Growth and nutrient dynamics of Ochromonas sp., uważa się, że Fagotrofia BG-1
przez wiciowce fototroficzne nadaje znaczne korzyści ekologiczne glonom, które wykazują takie zachowanie( Flynn and Mitra, 2009), ale wydaje się również, że istnieją ograniczenia (choć w dużej mierze nietypowe) do prowadzenia mieszanego żywienia jednocześnie w pojedynczej komórce (Raven, 1997). Ograniczenia te mogą wiązać się z kosztami lub kompromisami w utrzymaniu podwójnych maszyn komórkowych (w porównaniu do wyspecjalizowanych konkurentów), a może krzyżową rozmową między anabolicznymi i katabolicznymi szlakami biochemicznymi, które mylą wydajność obu działań jednocześnie., Niestety, praktycznie nie ma informacji ilościowych na temat kosztów i korzyści wynikających z zachowania miksotropowego, ani tego, czy oba procesy są przeprowadzane sekwencyjnie czy jednocześnie przez te gatunki. Podział czasowy może być mechanizmem utrzymania obu zdolności w komórkach minutowych (aczkolwiek wstrzymanie jednego procesu w danym momencie)., Ocena, czy oba zachowania występują jednocześnie, specyficzne korzyści fizjologiczne dla żywienia heterotroficznego w glonach mixotrophic oraz responsywność tego zachowania do zmiennych abiotycznych i biotycznych są aspektami żywienia mixotropowego, które były trudne do ustalenia przy użyciu tradycyjnych metod i metod.
badaliśmy mixotrophic chrysophyte Ochromonas Sp. z o. o., szczep BG-1, ponieważ może być uprawiany w kulturze aksenicznej (bez bakterii) i wcześniej donoszono, że jest głównie heterotroficznym organizmem, który osiąga wysokie tempo wzrostu tylko w obecności bakterii (Sanders et al., 2001). Wzrost w kulturze aksenicznej uniemożliwił potencjalnie komplikowanie interakcji biologicznych i przepływów elementarnych wynikających z aktywności innych żywych mikroorganizmów w kulturach, umożliwiając w ten sposób porównanie nanosimów i masowych pomiarów IRMS oraz lepsze zrozumienie konkretnych źródeł węgla i azotu wykorzystywanych do wzrostu przez algi.,
dodatkowo zastosowanie pojedynczego nieorganicznego źródła azotu uprościło nasz eksperymentalny projekt, tak że jedynymi źródłami azotu w pożywce były Amon lub HKB. Glony na ogół posiadają mechanizmy absorpcji i asymilacji zarówno amonu, jak i azotanu, ale dane transkryptomiczne wskazują, że niektóre chryzofity, w tym Ochromony sp. szczep BG-1, może brakować zdolności genetycznych do asymilacji azotanów (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Ponadto bufor MES nie został dodany do medium w naszych eksperymentach, ponieważ mogło to stanowić alternatywne źródło azotu. MES może również stanowić źródło węgla organicznego dla alga (Sanders et al., 2001), a jego eliminacja zapewniła, że jedynymi źródłami węgla w pożywce były wodorowęglany lub HKB. Analiza transkryptomiczna z eksperymentów przeprowadzonych w ten sam sposób jak te przedstawione w tym rękopisie pokazują, że aparatura fotosyntetyczna Ochromonas sp. szczep BG-1 jest wyrażany i regulowany w obecności światła (Lie et al., 2017)., To uproszczone podejście, w połączeniu ze stabilnym oznaczaniem izotopów, pozwoliło nam określić, które źródła azotu i węgla zostały wykorzystane do wzrostu przez alga.
znaczące tempo wzrostu Ochromonów w niniejszym badaniu uzyskano tylko wtedy, gdy HKB było obfite jako zdobycz (ryc. 1a). Dynamika Chl a w hodowli odzwierciedlała również wysokie tempo wzrostu spowodowane wypasem na HKB, ponieważ stężenie CHL a cell-1 zmniejszyło się o jeden rząd wielkości podczas pierwszych 48 godzin inkubacji dla kultur hodowanych w świetle oraz w ciągłej ciemności (rysunek 1d)., Te zmiany w chlorofilu komórkowym mogą być związane z rozcieńczeniem Chl a wewnątrz komórek ze względu na wysokie tempo wzrostu alga (Hansen et al., 2000), tak że redukcja CHL a cell-1 była konsekwencją szybko rosnącego tempa algi, a nie bezpośredniej redukcji szybkości biosyntezy chlorofilu. Niemniej jednak, jest również możliwe, że było pewne regulacji biosyntezy chlorofilu, gdy HKB były obecne jako analiza transkryptomiczna na tej alga sugeruje upregulation genów związanych z syntezą chlorofilu w obecności światła, gdy HKB zostały wyczerpane (Lie et al., 2017)., W każdym razie obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami Ochromonów (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), który zaobserwował dobrze rozwiniętą zdolność heterotroficzną, sugerując, że Wiązanie węgla i być może inne struktury komórkowe i procesy zaangażowane w fotosyntezę są zmniejszone podczas wzrostu miksotroficznego, jak zaobserwowano w przypadku niektórych innych glonów (Wan et al., 2011).
rozpuszczony Amon, jak również fosforan, nagromadziły się w hodowlach Ochromonów podczas pierwszych 48 godzin eksperymentów, kiedy HKB były aktywnie wypasane (ryc. 2)., Wynik ten wskazuje, że nadmiar azotu i fosforu z wypasanego HKB został wydalony przez algę. Obliczenia bilansu masy oparte na zmianach liczebności zdobyczy/glonów i zawartości azotu w komórkach wykazały, że do 50% azotu zawartego w spożywanym HKB zostało przyswajane przez glony, podczas gdy znaczna ilość nadmiaru azotu została uwolniona głównie w postaci amonu w okresie aktywnego wypasu bakterii (ryc. 2)., Te wartości dla asymilacji azotu (i wydalania) są zgodne z efektywnością asymilacji heterotroficznych protistów o podobnej wielkości (Taylor, 1982; Caron and Goldman, 1990), zgodnie z wnioskiem, że Ochromony rosły głównie jako heterotrofia, gdy ofiary były obfite. Ponadto analizy transkryptomiczne wykazały, że różne transportery amonu są wyrażone przez Ochromonas sp. szczep BG-1 rosnący na HKB w porównaniu do wzrostu po wypasaniu bakterii do bardzo niskiej obfitości (Lie et al., 2017)., Wydaje się zatem, że transportery do wywozu amonu z komórki mogą być inne niż te stosowane do absorpcji amonu, jak zaobserwowano w przypadku innych organizmów (Shnaiderman et al., 2013).
Co ciekawe, stężenie amonu, ale nie fosforanu, zmniejszyło się w pożywce po usunięciu HKB przez wypas (czyli po 48 h; ryc. 2), gdy uprawiano Ochromony w świetle., Wynik ten wydaje się wskazywać, że alga aktywnie pobierała Amon (ale nie fosforan) z pożywki, gdy bakterie nie były już dostępne i indukowano fotosyntezę (rysunek 1d). W przeciwieństwie do tego, zarówno amonu, jak i fosforanu w kulturach uprawianych w ciemności nadal rosły w trakcie eksperymentu(przerywane linie na rysunku 2). Nie odnotowano znaczącego wzrostu populacji glonów sieciowych po wyczerpaniu zdobyczy nawet w świetle, a Wyjaśnienie dychotomii w wychwytywaniu tych dwóch pierwiastków jest niejasne., Spekulujemy, że Amon został pobrany, ponieważ był szczególnie potrzebny do odbudowy fotosyntetycznej maszyny komórki.
dalsze pojawianie się fosforanów w pożywce hodowlanej podczas późniejszej części eksperymentów kontrastuje z badaniami niektórych innych gatunków Ochromonów, które donosiły o wychwycie fosforanów, gdy alga rośnie autotroficznie (Rothhaupt, 1996)., Brak wychwytu fosforanów przez szczep BG – 1 może wskazywać, że Ochromony te nie były zdolne do skutecznego wychwytu fosforanów (co może również częściowo tłumaczyć słabą zdolność wzrostu fototroficznego tego szczepu), lub że fosfor nie był potrzebny w znacznych ilościach do reorganizacji komórkowej związanej ze zmianą na wzrost fototroficzny, a zatem wychwyt nie był stymulowany przez zmianę na fototroficzny., Jest mało prawdopodobne, aby dalszy wzrost stężenia fosforanu był spowodowany rozkładem rozpuszczonych organicznych związków fosforu w pożywce, ponieważ kultury nie miały żywych bakterii.
wnioski z eksperymentów z sondą stabilnych izotopów
Analiza stabilnych izotopów (nanosyms i masowa analiza pierwiastkowa-IRMS) wykazały, że zarówno nieorganiczne (13C-wodorowęglan i 15N-Amon) substraty i HKB znakowane 13C / 15N zostały asymilowane przez Ochromony, przyczyniając się do wzbogacenia komórek 15N i 13C po 48 godzinach inkubacji (ryc. 4)., Jednak wielkość wzbogacania z nieorganicznych substratów lub HKB wskazywała, że podczas wzrostu miksotroficznego pierwotne źródła węgla i azotu pochodziły z fagotrofii. Izotopowy bilans masy wykazał, że 88-95% azotu i 84-99% węgla pochodziło z HKB, gdy Ochromony rosły miksotroficznie w świetle. Wzbogacenie 13C zaobserwowano w glonach uprawianych w świetle w porównaniu do ciemności (eksperyment 1 vs eksperyment 3), gdy dostępny był 13C-wodorowęglan (Rysunek 4)., Jednak obliczony udział fotosyntetycznego wiązania węgla wynosił tylko 1-10% węgla asymilowanego do biomasy. Większa skuteczność inkorporacji azotu ze zdobyczy obserwowana w świetle w stosunku do ciągłej ciemności (Rysunek 3; eksperymenty 1, 2 vs eksperyment 3) sugeruje, że światło odegrało rolę, choć niewielką, w skuteczności fagotroficznej algi., W związku z tym, pomimo przypuszczalnego zmniejszenia maszynerii fotosyntetycznej Ochromonów rosnących fagotroficznie na HKB (o czym świadczą niskie kontyngenty komórek Chl a; rysunek 1d), światło miało niewielki i pozytywny wpływ na odżywianie glonów. Ponieważ ilość węgla ustalona przez fotosyntezę stanowiła niewielką część węgla asymilowanego przez algi podczas uprawy na HKB, spekulujemy, że aparat fotosyntetyczny może dostarczać energii, a nie węgla dla materiału komórkowego, jak to zostało hipotezowane dla Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
nasze obliczenia bilansu masy izotopowej mają dwa zastrzeżenia. Po pierwsze, nie kontrolowaliśmy ewolucji pH w kulturach, co dałoby lepszy wgląd w równowagę węglanową, na którą mogło mieć wpływ oddychanie i Wiązanie węgla oraz wymiana z atmosferą. W związku z tym nasze szacunki oparte na eksperymentach z użyciem oznakowanego węgla nieorganicznego mogły nie docenić ilości węgla nieorganicznego ustalonej przez Ochromonas sp. BG-1 (1% według izotopowego bilansu masy)., W każdym razie to zastrzeżenie nie powinno mieć wpływu na eksperyment z użyciem znakowanego HKB, a oszacowanie 10% węgla pochodzącego z substratu nieorganicznego jest prawdopodobnie realistyczne. Po drugie, Ochromonas jest uważany za nieefektywny utrwalacz węgla ze względu na brakujące mechanizmy koncentracji węgla (Maberly et al. 2009), które zwiększają stężenie CO2 poprzez transport CO2 i / lub wodorowęglanów do enzymu RubisCO (Raven et al., 2008). Z drugiej strony analiza transkryptomiczna wykazała, że fotosyntetyczna maszyna szczepu BG-1 jest funkcjonalna (Lie et al.,, 2017), a nasze eksperymenty z użyciem znakowanego wodorowęglanu wykazały znaczące wzbogacenie ułamkowej obfitości 13C w Ochromonach (ryc. szczep BG-1 ma pewną zdolność do wykorzystania węgla nieorganicznego, choć nieefektywnie.
niemniej jednak silna aktywność heterotroficzna Ochromonów podczas wzrostu miksotroficznego prawdopodobnie zwiększa wewnątrzkomórkową pulę CO2, a także jej strumień. Z reguły uważa się, że heterotroficzne protisty przyswajają 40% spożywanej materii organicznej, podczas gdy uwalniają 30% i oddychają kolejne 30% (Sleigh, 1989)., Opierając się na tym, całkowita ilość węgla uwalnianego przez Ochromony jako CO2 podczas wykładniczego wzrostu może być tak wysoka, jak całkowity wodorowęglan dodany na początku inkubacji, co ma konsekwencje dla izotopowego bilansu masy, który przedstawiliśmy. Jeśli przyjmiemy, że wzbogacony izotopowo CO2 pochodzący z oddychania HKB jest dostępny na tym samym poziomie, co rozpuszczony węgiel nieorganiczny, inkubacja przeprowadzona z Ochromonami i oznaczona HKB wykazała, że ~84% węgla pochodzi z HKB., Do 20% zasymilowanego węgla pochodzącego z HKB mogło faktycznie odpowiadać węglowi, który początkowo był oddychany, a następnie utrwalany przez Ochromony. Jeśli jest to poprawne, oddychanie pochodzące z aktywności fagotroficznej będzie działać jako mechanizm koncentracji węgla dla tego Ochromona. Podczas gdy główne źródło węgla dla Ochromonów rosnących mixotrophically pochodzi z HKB, niewielka ilość mogła pochodzić z oddychania, a następnie CO2 fiksacji biomasy bakteryjnej.,
Ochromony po inkubacji w świetle zmieniły swój metabolizm w kierunku autotrofii, ale dopiero po wyczerpaniu HKB w kulturach (≈ 48 h wzrostu). Przesunięcie to znalazło odzwierciedlenie w zbiorczej obfitości IRMS 13C ułamkowej dla leczenia za pomocą znakowanego HKB, gdzie zaobserwowano zmniejszenie między 48 h a 145 h (eksperyment 2 Na Rysunku 5), wskazujące na włączenie nieoznakowanego węgla do biomasy glonów za pomocą lekkich procesów. Chryzofity są ogólnie uważane za słabe autotroficzne utrwalacze węgla ze względu na słabe mechanizmy koncentracji węgla (Maberly et al., 2009)., Niemniej jednak wyniki te wskazują na znaczny poziom asymilacji węgla nieorganicznego. Porównanie kultur wyhodowanych w świetle (eksperyment 1 na ryc. 5) i ciągłej ciemności (eksperyment 3 na ryc. 5) wykazało, że ułamkowa obfitość 15N ciemnych kultur nie zmieniła się po 95 h, podczas gdy Kultury w świetle nadal wzbogacają się w 15N, co wskazuje, że Ochromony nadal asymilują azot, aby utrzymać swój metabolizm po wyczerpaniu HKB., Wyniki te były zgodne z obserwowanym spadkiem stężenia amonu w pożywce w tym okresie (ryc. 3A), chociaż dalsze pojawianie się fosforanów w pożywce w tym okresie jest niewyjaśnione.
uzyskaliśmy dobrą ogólną zgodność między pomiarami izotopów masowych i pomiarami nanosimów azotu, zgodnymi z obserwacjami w poprzednich badaniach (Popa et al., 2007; Orphan and House, 2009; Kopf et al., 2015; rys. 4c)., Jednak pomiary masowe były nieco niższe pod względem ułamkowych wartości obfitości węgla, szczególnie dla próbek o wysokim stopniu wzbogacenia (rysunek 4d). Spekulujemy, że różnice między nanosimami a masowymi pomiarami izotopów węgla mogą być związane z faktem, że próbki nanosimów zostały zachowane za pomocą aldehydu glutarowego, podczas gdy próbki do analizy masowej nie były. Fiksacja wykazano wpływ węgla komórkowego (Musat et al., 2014), chociaż mogliśmy się spodziewać, że rozcieńczy to 13c w pomiarach nanosimów w stosunku do wartości masowych., Bardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że pomiary jednokomórkowe nie są pod wpływem szczątków komórkowych w kulturze, które mogą być mniej wzbogacone. Masowa wartość 13C może być rozcieńczana przez te składniki w stosunku do pomiarów nanosimów, co oznacza, że dane nanosimów mogą dokładniej odzwierciedlać wychwyt węgla i azotu przez glony. Jednak zmienność komórek do komórek mogła również przyczynić się do niewielkich różnic między pomiarami masowymi i nanosimami.,
zastosowanie nanosimów w tym badaniu stanowi jego pierwsze zastosowanie w badaniu strumieni węgla i składników odżywczych w aldze miksotropowej i umożliwiło lepsze zrozumienie pozyskiwania węgla i energii przez ten gatunek oraz metabolizmu komórkowego. Nasze ustalenia rozszerzają informacje dostępne z tradycyjnych analiz Ochromonas sp. szczep BG-1 uprawiany w różnych warunkach światła i dostępności zdobyczy (Sanders et al., 2001), potwierdzając, że większość azotu i węgla użytego do wzrostu uzyskuje się poprzez zdobycz bakteryjną., Chociaż wyników nie można bezpośrednio ekstrapolować na wszystkie gatunki w kontinuum glonów za pomocą różnych strategii mixotrophic, nasza praca potwierdza wykorzystanie stabilnych eksperymentów z sondowaniem izotopów i nanosimów w celu lepszego zrozumienia metabolicznych podstaw mixotropii u jednego gatunku. Ponadto zapewnia podejście do oceny żywienia mixotrophic w próbkach środowiskowych. Ochromonas Sp. z o. o. szczep BG-1 stanowił idealny system modelowy do porównywania analizy izotopów masowych z nanosimami, ponieważ bakterie zostały szybko usunięte przez wypas w ciągu pierwszych 48 godzin eksperymentów., Porozumienie między tymi dwoma pomiarami pokazuje, że nanosimy dokładnie uchwyciły dynamikę pozyskiwania węgla i składników odżywczych w tym mixotrofie, a zatem mogłyby być szerzej stosowane do badania mixotrofii w złożonych zbiorowiskach mieszanych, w których środki masowe byłyby niewystarczające do uchwycenia tej dynamiki. Te i przyszłe szczegółowe badania będą nadal przynosić poprawę w naszym zrozumieniu odżywiania alg mixotropowych.