直接実験データから等高線プロットの作成は、実現可能なハイスループット法とかなりの数のサンプルを使用する必要があります。 従って試金は96井戸の版の設計の使用のために適していなければならない。, 単一の反作用の管からの96井戸の版へのこの小型化の一般的な利点はDNSAおよび他の比色の試金のために既に示されていた。 この研究で使用されるすべてのアッセイは、96ウェルプレート形式に適していた。 等高線図を作製するために，酵素と基質混mixturesを八つの異なるｐｈレベルでインキュベートした。 これらの八つのpHレベルは、勾配PCRサイクラーを用いて12の異なる温度でインキュベートし、96のユニークな反応条件で データを取得するためにプレートリーダを使用した。, 結果は、各プレート上で最も高い活性が100％に設定されている相対的な活動に変換されました。 測定は三重に行われ、その後、材料および方法のセクションで説明されているように、平均値はSigmaPlotを使用して等高線プロットに変換されました。 アクティビティ（z軸）は、等高線プロットのビューを強化するために、法線軸の代わりに紫から赤までの色として表されます。,
バッファーシステム
pHおよび温度最適の信頼できる決定のための前提条件の一つは、酵素活性に関して適しており、温度の上昇に伴うpHシフトに対してほぼ耐性のある安定したバッファーシステムである。 あるいは、この効果を等高線図で考慮することもできます。 緩衝液及びそれによってｐｈのｐｋａに対する温度の影響は、特にＴｒｉｓのようなアルカリ性緩衝液に対して考慮されるべき事実である。, 試金のための条件として、私達のクエン酸塩隣酸塩緩衝システムのすべてのpHの変化は35°Cと80°C間のpHの変更のためにテストされた（付加的なファイル4を見て下さい）。 すべての緩衝液は温度の上昇とともにｐｈのわずかな減少を示し，ｐｈ値が高い場合の緩衝液はより高い偏差を示した。 温度依存性は、リン酸塩（−0.0028）およびクエン酸塩（0）の温度係数と相関するリン酸塩の量とともに増加する。, すべてのバッファの温度依存性ｐｈ変動はわずかであったので，ここで使用した値の範囲内で等高線プロットのコンパイルでは無視できた。 それにもかかわらず、より高い温度係数を持つ別のバッファシステムを利用する必要がある場合、各バッファに各温度で個々のpHを割り当てることに, これらの値は、それぞれの材料および方法のセクションで説明されているように実験的に決定されるか、または温度係数から導出され、それに応じて
Cel8Aの活性範囲決定
それぞれの等高線プロットの作成のために本研究で使用される異なる酵素、基質、およびアッセイの概要を表1に示します。,
Cel8Aは、C.thermocellum由来のセルラーゼ、より具体的にはエンドグルカナーゼであり、解決された結晶構造を有するグリコシドヒドロラーゼファミリー8の最初の酵素であった。 本研究では、酵素はDNSAアッセイを使用して我々の提案した方法を検証するためにBBGとインキュベートしました。 Cel8Aは75°Cで温度の最適および5.5と6.5間のpHの最適があるために報告されました。, これらの値は、>90％の活性の領域内にあるため、等高線プロットの結果に従っています（Fig. 1). しかし，等高線プロットは，この酵素が広範囲の異なる条件下で非常に活性であることを示している。 酵素はより低い水素イオン濃度指数で受諾可能な活動をとき60°Cと65°C間で表わし、また最高の活動の60%以上ととき水素イオン濃度指数で4.5 この方法は、このような効果を可視化し、テストされたパラメータ内の任意の時点で酵素の性能を一目で評価する手段を提供する。,
大麦-β-グルカンを基質としたDNSAアッセイを用いたCel8Aの等高線プロット
この方法が異なる加水分解酵素アッセイ法に適しているかどうかをテストするために、Azo-CMを用いたCel8Aを用いた等高線プロットを作成した。-基質としてのセルロースとそれぞれのアッセイ（図。 2). このプロットは、75°CとpH5.5で同様の最適を示しています。 しかし，基質としてアゾ-ＣＭ-セルロースを使用すると，活性範囲はわずかに小さくなった。, 二つのアッセイの間のわずかな違いは、それによって酵素への結合特性が異なる、両方の基質の異なる構造と結合型に起因する可能性があります。 アゾCMセルロースはこの効果に更に加えることができる加えられた染料のグループが付いている非天然の基質です。 Cel8Aを使用して、我々は我々の方法が有効なデータを提供し、加水分解酵素のための二つの異なる確立されたアッセイでの使用に適していることを示すことができる：DNSAとアゾ-CM-セルロース。
Azo-CM-セルロースを用いたCel8Aの等高線図
Celluclast®の活性範囲決定
単一の酵素に加えて、酵素混mixtureを調べた。 Celluclast®はTrichoderma reeseiから得られる広く利用された商業セルラーゼプロダクトです。 主にセロビオヒドロラーゼとエンド-1,4-β-グルカナーゼからなるが、キシラナーゼと少なくとも一つのβ-キシロシダーゼも特徴とする。 プロダクトマニュアルは最適の活動が50°Cと60°CおよびpH4の間にあることを示す。,5および6.0。 本研究では、まずDNSA法を用いてBBGを基板としたCelluclast®の等高線プロットを作製しました（Fig. 3). ＢＢＧ等高線プロットは、標準温度曲線によって検証した（Fig. 4). PH5.5での温度曲線の結果は、等高線プロットの結果に従っており、同じ活性範囲を示しています。 しかしながら、別々の曲線の測定は、BBGに対するCelluclast®の活性を記述するには不十分である。 酵素混mixtureが高い活性を示すｐｈの範囲は強く温度依存性である。, 温度が高いほど、高い活性を達成するためにはpHが低くなければなりません。 45℃前後では、Celluclast®はpH6.5まで高活性（>60％）であるのに対し、65℃ではpH5.0まで高活性である。 を記述する活動とは別の曲線は、そのため、厳格に選択した値としての静的なパラメータとします。 温度グラフは、例えば、記載されたpH範囲（4.5および6.0）の両極端で撮影されたものは、有意に異なる結果を与えるべきである。 ついてもまったく同じtrueのpHグラフれる。, この効果を明らかにするために、45℃、55℃、および65℃での標準pHグラフを作成しました（Fig. 5). これら三つのｐｈ曲線は，温度の上昇とともに，高活性のｐｈ境界がより酸性のｐｈ値にシフトすることを示した。 これにより、三つの曲線は等高線図に見られる結果を検証します。 さらに、それらは、少なくともCelluclast(登録商標)の場合、pH曲線の場合には、選択された温度に依存する、従来の別個の活性測定の限界を示している。, この等高線プロット法を用いることにより，温度とｐｈの影響をワンステップで測定することにより，この問題を完全に回避できる。
大麦-β-グルカンを基質としたDNSAアッセイを用いたCelluclast®の等高線プロット
Ph5.0でのCelluclast®の従来の温度最適決定。, 大麦-β-グルカン上のCelluclast®の温度最適は、pH5.0で決定された。 従来のアプローチは55℃前後の最大活性を示し、対応する等高線プロットで見られる結果に従っています
三つの温度でCelluclast®の従来のpH最適な決定。 大麦-β-グルカンに対するCelluclast®のpH最適は、45℃、55℃、および65℃で決定した。, より低い温度では、酵素はより高いpH値に耐えることができる。 これは対応する等高線プロットに従っており、pHまたは温度の最適を個別に決定する際に選択された固定パラメータの強い影響を示しています
アラビノキシラン(AX)に対するCelluclast®の活性範囲(Fig. 6)基質としてBBGとのそれと異なります。 活性は特に低い温度に向かってシフトし、60℃以上では高い活性は観察されない。, Celluclast®はいくつかの酵素の混合物であるため、これらの異なる酵素が異なる特性を有する可能性が最も高い。 しかし、活性パターンはBBGと同様であり、例えば、pH4.5では60℃近くまで活性が高いのに対し、pH6.5では50℃まで活性が高いだけである。文献では、コムギ可溶性AXにおけるCelluclast®の最適は応答表面モデル(RSM)によって決定され、pH4.4および39℃前後であることが分かった。, 等高線プロットは同じ温度範囲とわずかに高いｐｈで最も高い活性を示し，これはＲＳＭによって決定された最適範囲内であった。 最適は両方の方法のためのほぼ同じ間、私達の等高線プロットは著しくテストされた条件の全体の範囲内のAXのCelluclast®の厳密な活動を示し、rsmより詳 ＢＢＧおよびＡＸ上のＣｅｌｌｕｃｌａｓｔ®の等高線プロットを用いて，提案した方法で複雑な酵素混mixturesを分析できることを示した。
Celluclast®の等高線プロット基板としてアラビノキシランとDNSAアッセイを使用して
さらに私たちの活性範囲決定の汎用性を実証するために、我々は追加 P-NP-β-d-グルコピラノシドに対するCelluclast®の活性を試験し、等高線プロットを図に示した。 7. この基質の高い活動はpH4.0から5.5および55°Cから70°C.間の幾分狭い範囲に限られます。, このことは、Celluclast®酵素混合物内の一つまたは少数の酵素のみが、おそらくp-NP-β-d-グルコピラノシドに対する活性を示すことを示唆している。 p-NP配糖体は、等高線プロットの調製のための基質として使用することができる。 しかしながら、すべてのp-NP配糖体がアッセイに適した基質であるわけではなく、そのうちのいくつかは不安定性のために高いバックグラウンドを示す（追加ファイル5を参照）。
P-NP-β-d-グルコピラノシドを用いたCelluclast®の等高線プロット
天然バイオマスサンプルへの適用をテストするために、ストローベースの基板を使用することを選択しました。 Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）によるグルコースの遊離を、市販のｄ-グルコースＨＫアッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて検出した。 わらの細胞壁の主要なコンポーネントは酵素的に解放されたブドウ糖の主要な源のセルロースです。 等高線プロット（Fig., したがって、8）は、主に酵素分解に対して反抗的である結晶セルロースに対するCelluclast®の活性を示す。 グルコースの最も高い放出はおよそpH4.0から5.5および40°Cから60°C.で観察された高い活動の範囲は主にセルロースを低下させることを目的としたプロセスのために考慮に入れられるべきであるBBGのために定められるよりより少なく広いです。, Ｄ-グルコースＨＫおよびｐ-ＮＰ-β-ｄ-グルコピラノシドを代替アッセイとして用いることにより，この方法の四つの異なる一般的に使用されるグリコシドヒドロラーゼアッセイに対する適応性を示すことができた。 ストローの使用により，この方法は工業的に関連する天然基材にも適しており，複雑なプロセスおよび基板の評価に使用できることが分かった。 Celluclast®は異なった基質のさまざまな活動のプロフィールを示す。, したがって、すべての方法についてまとめて、目的の基質を有する酵素のpHおよび温度範囲データを決定することが重要である。
ストローベースの天然基質を用いたd-グルコースHKアッセイを用いたCelluclast®の等高線プロット
方法を使用する際の考慮事項
提案された方法で等高線プロットを作成する場合、考慮すべきいくつかの考慮事項があります。, 基質は96井戸の版の条件の完全な範囲に再生可能な安定した、測定された背景でなければならない。 これは基板制御が相対的な活動への転換前にすべての価値から差し引かれなければならないが96の条件のそれぞれのために版で直接測定することができないので、前提条件である。 例えば、いくつかのｐ-ＮＰ配糖体基質は、温度およびｐｈ依存性の高い背景を示すので、使用することができない。 非常に精密なピペッティングは三重項からの標準偏差の受諾可能なレベルをもたらすために必要である。, 96ヘッドおよび8チャネルのピペットの使用はかなり正確さを改善し、プロシージャを加速するので強く推薦される。 さらに、版の読者および勾配PCRのcyclerは方法をきちんと実行する技術的要求事項である。 この方法を実施することができる温度範囲は、勾配PCRサイクラーの技術的特性に従って適合させることができ、これは通常30℃または40℃に制限され、しばしば20℃以下の値を含むことができない。, これらの値はすべて線形検量線上にあるため、吸光度を酵素の相対活性に直接変換した（データは図示せず）。 しかし、そうでない場合は、活性を最初に、たとえばU/mg単位で計算する必要があり、これらの値を使用して等高線図を生成することができます。 二価金属イオンに強く依存する酵素の等高線図を作成したい場合は、クエン酸塩–リン酸塩ベースのバッファーがこれらのイオンを複雑にするので、異なるバッファーシステムを使用する必要がある。,
RSMアプローチは、複雑な関係を評価するための紛れもなく強力なツールですが、例えば、複数の要因に影響を与える多様な変数は、活性に対するpHと温度のみの影響を決定することは、直接測定によって達成されるにはあまりにも複雑ではありません。 モデルの正しい境界値の決定にはいくつかの方法があり、結果のモデルに影響を与える可能性があります。 RSMモデルは酵素の活動の中心点のまわりで少数の測定だけから得られ、実際の実験価値の方の正確さはその後テストされなければならない。, したがって、RSMの全体的な分解能は、この方法で得られたものよりも低く、より高い温度および/またはpH値でCelluclast®に示されているような活性効果を見る この方法は、複雑な統計モデルを設計する能力を必要とせず、最小限かつ比較的標準的な技術的要件で実行することができる。 この方法とＲＳＭの両方が共有する欠点は，三次元プロット内の標準偏差の直接可視化が不可能であることである。, しかし，この方法は個々のデータ点ごとの標準偏差を計算することを可能にする。 ほとんどのRSMモデルは、モデルの中央データポイントのデータからのみモデル全体の標準偏差を決定し、他のデータポイントは一度だけ測定されます。 標準偏差は、酵素の活性の境界で自然に高く、条件のわずかな変化の中で活性に強い影響を示しています。 最適のまわりでそして無か低い活動の区域内で、偏差はかなりより低いです。, 提案された方法は完全な階乗データセットをもたらすので、さらなる分析のために必要であれば統計モデルを計算することが可能であろう。 導出された統計モデルは、実験データに直接基づいているが、この方法の標準的な適用には必要ではない追加のステップである。
要約すると、プロセスパラメータの組み合わせに対する酵素または酵素混mixtureの適合性の容易な評価は、実験室または産業規模でバイオテクノロジープロセスを設計する際に非常に重要である。, 温度とpHは酵素活性に影響を及ぼす最も重要なプロセス因子の二つである。 酵素に対するそれらの要因の効果をテストする慣習的なアプローチは温度と活動、またpHおよび活動間に二次元相関があるという仮定に基づいてい 対照的に、新しいアプローチは、三次元物質の関係を決定しますが、統計ベースであり、設計するのが複雑であり、実際のデータへの精度は異なる場合があり, 一方、ここで紹介した方法は、96ウェルプレート、マルチチャンネルピペット、およびグラデーションPCRサイクラーを使用して、温度およびpHが酵素の活性に及ぼす影響を迅速かつ容易に決定することを可能にする。 この基本的な技術装置によって、実験データに直接基づいているpH、温度および活動の等高線プロットを作り出すことは可能である。 この方法は，いくつかの広範なグリコシド加水分解酵素アッセイならびにモデルおよび複合基質について試験した。