vérgyűjtés és feldolgozás
minden eljárást érintő gyűjtemény az emberi vér egészséges önkéntesek összhangban voltak a humán kutatási Etikai Bizottság a University of Sydney (jóváhagyás HREC 2014/244) és tájékozott beleegyezést kapott minden egyén., Az ECMO-betegek emberi vérének összegyűjtésével kapcsolatos valamennyi eljárás összhangban volt az Alfred Hospital etikával, a Monash Egyetem Emberi kutatási állandó Bizottságával (388/13 jóváhagyás), és minden személytől tájékozott beleegyezést kapott. Minden eljárás összhangban volt az 1983-as Helsinki nyilatkozattal. A vért veneszekcióval gyűjtötték össze egy 21 g pillangó Terumo tű segítségével 10 egészséges donortól, gyógyszerek nélkül (négy férfi, hat nő, 22-58 éves)., Az első 5 mL vért eldobták, hogy elkerüljék a trombint, amely a tű behelyezésének helyén keletkezhetett, majd 3, 2% V/V nátrium-citrátot tartalmazó csövekbe szívták. Az egyetlen központban lévő nyolc beteg vérét, akik ECMO támogatást kaptak (négy férfi, négy nő, 34-67 éves), ACD-a csövekbe (BD Vacutainer) vonták be., Betegek ECMO támogatást kapott anti-véralvadási és/vagy thrombocytaaggregáció-gátló gyógyszerek alapján az orvosok mérlegelési vagy intézményi iránymutatás, ahol a betegek általában megkezdődött a warfarin, a cél a nemzetközi normalizált arány (INR) 2-3, az áthidaló heparin infúzió aszpirin kezelés, valamint a dipiridamol azok számára, akik nagy a kockázata a trombózis. A plazmát kétszer centrifugálással állítottuk elő 800 × g-on 20 percig szobahőmérsékleten., Néhány alkalommal az egészséges donorplazmát szobahőmérsékleten 2000 S−1 vagy 10000 s−1 sebességgel, Kinexus pro+ reométer segítségével 5 percig nyírták.
Májsejt fibrinogén gyűjtemény
Az emberi máj rákos sejt vonal HepG2 (ATCC, HB-8065) volt, kulturált, a DMEM, 10% foetalis borjú szérum, valamint glutamax, 5% CO2, majd 37 °C-Sejtek 80-90% következménye volt mosni foszfát-pufferelt sóoldat, keltetett 18 h DMEM nélkül szérum, 5% CO2, majd 37 °C-on, vagy a hipoxiás kamra, 1% O2, 5% CO2, majd 37 °C-on., A kondicionált közeget összegyűjtöttük (1 mL / 4 × 106 sejt), és a szekretált fibrinogént azonnal feldolgoztuk az alábbiakban leírtak szerint.
fibrinogén és fibrin vizsgálatok
a Plazmamintákat nem kezelték, vagy thrombinnal és/vagy fibrin polimerizációs inhibitorral, Gprp-vel (Sigma) inkubálták. A fibrint 1 mL plazmában állítottuk elő 50 egység szarvasmarha trombin (Sigma), 10 mM CaCl2 és MgCl2 hozzáadásával 40 percig 22 °C-on.a fibrin polimereket műanyag rúd segítségével gyűjtöttük össze., Egy kísérletben a plazmát (2 mL) 27 egység/mL trombinnal, 10 mM CaCl2-vel és MgCl2-vel 40 percig inkubáltuk 22 °C-on, a fibrin polimert pedig egy műanyag rúdra gyűjtöttük, majd eltávolítottuk. A kimerült plazmát egy másik, 27 egység/mL trombint tartalmazó aliquot és az új fibrin polimert gyűjtötték és távolították el. Mindkét sok trombin, 150 µM d-fenilalanil-prolil-arginil-klórmetil-keton (PPACK, Sigma) hozzáadása előtt és után egy aliquot plazmából (0,2 mL) vettek mintát, és a mintákat 16 órán át inkubálták 22 °C-on., A fibrinogén tartalma a plazma minták becsült gyűjti a fehérje a poliklonális anti-fibrinogén antitest-os gyöngyök (lásd a következő részt), megoldása a fibrinogén az SDS-PAGE, valamint festés kolloid Coomassie. Egy másik kísérlet, plazma terjedni kezdett a 8 mM-es GPRP (Sigma) 5 perc 22 °C hozzáadása előtt 50 egység/mL trombin 60 perc, 22 °C. A reakció volt alszik 150 µM vastagságú PPACK 10 perc, 22 °C. a Tisztított fibrinogens különítve egészséges donor friss fagyasztott plazma által β-alanin precipitation32 vagy szerzett kereskedelmi forgalomban (Sigma F4883).,
Mennyiségi meghatározása a redox államok a fibrinogén-fibrin diszulfid kötések
Dynabeads (2 mg, az Élet Technológiák) voltak bevonva 16 µg poliklonális anti-fibrinogén antitestek (Dako, Macska A0080, Sok 00015063) 1 mL foszfát-pufferelt sóoldat egy forgó kerék, 1 h a 22 °C-on, a felesleges antitest eltávolítani, mosás háromszor 1 mL foszfát-pufferelt sóoldat. A plazmát (0, 7 mL) vagy a HepG2-kondicionált közeget (4, 5 mL) 2 mg bevont gyöngyökkel inkubáltuk egy forgó keréken 1 órán át 22 °C-on., A gyöngyök gyűjtötték egy mágnes, többlet plazma szívó, hogy csökkentse a hangerőt, majd inkubáljuk 0, 3 mL, 5 mM 12C-IPA-a-foszfát-pufferelt sóoldat, amely 10% DMSO 1 h a 22 °C-on sötétben, hogy alkilát, egymástól független Cisztein thiols a fehérjék. A szupernatánsokat aspiráltuk, és a gyöngyöket NuPAGE LDS mintapufferrel (Life Technologies) inkubáltuk, amely további 5 mM 12C-IPA-t tartalmaz 30 percig 60 °C-on., A plazmában keletkező Fibrin polimereket egy műanyag rúdra gyűjtötték, majd 1 mL 5 mM-es 12C-IPA-ba merítették 10% DMSO-t tartalmazó foszfát pufferelt sóoldatban, 1 órán át, 22 °C-on, sötétben. A fibrin volt mosni, 3-szor a foszfát-pufferelt sóoldat oldás előtt a polimer 1 mL 20 mM ecetsav 24 h 22 °C. Húsz µl, a megoldás az volt, inkubáljuk NuPAGE LDS minta puffer (Life Technologies), amely 5 mM-12C-IPA-30 min 60 °C-on, valamint a fehérjék megoldani az SDS-PAGE., A tisztított fibrinogént (12 µg) 5 mM 12C-IPA-val inkubáltuk foszfát pufferelt sóoldatban, amely 10% DMSO-t tartalmaz 1 órán át 22 °C-on sötétben, és a fehérje az SDS-oldalon oldódott meg.
az SDS-PAGE géleket kolloid coomassie (Sigma) és fibrin(ogen) szalagokkal festették, kivágták, lefestették, szárították, 40 mM-es ditiotreitollal inkubálták és lemosták14. A gél szeletek voltak inkubáljuk, 5 mM-es 13C-IPA (Cambridge Izotópok), 1 h a 22 °C-on sötétben, hogy alkilát a diszulfid bond-Cisztein, mosott, szárított, mielőtt az emésztést, a fehérjék 12.,5 ng / µL tripszin (Promega) 25 mM NH4CO2-ben egy éjszakán át 25 °C-on.a peptideket a szeletekből 5% hangyasavval, 50% acetonitrillel eluáltuk. A Nano-folyadék kromatográfiát (nano-LC) egy Ultimate 3000 HPLC és autosampler rendszerrel (Dionex) végezték. A mintákat egy C18 adathordozót (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) tartalmazó fritless nano-LC oszlopba (75 µm x ~12 cm) injektáltuk, majd 45 °C-ra melegítettük minden futásnál. A peptideket 52 min feletti lineáris gradienssel eluáltuk, 0,2 µL/perc áramlási sebességgel. Az a mobil fázis 0-ból állt.,1% hangyasav H2O-ban, míg a B fázis acetonitrilből állt:H2O (8:2) 0,1% hangyasavval. A gradiens: 0 perc 2% B; 4 perc 2% B, 36 perc 45% B, 37 perc 80% B, 37,5 perc 80% B, 39 perc 2% B és 52 perc 2% B. nagyfeszültséget (2000 V) kis térfogatú pólóra (Upchurch Scientific) és az oszlopcsúcsot ~0,5 cm-re helyezték el az LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) fűtött kapillárisától (T = 275 °C). A pozitív ionokat elektroszpray ionizációval, a tömegspektrométert pedig adatfüggő akvizíciós üzemmódban állították elő., Teljes scan MS spectra szerezték (m/z 350-1750) az Orbitrap felbontása 30.000. A 15 leggyakoribb ionok (>5000 számít) a felelős tagállamok ≥ +2 volt egymás után, elszigetelt, töredezett belül a lineáris ion csapda segítségével collisionally okozta disszociációs egy aktivációs q = 0, 25-aktiválási idő 10 ms a célérték a 30.000-ionok. M / z arányok kiválasztott MS / MS dinamikusan kizárt 35 s. Ion csapda Zoom AGC cél: 3000.00. Ion csapda teljes AGC cél: 30000.00. Ion csapda SIM AGC cél: 10000.00. Ion csapda MSn AGC cél: 10000.00., Az adatokat a Mascot Daemon (2.5.0 Verzió, Matrix Science) segítségével elemeztük a Swissprot adatbázis ellen. A keresési paraméterek 6 ppm prekurzor tolerancia és ±0,6 Da termékion tűréshatárok, valamint változó módosításként kiválasztott jódacetanilid származék (Cys), jódacetanilid 13C származék (Cys), oxidáció (Met) voltak, legfeljebb három kihagyott hasítás teljes triptikus hasításával. A Mascot segítségével azonosított cisztein tartalmú peptidek listájával a +2, +3 és +4 monoizotóp tömeg/töltési arányukat (m/z) MS-termék (V 6.2.2 Verzió, Protein Prospector Tools) segítségével számítják ki., A 12C-IPA vagy 13C-IPA címkével ellátott Cys tömege 133.05276 vagy 139.07289. Harminc Cys-tartalmú peptidet elemeztünk (1. és 2. Kiegészítő táblázat). A Cys-maradékok különböző redox formáit a 12C-IPA és/vagy 13C-IPA jelzésű peptidek relatív ionbőségéből számszerűsítettük. A peptidek ionbőségének kiszámításához az Xcalibur qual Browser (V2.1.0; Thermo Scientific) segítségével extrahált ionkromatogramokat generáltunk. A területet a szoftverbe épített automatizált csúcsérzékelési funkció segítségével számítottuk ki., Az adatok rendszeresen keresett peptidek Cisztein tartalmú szabad thiols ezek nem észlelt, ami azt jelzi, hogy alkilezés a párosított Cisztein maradékok által 12C-IPA vagy 13C-IPA teljes volt a fehérje.
Fibrinogén diszulfid-linked peptid elemzés
az Egészséges donor plazma (0, 7 mL) volt inkubáljuk poliklonális anti-fibrinogén antitest-os Dynabeads egy forgó kerék, 1 h a 22 °C. A gyöngyök gyűjtötték, a felesleges plazma szívó, 0,3 mL, 5 mM-es 12C-IPA-a-foszfát-pufferelt sóoldat, amely 10% DMSO volt hozzá, majd a lappangási idő 1 h a 22 °C-on sötétben., Ezután a felülúszót leszívták, a gyöngyöket NuPAGE LDS mintapufferrel inkubálták 30 percig 60 °C-on, a szupernatánsok pedig megoldódtak az SDS-oldalon. A fibrinogént tartalmazó gélszeleteket az emésztés előtt 12 ng/µL tripszinnel (Promega) mossuk és szárítjuk 4 órán keresztül 37 °C-on.a reakciókat 5% (v/V) hangyasav és peptidek hozzáadásával állítottuk le 5% hangyasavval és 50% (V/v) acetonitrillel. Peptidek a 0.,1% hangyasavat (végső térfogat 12 µL) 35 cm × 75 µm C18 fordított fázisú analitikai oszlopon oldottunk meg 2-35% acetonitril gradiens alkalmazásával 22 perc alatt, 300 nL/perc áramlási sebességgel (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC), és elemeztük a fent leírt LTQ Orbitrap Velos tömegspektrométeren. A diszulfidhoz kötött peptideket humán fibrinogén szekvenciával szemben a Byonic analysis software (3.9-7 verzió, Protein metrikák) segítségével keresték, 1% – os hamis felfedezési sebességgel. Minden diszulfidhoz kapcsolódó peptidet manuálisan ellenőriztek a pontosság érdekében., A prekurzor tömegtoleranciáját és fragmentum toleranciáját 10 ppm-en, illetve 0,6 Da-on határozták meg. A változó módosításokat oxidált Met, oxidált Cys (mono, di és tri) és glutationilált Cys-ekként definiálták, amelyek teljes tripszin-hasítása legfeljebb három kihagyott hasítás.
Fibrinogén funkció vizsgálat
Tisztított fibrinogén (0,2 mL 10 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) terjedni kezdett, 5 mM-12C-IPA-1 h a 22 °C-on sötétben, hogy alkilát, egymástól független Cisztein thiols a fehérje., A nem fogadott IPA-t egy 7 kDa MWCO Zeba spin sótalanító oszlop (Thermo Fisher) segítségével távolították el. Fibrinogén vagy fibrinogén-IPA (1,1 mg / mL 50 mM Hepe-ben, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) 1 egység/mL szarvasmarha-trombinnal (Sigma) inkubáltuk 5 órán át 22 °C-on, 0,2 mL teljes térfogatban 1,5 mL mikrocentrifuga csövekben. A fibrinpolimereket 15 percen át 13 000 × g-on pelletáltuk, és a felülúszóban maradt fibrinogén koncentrációját mértük. A funkcionalitást a fibrinogén % – ában fejezzük ki, amelyet fibrin polimer képződésben fogyasztanak.,
Fibrin polimerképződést
tisztított fibrinogén vagy fibrinogén-IPA (1 mg / mL 50 mM Hepe-ben, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) 1 egység/mL szarvasmarha-trombinnal (Sigma) inkubáltuk. A 350 nm-es abszorbancia növekedését 30 másodpercenként 15 percen keresztül rögzítették.
Fibrin polimer szerkezet pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) mérve
fibrinogén vagy fibrinogén-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes-ben, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) 1 egység / mL szarvasmarha trombinnal (Sigma) inkubáltuk 2 órán át 22 °C-on, 0,2 mL teljes térfogatban., A fibrin polimerek volt öblíteni kétszer 0.1 M foszfát-puffer, sós (PBS), rögzített 2,5% – os glutáraldehid PBS-ben egy éjszakán át 4 °C, post-fixed a 1% – os OsO4 PBS-ben, kiszáradt a osztályozott sorozat etanol, s a következő kritikus pont szárított egy Leica EM CPD300. A mintákat 15 nm-es Arannyal (K550x, Emitech) vonták be, majd Zeiss SigmaHD mező-emissziós pásztázó elektronmikroszkóppal imagálták. A SEM mikrográfokat 5 kV-os gyorsulási feszültséggel és 5 mm-es üzemi távolsággal rögzítették.,
Fibrin polimer permeációs assay
Fibrinogén, vagy fibrinogén-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) volt inkubáljuk 1 egység/mL, a szarvasmarha-trombin (Sigma) 2 h a 22 °C-on, a teljes mennyiség 0,2 mL-es polipropilén kromatográfiás oszlop belső átmérője 4,6 mm. Az oszlopok voltak, takarta 0,8 mL Hepes puffer, fluxus (J) számították ki, a tömeg, a cseppek, hogy percolated 20 perc., A permeációs (Darcy) állandó33 a KS = JƞA/LP, ahol J a fluxus (cm3/s), ƞ a puffer viszkozitása (0,01 poise szobahőmérsékleten), a A a vérrög keresztmetszete (0,17 cm2), L a vérrög hossza (1,1 cm), P pedig a hidrosztatikus nyomás (1,018,218 dyne/cm2).
Fibrin polimer tömörítés assay
Fibrinogén, vagy fibrinogén-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) volt inkubáljuk 1 egység/mL, a szarvasmarha-trombin (Sigma) 16 h a 22 °C-on, a teljes mennyiség 0,5 mL-1.,5 mL mikrocentrifuga csövek, amelyeket előzőleg 10 mg/mL PEG-20000-rel vontak be vízben és levegőn szárítottak. A fibrin polimereket 13 000 × g-on centrifugáltuk 5-2400 s-On, és a polimerből extrudált folyadék térfogatát mértük.
Fibrinolízis assay
Fibrinogén, vagy fibrinogén-IPA (1.8 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) volt inkubáljuk 1 egység/mL, a szarvasmarha-trombin (Sigma) 2 h a 22 °C-on, a teljes mennyiség 0,5 mL 24-nos lemezek (15.6 mm átmérőjű) a 2 h-22 °C. aliquot a plazmin (5 µL 0.,59 µM) került a kutak középpontjába, a lemezeket nedves környezetben 18 órán át inkubáltuk 37 °C-on. A lízis területeket a derékszögben mért két átmérő átlagából határoztuk meg.
az α2-makroglobulin-diszulfid kötések redoxállapotainak számszerűsítése
a fent leírt 10 egészséges donor plazmát a fibrinogén analízisére alkalmazták α2-makroglobulin analízisére ugyanazon eljárások alkalmazásával. Plazma (0.,7 mL) poliklonális anti-α2-makroglobulin antitest (Dako, Cat Q0102, Lot 20068567) – bevont Dynabeads (Life Technologies) egy forgó kerék 1 óra 22 °C-on a gyöngyöket gyűjtöttük, felesleges plazma aspirált, és inkubáljuk 0,3 mL 5 mM 12C-IPA foszfát-pufferelt sóoldatban, amely 10% DMSO 1 óra 22 °C-on a sötétben alkilát páratlan Cys tiolok a fehérjék. A szupernatánsokat aspiráltuk, és a gyöngyöket NuPAGE LDS mintapufferrel (Life Technologies) inkubáltuk, amely további 5 mM 12C-IPA-t tartalmaz 30 percig 60 °C-on., Az SDS-oldalú géleket kolloid coomassie-val (Sigma) festették, az α2-makroglobulin sávot kivágták, lefestették, szárították, 40 mM-es ditiotreitollal inkubálták és megmosották14. A gél szeletek voltak inkubáljuk, 5 mM-es 13C-IPA (Cambridge Izotópok), 1 h a 22 °C-on sötétben, hogy alkilát a diszulfid bond-Cisztein, mosott, szárított, mielőtt az emésztést, a fehérjék 12.5 ng/µl tripszin (Promega) 25 mM NH4CO2 egyik napról a másikra 25 °C. Peptidek volt eluálódnak a szeleteket 5% – os hangyasav, 50% acetonitril., Folyadékkromatográfiát, tömegspektrometriát és adatanalízist végeztek a fibrinogen34 esetében leírtak szerint. 17 Cys-tartalmú peptidet elemeztünk (2. és 4. Kiegészítő táblázat). A Cys-maradékok különböző redox formáit a 12C-IPA és/vagy 13C-IPA jelzésű peptidek relatív ionbőségéből számszerűsítettük.
jelentési összefoglaló
a kutatástervezéssel kapcsolatos további információk az e cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting összefoglalóban találhatók.