Ochromonas sp.,,BG-1株
光栄養性鞭毛虫による食栄養は、その挙動を示す藻類に大きな生態学的利点を与えると考えられている(Flynn and Mitra,2009)が、単一細胞で混合栄養を同時に行うための制限(ほとんど特徴付けられていないが)もあるようである(Raven,1997)。 これらの制約は、（専門の競合他社と比較して）二重の細胞機械を維持するためのコストやトレードオフ、またはおそらく両方の活動のパフォーマンスを同時に混乱させる同化と異化生化学的経路の間のクロストークを伴う可能性があります。, 残念ながら、mixotrophic行動の費用そして利点に関する量的な情報は事実上存在しないし、両方のプロセスがこれらの種によって順次または同時に遂行されるかどうか。 時間的分割は、（任意の時点で一つのプロセスを”保留”に置いているにもかかわらず）微細なセル内の両方の能力を維持するためのメカニズムである, 両方の行動が同時に発生しているかどうかを評価すると、混合栄養藻類における従属栄養栄養のための特定の生理学的利益（複数可）、および非生物的および生物的変数に対するこの行動の応答性は、伝統的なアプローチおよび方法を用いて確立することが困難であった混合栄養栄養の側面である。
我々は、混合栄養chrysophyte Ochromonas spを研究しました。, BG-1株は、アクセン培養（無細菌）で増殖することができ、細菌の存在下でのみ高い増殖速度を達成する主に従属栄養生物であることが以前に報告されているため（Sanders et al., 2001). アクセニック培養における成長は、潜在的にそれによってnanoSIMSとバルクIRMS測定と藻類によって成長に使用される炭素と窒素の特定のソースのより良い理解との間の比較を可能にする、培養中の他の生きている微生物の活動から生じる生物学的相互作用と元素の流れを複雑に防止しました。,
さらに、単一の無機窒素源を使用することにより、培地中の窒素源のみがアンモニウムまたはＨＫＢであるように、実験設計を簡素化した。 藻類は一般的にアンモニウムと硝酸の両方の取り込みと同化のためのメカニズムを持っているが、転写データはOchromonas spを含むいくつかのchrysophytesを示している。 BG-1株は、硝酸塩同化のための遺伝的能力を欠いている可能性がある（Terrado et al.,2015;Lie et al., 2017)., さらに、これは窒素の代替源を提供している可能性があるため、我々の実験では培地にＭＥＳバッファーを添加しなかった。 ＭＥＳはまた、藻類のための有機炭素の供給源を構成している可能性がある（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．,2001)、およびその除去により、培地中の炭素の唯一の供給源が重炭酸塩またはHKBのいずれかであることが保証された。 この原稿に示されているものと同じ方法で行われた実験からのトランスクリプトーム解析は、Ochromonas spの光合成機械であることを示しています。 ひずみBG-1は、光の存在下で発現され、上方制御される（Lie et al., 2017)., この単純化されたアプローチは、安定同位体標識と組み合わせて、窒素と炭素のどのソースが藻による成長に使用されたかを決定することができました。
本研究におけるOchromonasの有意な成長率は、HKBが獲物として豊富であった間にのみ達成された（図1a）。 Chl a細胞−1の濃度は、光の中だけでなく、連続暗闇の中で成長した培養のためのインキュベーションの最初の48時間の間に一桁減少したように、培養におけるChl aダイナミクスはまた、HKB上の放牧による高い成長速度を反映している（図1d）。, 細胞クロロフィルのこれらの変化は、藻類の高い成長速度による細胞内のＣｈｌａの希釈に関連していると考えられる（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．,2000)、Chl a cell-1の減少は、藻類の急速な成長速度の結果であり、クロロフィル生合成速度の直接的な減少ではなかった。 それにもかかわらず、この藻類の転写解析は、HKBが枯渇したときの光の存在下でのクロロフィル合成に関連する遺伝子のアップレギュレーションを示唆, 2017)., いずれにせよ、これらの観察は、Ochromonasの以前の研究と一致している（Pringsheim、1952;Sanders et al.,2001)は、よく発達した従属栄養能力を観察し、他の藻類で観察されたように、炭素固定およびおそらく他の細胞構造および光合成に関与するプロセスが、混合栄養的に成長するときに減少することを示唆している(Wan et al., 2011).
Hkbが積極的に放牧された実験の最初の48時間の間にOchromonas培養物に蓄積された溶解したアンモニウムおよびリン酸塩（図2）。, この結果は，放牧したＨＫＢからの過剰な窒素とりんが藻によって排せつされることを示している。 獲物/藻類の存在量とその細胞窒素contents量の変化に基づく質量収支の計算は、消費されたHKBに含まれる窒素の50％までが藻類によって同化され、過剰な窒素のかなりの量が活発な細菌の放牧期間中に主にアンモニウムとして放出されたことを示した(図2)。, 窒素同化（および排泄）のためのこれらの値は、同様のサイズの従属栄養原生生物の同化効率と一致している（Taylor、1982;Caron and Goldman、1990）、獲物が豊富だったときにOchromonasが主に異種栄養として成長していたという結論と一致している。 さらに、transcriptomic分析していることを明らかに異なるアンモニウムトランスポーターによって表現されてOchromonas sp. 細菌が非常に低い存在量まで放牧された後の増殖と比較して、HKB上で増殖する株BG-1（Lie et al., 2017)., したがって、細胞からのアンモニウムの輸出のための輸送体は、他の生物で観察されているように、アンモニウムの取り込みに使用されるものとは異なる可能性があると思われる（Shnaiderman et al., 2013).
興味深いことに、アンモニウムの濃度ではなく、リン酸は、Hkbが放牧によって除去された後（すなわち、48時間後、図2）、光の中でOchromonasを成長させたときに培地中, この結果は、細菌が利用できなくなり、光合成が誘導されたときに、藻類が培地からアンモニウム（リン酸ではない）を積極的に取り込んだことを示しているように見える（図1d）。 対照的に、暗所で培養した培養物中のアンモニウムおよびリン酸塩は、実験を通じて上昇し続けた（図2の点線）。 光の中でも獲物の枯渇に続いて有意な純藻類の個体群成長は起こらず，これら二つの要素の取り込みにおける二分法の説明は不明である。, アンモニウムは細胞の光合成機構を再構築するために特別に必要であったために取り上げられたと推測した。
実験の後半における培養液中のリン酸塩の継続的な出現は、藻類が独立栄養的に成長しているときにリン酸塩の取り込みを報告した他のOchromonas種の研究とは対照的である（Rothhaupt、1996）。, BG-1株によるリン酸取り込みの欠如は、このOchromonasが効果的なリン酸取り込みができなかったことを示している可能性があります（これはまた、部分的には、この株の貧しい光栄養増殖能力を説明するかもしれない）、またはリンが光栄養増殖への変化に関連する細胞再編成のためにかなりの量で必要ではなかったため、取り込みは光栄養への変化によって刺激されなかったことを示している。, りん酸濃度の継続的な増加は，培養に生菌がないため，培地中の溶解有機りん化合物の分解によるものとは考えにくかった。
安定同位体探査実験からの推論
安定同位体分析（nanoSIMSおよびバルク元素分析-IRMS）は、無機（13C-重炭酸塩および15N-アンモニウム）基質および13C/15N標識HKBの両方がOchromonasによって同化され、15Nおよび13C細胞濃縮に寄与することを明らかにした48時間のインキュベーション（図4）。, しかし，無機基質またはＨＫＢからの濃縮の大きさは，混合栄養成長中に，炭素および窒素の主要な供給源が食栄養に由来することを示した。 同位体の質量収支はochromonasがライトでmixotrophically育っていたときに窒素の88-95%およびカーボンの84-99%がHKBから得られたことを示しました。 13c-重炭酸塩が利用可能であったとき、暗闇（実験1対実験3）と比較して光の中で成長した藻類では13Cの濃縮が観察された（図4）。, しかし、光合成炭素固定の計算された寄与は、バイオマスに同化された炭素のわずか1-10％であった。 連続暗闇に比べて光の中で観察された獲物からの窒素取り込みの効率が高いこと（図3;実験1、2対実験3）は、光が藻類の貪食効率において、マイナーではあるが役割を果たしていることを示唆している。, したがって、HKB上で食栄養的に成長しているOchromonasの光合成機械の推定削減にもかかわらず（Chl aの低い細胞クォータによって証明されるように、図1d）、光は藻類の栄養にマイナーかつプラスの影響を持っていました。 光合成によって固定された炭素の量は、HKB上で成長するときに藻類によって同化された炭素のごく一部を表すので、我々は、光合成装置がOchromonas danica（Wilken et al., 2014).,
同位体質量収支の計算には二つの注意点があります。 まず、培養物内のpHの進化を制御しなかったため、呼吸と炭素固定、大気との交換によって影響された炭酸塩平衡に関するより良い洞察が得られた。 したがって，標識無機炭素を用いた実験に基づく推定は，Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓｓｐによって固定された無機炭素の量を過小評価している可能性がある。 BG-1（同位体質量収支によると1％）。, いずれにせよ、標識されたHKBを用いた実験はこの警告の影響を受けてはならず、無機基質由来の炭素の10％の推定値は現実的である可能性が高い。 第二に、オクロモナスは、炭素濃度機構が欠落しているために非効率的な炭素定着剤と考えられている（Maberly et al. 2009)RubisCO酵素へのCO2および/または重炭酸塩の輸送を介してCO2濃度を増加させる（Raven et al., 2008). 一方、トランスクリプトーム解析により、BG-1株の光合成機構が機能的であることが示されている（Lie et al.,,2017)、および標識された重炭酸塩を用いた実験は、Ochromonasにおける13c分数存在量の有意な濃縮を示した(図4および5);したがって、Ochromonas sp. ひずみBG-1は、非効率的ではあるが、無機炭素を使用するいくつかの能力を有する。
それにもかかわらず、混合栄養的に成長しながらOchromonasの強い従属栄養活性は、細胞内CO2プールだけでなく、そのフラックスを増加させる可能性があります。 経験則として、従属栄養原生生物は摂取された有機物の40％を同化し、30％を放出して別の30％を呼吸すると考えられている（Sleigh、1989）。, これに基づいて、指数関数的な成長の間にCO2としてOchromonasによって放出される炭素の総量は、インキュベーションの開始時に添加された総重炭酸塩と同じくらい高くなる可能性があり、これは我々が提示した同位体質量バランスに影響を及ぼす。 HKB呼吸に由来する同位体富化CO2が溶存無機炭素と同じレベルで利用可能であると仮定すると、Ochromonasおよび標識されたHKBで行われたインキュベーションは、-84％の炭素がHKBに由来していることを示した。, HKBに由来する同化された炭素の20％までは、実際には最初に呼吸され、次にOchromonasによって固定された炭素に対応することができる。 正しければ、phagotrophic活動から得られる呼吸はこのOchromonasのための一種のカーボン集中のメカニズムとして機能する。 混合栄養的に成長するOchromonasの炭素の主な供給源はHKBに由来していたが、無視できない量は細菌バイオマスの呼吸とCO2固定に由来している可能性があ,
Ochromonasは、光の中でインキュベートしたときに自己栄養に向かってその代謝をシフトしたが、それは文化（成長の≥48時間）でHKBを枯渇させた後にのみ。 このシフトは、ラベル付きHKBを使用して処理するためのバルクIRMS13C分数存在量に反映され、48hと145hの間で減少が観察された（図2の実験5）、軽いプロセスを介して藻類バイオマスへの非標識炭素の取り込みを示した。 クリソファイトは、一般に、炭素濃度機構が不十分であるため、独立栄養性炭素fix剤が不十分であると考えられている（Maberly et al., 2009)., しかし、これらの結果が重大なレベルの無機炭素同化 光の中で成長した培養（図1の実験5）と連続暗闇（図3の実験5）の比較は、暗い培養の15N分数豊富は95時間後に変化しなかったことを明らかにしたが、光の中での培養は15Nで豊かにし続け、Ochromonasはhkbが枯渇した後に代謝を維持するために窒素を同化し続けたことを示した。, これらの結果は、この期間中の培地中のアンモニウム濃度の観察された減少と一致していた（図3a）が、この期間中の培地中のリン酸塩の継続的な現
我々は、以前の研究での観察と一致して、窒素のバルク同位体測定とnanoSIMS測定との間の良好な全体的な一致を得た（Popa et al.,2007;Orphan and House,2009;Kopf et al.,2015;図4c)。, しかし、バルク測定は、特に高度に濃縮されたサンプルについて、炭素の分数存在値に関して幾分低かった（図4d）。 ナノシムと炭素のバルク同位体測定の違いは，ナノシム試料がグルタルアルデヒドで保存されているのに対し，バルク分析の試料は保存されていないという事実に関連していると推測した。 固定は、細胞の炭素に影響を及ぼすことが示されている（Musat et al.,2014)、我々はこれがバルク値に対するnanoSIMS測定で13Cを希釈することを期待しているかもしれないが。, より可能性の高い説明は、単一細胞測定が、より濃縮されにくい培養物中の細胞破片によって影響されないということである。 バルク13C値は、nanoSIMS測定に対するこれらの成分によって希釈され得、nanoSIMSデータが藻類による炭素および窒素の取り込みをより正確に反映し得ることを しかし、細胞間の変動もバルクとnanoSIMS測定の間のマイナーな違いに貢献している可能性があります。,
この研究におけるnanoSIMSの使用は、混合栄養藻類における炭素および栄養フラックスの研究に向けた最初のアプリケーションを表し、この種による炭素およびエネルギー獲得、および細胞代謝のより良い理解を可能にした。 我々の調査結果は、Ochromonas spの伝統的な分析から利用可能な情報を拡大します。 光および獲物の利用可能性の様々な条件下で成長させたBG-1株（Sanders et al.,2001)、成長に使用される窒素および炭素のほとんどがその細菌の獲物を通して得られることを確認した。, 結果は直接異なる混合栄養戦略と藻類の連続体に沿ってすべての種に外挿することはできませんが、我々の仕事は、より良い一つの種における混合栄養の代謝基盤を理解するために安定同位体プロービング実験とナノシムの使用を検証します。 さらに、それは環境のサンプルのmixotrophic栄養物を査定するためのアプローチを提供する。 オクロモナスsp. ひずみBG-1は、細菌がすぐに実験の最初の48時間以内に放牧によって除去されたので、nanoSIMSにバルク同位体分析を比較するための理想的なモデルシス, これら二つの測定間の一致は、nanoSIMSが正確にこのmixotrophにおける炭素と栄養獲得のダイナミクスをキャプチャし、したがって、より広くバルク対策は、これらのダイナミクスをキャプチャするには不十分であろう複雑な混合コミュニティにおけるmixotrophy これと将来の詳細な研究は、混合栄養藻類の栄養に関する我々の理解の改善をもたらし続けるであろう。