採血および処理
健康なボランティアからのヒト血液の採取に関するすべての手順は、シドニー大学のヒト研究倫理委員会（承認HREC2014/244）に従っており、すべての個人からインフォームドコンセントが得られた。, ECMO患者からのヒト血液の採取を含むすべての手順は、Alfred Hospital Ethics、Monash University Standing Committee for Research in Human(approval388/13)に従っており、すべての個人からインフォームドコンセントが得られました。 すべての手続きは1983年のヘルシンキ宣言に従ったものであった。 血液は21g蝶Terumo針を用いてvenesectionによって収集されました10無薬物上の健康なドナーから(四男性,六女性,22-58歳)., 血液の最初の5mLは、針挿入部位の周りに生成され、3.2％v/vクエン酸ナトリウムを含むチューブに引き込まれている可能性のあるトロンビンを避けるために捨てられた。 ECMOサポートを受けていた単一のセンターの患者（男性、女性、34-67歳）からの血液は、ACD-Aチューブ（BD Vacutainer）に引き込まれました。, ECMOサポートを受けた患者は、臨床医の裁量または機関のガイドラインに基づいて、抗凝固薬および/または抗血小板薬を受けました。患者は通常、ワルファリン、ターゲット国際正規化比（INR）2-3、ヘパリン注入およびアスピリン療法、ならびに血栓症のリスクが高いと考えられている人のためのジピリダモールをブリッジングして開始しました。 血漿を室温で800×gで20分間二回遠心分離することにより調製した。, いくつかの機会に、健康なドナー血漿は、Kinexus pro+レオメーターを使用して室温で2000s−1または10000s−1の速度で5分間剪断された。
肝細胞フィブリノーゲンコレクション
ヒト肝癌細胞株HepG2（ATCC、HB-8065）をDMEM、10％胎児ウシ血清およびグルタマックス5％CO2および37℃で培養した80-90％合流時の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、18時間DMEM中で5％CO2および37℃で血清なしでインキュベートしたまたは1％O2、5％CO2および37℃で低酸素室でインキュベートした。, 馴化培地(1mL/4×106細胞)を回収し、分泌されたフィブリノーゲンを以下に記載するように直ちに処理した。
フィブリノゲンおよびフィブリンアッセイ
血漿サンプルは、未処理またはトロンビンおよび/またはフィブリン重合阻害剤、GPRP（シグマ）でインキュベー フィブリンは、血漿の1mL中に50単位のウシトロンビン（シグマ）と10mM CaCl2とMgCl2を40分22℃で添加することによって調製した。, ある実験では、血漿（2mL）を27単位/mLのトロンビンと10mM CaCl2およびMgCl2で40分22℃でインキュベートし、フィブリンポリマーをプラスチックロッド上に集 枯渇した血漿は、トロンビンの27単位/mLの別のアリコートとインキュベートし、新しいフィブリンポリマーを収集し、除去した。 プラズマ（0.2mL）のアリコートは、トロンビン活性を阻害するために添加されたd-フェニルアラニル-プロリル-アルギニルクロロメチルケトン（PPACK、シグマ）の150, 血しょう試料のフィブリノーゲン含量は，ポリクローナル抗フィブリノーゲン抗体コーティングビーズ上のタンパク質を収集し（以下のセクションを参照），ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上のフィブリノーゲンを分解し，コロイドクーマシーで染色することにより推定した。 別の実験では、血漿を8mM GPRP(Sigma)で5分間22℃でインキュベートし、50単位/mLのトロンビンを60分間22℃で添加した後、150μmのPPACKで10分間22℃で反応を急冷した。精製されたフィブリノゲンは、β-アラニン沈殿32によって健康なドナーの新鮮な凍結血漿から単離されたか、または商業的に得られた（Sigma F4883）。,
フィブリノゲンおよびフィブリンジスルフィド結合の酸化還元状態の定量
Dynabeads(2mg,Life Technologies)は、16μgのポリクローナル抗フィブリノゲン抗体(Dako,Cat A0080,Lot00015063)を1mLのリン酸緩衝生理食塩水で回転ホイール上に1時間22℃でコーティングし、過剰な抗体を1mLのリン酸緩衝生理食塩水で三回洗浄することによって除去した。 血漿（0.7mL）またはHepG2条件培地（4.5mL）は、回転ホイール上のコーティングされたビーズの2mgと1時間22℃でインキュベートした。, ビーズは、磁石を用いて収集され、過剰な血漿は、ボリュームを減少させるために吸引し、0.3ミリリットルの5ミリメートル12C-IPAの10％DMSOを含むリン酸緩衝生理食塩水で1時間22℃でタンパク質中の不対Cysチオールをアルキル化するために暗闇の中でインキュベートした。 上清を吸引し、さらに5mm12C-IPAを含むNuPAGE LDS試料緩衝液（Life Technologies）で30分間、60℃でビーズをインキュベートし、上清をSDS-PAGE上で分離した。, 血漿中で生成されたフィブリンポリマーは、プラスチック製のロッド上に収集され、すぐに1ミリリットルの5ミリメートル12C-IPA10％DMSOを含むリン酸緩衝生理食塩水で1時間22℃で水中に沈めた。 フィブリンをリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、ポリマーを1mLの20mM酢酸に24時間22℃で溶解した。5mM12C-IPAを含むNuPAGE LDSサンプルバッファー（Life Technologies）で30分間60℃でインキュベートし、タンパク質をSDS-PAGEで分解した。, 精製されたフィブリノゲン（12μg）は、5mM12C-IPAと10％DMSOを含むリン酸緩衝生理食塩水で1時間22℃で暗闇の中でインキュベートし、タンパク質はSDS-PAGE上
SDS-PAGEゲルをコロイド状coomassie（Sigma）およびフィブリン（ogen）バンドで染色し、除去し、乾燥し、40mMジチオトレイトールでインキュベートし、洗浄した14。 ゲルスライスを5mM13C-IPA（ケンブリッジ同位体）で1時間22℃で暗闇の中でインキュベートし、ジスルフィド結合Cysをアルキル化し、洗浄し、12でタンパク質,5ng/μlのトリプシン(Promega)を25mM NH4CO2中で25℃で一晩、5％ギ酸、50％アセトニトリルでスライスからペプチドを溶出した。 ナノ液体クロマトグラフィー（ナノLC）は、究極の3000HPLCとオートサンプラーシステム（Dionex）を使用して行われました。 サンプルを、C18培地を含むフリットレスナノLCカラム（75μm x-12cm）（1.9μm、120Å ReproSil-Pur120C18-AQ、Dr Maisch GmbH）に注入し、すべての実行について45℃に加熱した。 ペプチドを52分にわたる線形勾配を用いて、0.2μl/分の流量で溶出した。 移動相Aは0で構成されていました。,1%H2Oのギ酸、移動相Bはアセトニトリルから成っていたが:H2O(8:2)0.1%ギ酸と。 勾配は0分2％B、4分2％B、36分45％B、37分80％B、37.5分80％B、39分2％B、52分2％Bであった。高電圧（2000V）を低体積tee（Upchurch Scientific）に印加し、LTQ Orbitrap Velos（Thermo Electron）質量分析計の加熱されたキャピラリー（T=275℃）から位置するカラムチップを配置した。 正イオンはエレクトロスプレーイオン化によって生成され，質量分析計はデータ依存取得モードで動作した。, フルスキャンMSスペクトルはOrbitrapによって(m/z350-1750)30,000の解像度で取得されました。 15最も豊富なイオン（>5000カウント）電荷状態γ+2と順次単離され、活性化q=0.25と10ミリ秒の活性化時間30,000イオンの目標値で衝突誘起解離 MS/MSのために選択されたM/z比は、35秒のために動的に除外されました。Ion Trap Zoom AGCターゲット：3000.00。 イオントラップフルAGCターゲット:30000.00. イオントラップSIM AGCターゲット:10000.00. イオントラップターゲット:10000.00., データ分析を行った利用のマスコットがデーモン(バージョン2.5.0、マトリクス科学の対Swissprotデータベースです。 検索パラメータは、6ppmの前駆体許容差と±0.6Daの生成物イオン許容差であり、ヨードアセタニリド誘導体（Cys）、ヨードアセタニリド13C誘導体（Cys）、酸化（Met）は、三つの逃した切断までの完全なトリプシック切断を有する可変修飾として選択された。 Mascotを用いて同定されたシステイン含有ペプチドのリストを用いて、+2、+3、および+4のそれらのモノイソトピック質量/電荷比（m/z）は、MS-Product（Version v6.2.2、Protein Prospector Tools）を用, 12C-IPAまたは13C-IPAで標識されたCysは、それぞれ133.05276または139.07289の質量を有する。 三十Cys含有ペプチドを分析した（補足表1および2）。 Cys残基の異なる酸化還元形態は、12C-IPAおよび/または13C-IPAで標識されたペプチドの相対的なイオン存在量から定量した。 ペプチドのイオン存在量を計算するために、抽出されたイオンクロマトグラムはXCalibur Qualブラウザ（v2.1.0;Thermo Scientific）を用いて生成された。 面積は、ソフトウェアに組み込まれた自動化されたピーク検出機能を使用して計算した。, データは、日常的に遊離Cysチオールを含むペプチドを検索し、これらは12C-IPAまたは13C-IPAによる不対Cys残基のアルキル化がタンパク質中で完了したことを示している、検出されませんでした。
フィブリノゲンジスルフィドリンクペプチド分析
健康なドナー血漿（0.7mL）は、1時間22℃で回転ホイール上のポリクローナル抗フィブリノゲン抗体コーティングDynabeadsとインキュベートしたビーズを収集し、過剰な血漿を吸引し、0.3mLの5mM12C-IPA10％DMSOを含むリン酸緩衝生理食塩水に添加し、暗闇の中で1時間22℃でインキュベートした。, 次いで、上清を吸引し、ビーズをNuPAGE LDS試料緩衝液で30分間60℃でインキュベートし、上清をSDS-PAGE上で分解した。 フィブリノーゲンを含むゲルスライスを洗浄し、12ng/μlのトリプシン（Promega）で消化する前に4時間37℃で乾燥した。5％（v/v）ギ酸および5％ギ酸および50％（v/v）アセトニトリルでゲルスライスから溶出したペプチドを添加することによって反応を停止した。 0でペプチド。,1%ギ酸(最終容積12μl)を35cm×75µm C18逆相分析カラム上で、2-35%アセトニトリル勾配を用いて22分にわたって300nL/分の流量で300nL/分(Thermo Fisher Scientific Ultimate3000HPLC)で分解し、上記のようにLTQ Orbitrap Velos質量分析計で分析した。 ジスルフィドリンクペプチドは、バイオニック解析ソフトウェア（バージョン3.9-7、タンパク質メトリック）を使用してヒトフィブリノーゲン配列に対して1％ すべてのジスルフィド結合ペプチドを手動で精度を検査した。, 前駆体質量耐性およびフラグメント耐性は、それぞれ10ppmおよび0.6Daに設定した。 可変修飾は、酸化Met、酸化Cys（モノ、ジおよびトリ）と三つの逃した切断までの完全なトリプシン開裂を持つグルタチオニル化Cysとして定義されました。
フィブリノゲン機能性アッセイ
精製されたフィブリノゲン（0.2mLの10mg/mL50mM Hepes、0.14M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4）5mM12C-IPA1時間22°cで暗闇の中で, 未反応IPAは、7kDa MWCO Zebaスピン脱塩カラム（Thermo Fisher）を用いて除去した。 フィブリノゲンまたはフィブリノゲン-IPA（1.1mg/mL50mM Hepes、0.14M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4）ウシトロンビン（シグマ）の1単位/mLで5時間22℃で0.2mLの総容積1.5mLのマイクロセントリフュージンチューブでインキュベートした。 フィブリンポリマーを13,000×gで15分間ペレット化し、上清中に残っているフィブリノゲンの濃度を測定した。 機能性はフィブリンポリマー形成で消費されるフィブリノゲンの%で表現されます。,
光散乱によって測定されたフィブリンポリマー形成
精製されたフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA(1mg/mL in50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)ウシトロンビン(Sigma)の1単位/mLでインキュベートした。 350nmにおける吸光度の増加は、30秒ごとに15分間記録された。
走査型電子顕微鏡（SEM）によって測定されたフィブリノーゲンポリマー構造
フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA（1mg/mL50mM Hepes、0.14M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4）は、1単位/mLのウシトロンビン（シグマ）で2時間22℃で0.2mLの総体積でインキュベートした。, フィブリンポリマーは0.1mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二度すすぎ、2.5％グルタルアルデヒドでPBSで一晩4℃で固定し、PBSで1％OsO4で後固定し、エタノールの傾斜シリーズで脱水し、次の臨界点はライカEM CPD300で乾燥した。 サンプルは15nmの金（K550X、Emitech）でコーティングされ、ツァイスSigmaHD電界放出走査電子顕微鏡でイメージングされたスパッタしました。 SEM顕微鏡写真は、5kV加速電圧および5mmの作動距離で記録された。,
フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA(1mg/mL in50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA(1mg/mL in50mM Hepes,0.14M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4)ウシトロンビン(Sigma)の1単位/mLでインキュベートした2h22°Cのポリプロピレンクロマトグラフィーカラムで0.2mLの総体積で内径4.6mm.カラムを0.8mLのHepesバッファーでオーバーレイし、フラックス(J)は滴の重量から計算した。20分でパーコレートされる。, 透過（Darcy）定数33は、Ks=Jβa/LPの関係から計算され、ここで、Jはフラックス（cm3/s）、λは緩衝液の粘度（室温で0.01ポイズ）、Aは血塊の断面（0.17cm2）、Lは血塊の長さ（1.1cm）、Pは静水圧（1,018,218dyne/cm2）である。
フィブリノーゲンポリマーコンパクションアッセイ
フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA(1mg/mL50mM Hepes、0.14M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)1単位/mLのウシトロンビン(シグマ)16h22°Cで0.5mLの総容積1でインキュベートしました。,5つのmLのmicrocentrifugeの管は乾燥する水および空気の10mg/mL PEG-20000が前に塗りました。 フィブリンポリマーを13,000×gで5-2400秒間遠心分離し、ポリマーから押し出された流体の体積を測定した。
線維素溶解アッセイ
フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン-IPA(1.8mg/mL50mM Hepes、0.14M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)1単位/mLのウシトロンビン(Sigma)2h22°Cで0.5mL24ウェルプレート(15.6mm直径)2h22°cでプラスミンのアリコート(5μlの0.,59μm）をウェルの中心に加え、プレートを湿潤環境下で18時間37℃でインキュベートした。 溶解面積は直角に測定した二つの直径の平均から決定した。
α2-マクログロブリンジスルフィド結合の酸化還元状態の定量
フィブリノゲンの分析のために上記の10健康なドナープラズマは、同じ手順を用いてα2-マクログロブリンの分析のために採用された。 プラズマ(0),7mL)をポリクローナル抗α2-マクログロブリン抗体(Dako,Cat Q0102,Lot20068567)でコーティングされたDynabeads(Life Technologies)を回転ホイール上で1時間22℃でインキュベートし、ビーズを採取し、過剰な血漿を吸引し、0.3mLの5mM12C-IPAの10%DMSOを含むリン酸緩衝食塩水で1時間22℃で暗闇の中でインキュベートし、タンパク質中の不対Cysチオールをアルキル化した。 上清を吸引し、さらに5mm12C-IPAを含むNuPAGE LDS試料緩衝液（Life Technologies）で30分間、60℃でビーズをインキュベートし、上清をSDS-PAGE上で分離した。, SDS-PAGEゲルをコロイドクーマシー（シグマ）で染色し、α2-マクログロブリンバンドを切除し、除去し、乾燥し、40mMジチオトレイトールでインキュベートし、洗浄した14。 ゲルスライスを5mM13C-IPA（ケンブリッジ同位体）で1時間22℃で暗闇の中でジスルフィド結合Cysをアルキル化するためにインキュベートし、12.5ng/μlのトリプシン（Promega）25mM NH4CO2で25℃で一晩25℃でタンパク質の消化の前に洗浄し、乾燥した。5％ギ酸、50％アセトニトリルでスライスからペプチドを溶出した。, 液体クロマトグラフィー、質量分析およびデータ分析は、フィブリノゲン34について記載されている 17Cys含有ペプチドを分析した（補足表2および4）。 Cys残基の異なる酸化還元形態は、12C-IPAおよび/または13C-IPAで標識されたペプチドの相対的なイオン存在量から定量した。
レポートの概要
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