonic (Wersja 3.9-7, metryki białkowe) z fałszywym wskaźnikiem wykrycia wynoszącym 1%. Wszystkie peptydy związane z disiarczkami były ręcznie kontrolowane pod kątem dokładności., Tolerancja masy prekursora i tolerancja fragmentów ustalono odpowiednio na 10 ppm i 0,6 Da. Zmienne modyfikacje definiowano jako utlenione Met, utlenione Cys (mono, di i tri) i glutationylowane Cys z pełnym rozszczepieniem trypsyny do trzech pominiętych rozszczepień.
test funkcjonalności fibrynogenu
oczyszczony fibrynogen (0,2 mL 10 mg / mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 5 mm 12C-IPA przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C w ciemności do alkilowania niesparowanych tioli Cys w białku., Niezrealizowany IPA został usunięty za pomocą kolumny odsalania spin 7 kDa Mwco Zeba (Thermo Fisher). Fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1,1 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką/mL trombiny bydlęcej (Sigma) przez 5 godzin w temperaturze 22 °C w całkowitej objętości 0,2 mL w 1,5 mL probówek mikrokentryfugowych. Polimery fibrynowe były granulowane w temperaturze 13 000 × g przez 15 min i zmierzono stężenie fibrynogenu pozostającego w supernatancie. Funkcjonalność wyraża się w % fibrynogenu zużywanego w procesie tworzenia polimeru fibrynowego.,
tworzenie się polimeru fibryny mierzone rozpraszaniem światła
oczyszczony fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką / mL trombiny bydlęcej (Sigma). Wzrost absorbancji przy 350 nm był rejestrowany co 30 s przez 15 min.
struktura polimeru fibryny mierzona skaningową mikroskopią elektronową (sem)
Fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką / mL trombiny bydlęcej (Sigma) przez 2 godziny w temperaturze 22 °C w całkowitej objętości 0,2 mL., Polimery fibrynowe były dwukrotnie płukane roztworem soli fizjologicznej 0,1 M buforu fosforanowego (PBS), utrwalane 2,5% aldehydem glutarowym w PBS przez noc w temperaturze 4 °C, następnie utrwalane 1% OsO4 w PBS, odwodnione stopniowaną serią etanolu, a następnie suszone za pomocą Leica em CPD300. Próbki były sputter powlekane złotem 15 nm (K550x, Emitech) i obrazowane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Zeiss SigmaHD. Mikrofony SEM były rejestrowane przy napięciu przyspieszającym 5 kV i odległości roboczej 5 mm. średnice światłowodów były mierzone za pomocą ImageJ.,
test przenikania polimeru fibrynogenu
Fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką/mL trombiny bydlęcej (Sigma) przez 2 h w temperaturze 22 °C w całkowitej objętości 0,2 mL w kolumnach do chromatografii polipropylenowej o średnicy wewnętrznej 4,6 mm. strumień (J) obliczono na podstawie masy kropli, które perkolowały się w 20 min., Stała przenikania (Darcy ' ego) 33 została obliczona z relacji, Ks = JƞA/LP, gdzie J jest strumieniem (cm3/s), ƞ jest lepkością bufora (0,01 poise w temperaturze pokojowej), A jest przekrojem poprzecznym skrzepu (0,17 cm2), L jest długością skrzepu (1,1 cm), a p jest ciśnieniem hydrostatycznym (1,018,218 DYN/cm2).
test zagęszczania polimerów fibryny
Fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką / mL trombiny bydlęcej (Sigma) przez 16 godzin w temperaturze 22 °C w całkowitej objętości 0,5 mL w 1.,Probówki mikrokentryfowe o pojemności 5 mL, uprzednio pokryte 10 mg/mL PEG-20000 w wodzie i suszone na powietrzu. Polimery fibrynowe zostały odwirowane w 13,000 × g przez 5 do 2400 s, a objętość płynu wytłaczanego z polimeru zmierzono.
test fibrynolizy
fibrynogen lub fibrynogen-IPA (1,8 mg/mL w 50 mm Hepes, 0,14 m NaCl, 10 mm CaCl2, pH 7,4) inkubowano z 1 jednostką/mL trombiny bydlęcej (Sigma) przez 2 h w temperaturze 22 °C w całkowitej objętości 0,5 mL w płytkach 24-studziennych (o średnicy 15,6 mm) przez 2 h w temperaturze 22 °C. 5 µl z 0.,59 µM) dodano do środka studni, a płytki inkubowano przez 18 h w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku. Obszary lizy wyznaczono na podstawie średniej dwóch średnic mierzonych pod kątem prostym.
kwantyfikacja Stanów redoks wiązań dwusiarczkowych α2-makroglobuliny
10 zdrowych plazm dawców opisanych powyżej do analizy fibrynogenu wykorzystano do analizy α2-makroglobuliny przy użyciu tych samych procedur. Plazma (0.,7 mL) inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem anty-α2-makroglobulinowym (DAKO, Cat Q0102, Lot 20068567)-powlekane Dynabeads (Life Technologies) na obracającym się kole przez 1 h w temperaturze 22 °C. kulki zebrano, odsysano nadmiar osocza i inkubowano w 0,3 mL 5 mM 12C-IPA w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 10% DMSO przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności do alkilowanych niesparowanych tioli Cys w białka. Supernatanty zasysano, a Kulki inkubowano buforem próbki nupage LDS (Life Technologies) zawierającym dalsze 5 mM 12C-IPA przez 30 minut w temperaturze 60 °C. supernatanty rozwiązano na stronie SDS., Żele na stronie SDS zabarwiono koloidalnym coomassie (Sigma), a pasmo α2-makroglobuliny wycięto, odsączono, wysuszono, inkubowano ditiotreitolem o średnicy 40 mM i przemyto14. Plastry żelu inkubowano 5 mM 13C-IPA (izotopy Cambridge) przez 1 h w temperaturze 22 °C w ciemności, aby alkilować Wiązanie dwusiarczkowe Cys, przemywano i suszono przed trawieniem białek 12,5 ng / µl trypsyny (Promega) w 25 mM NH4CO2 przez noc w temperaturze 25 °C. peptydy eluowano z plastrów 5% kwasem mrówkowym, 50% acetonitrylem., Przeprowadzono chromatografię cieczową, spektrometrię mas i analizę danych w sposób opisany dla fibrynogenu34. Analizowano 17 peptydów zawierających Cys (tabele uzupełniające 2 i 4). Różne formy redoks pozostałości Cys zostały określone ilościowo na podstawie względnej obfitości jonów peptydów oznaczonych 12C-IPA i/lub 13C-IPA.
Podsumowanie Raportu
Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu raportu z badań przyrodniczych powiązanym z tym artykułem.