Létrehozása kontúr telek közvetlen kísérleti adatok használatához egy megvalósítható magas átviteli módszer jelentős számú mintát. A vizsgálatnak ezért alkalmasnak kell lennie 96-os lemezes kivitelben történő felhasználásra., Ennek a miniatürizációnak az általános előnyeit az egyetlen reakciócsövektől a 96-kút lemezekig már kimutatták a DNSA és más kolorimetriás vizsgálatok esetében . A vizsgálatban használt összes vizsgálat alkalmas volt a 96-kút lemezformátumra. Az enzim-és szubsztrátkeverékeket nyolc különböző pH-szinten inkubálták. Ezt a nyolc pH-szintet 12 különböző hőmérsékleten inkubáltuk gradiens PCR ciklerrel, ami 96 egyedi reakciófeltételeket eredményezett. Az adatok megszerzéséhez lemezolvasót használtunk., Az eredményeket relatív tevékenységekké alakították át, az egyes lemezeken a legmagasabb aktivitás 100% – ra van állítva. A mérést három példányban hajtottuk végre, majd az átlagolt értékeket a SigmaPlot használatával kontúrtervvé alakítottuk át, az anyagok és módszerek szakaszban leírtak szerint. A tevékenység (z-tengely) a normál tengely helyett lila-vörös színként jelenik meg, hogy fokozza a kontúrrajz nézetét.,
pufferrendszer
a pH és a hőmérséklet megbízható meghatározásának egyik előfeltétele egy stabil pufferrendszer, amely alkalmas az enzimaktivitásra, és közel ellenáll a hőmérséklet emelkedésével járó pH eltolódásnak. Alternatív megoldásként ezt a hatást figyelembe lehet venni a kontúrtervben. A hőmérséklet hatása a pufferek pKa-jára, ezáltal a pH-ra olyan tény, amelyet figyelembe kell venni, különösen a lúgos pufferek, például a Tris esetében ., A vizsgálat követelményeként a citrát-foszfát pufferrendszerünk összes pH-változását 35 °C és 80 °C közötti pH-változás szempontjából teszteltük (lásd a 4.további fájlt). Minden puffer enyhén csökkenti a pH-t emelkedő hőmérsékleten, a magasabb pH-értékekkel rendelkező pufferek nagyobb eltéréseket mutatnak. A hőmérsékletfüggőség a foszfát mennyiségével nő, amely korrelál a foszfát (− 0,0028) és a citrát (0) hőmérsékleti együtthatóival., Mivel az összes puffer hőmérsékletfüggő pH-ingadozása csak csekély volt, az itt használt értéktartományon belüli kontúr parcellák összeállításakor figyelmen kívül lehetett hagyni őket. Mindazonáltal, ha egy másik, magasabb hőmérsékleti együtthatóval rendelkező pufferrendszert kell használni, akkor könnyen hozzá lehet igazítani a pH-érték változásának kontúrtervét úgy, hogy minden pufferhez egyedi pH-t rendelünk minden hőmérsékleten., Ezeket az értékeket vagy kísérletileg határozzák meg a megfelelő anyagok és módszer szakaszban leírtak szerint, vagy a hőmérsékleti együtthatókból származnak, majd ennek megfelelően felhasználhatók a megadott Sigmaplot fájl x-tengelyének (pH) kiigazítására.
A Cel8a
aktivitási tartomány meghatározása az ebben a vizsgálatban a megfelelő kontúr parcellák létrehozásához használt különböző enzimek, szubsztrátok és vizsgálatok áttekintését az 1.táblázat tartalmazza.,
a Cel8A egy celluláz, pontosabban egy endo-glükanáz, a C. thermocellumból, és a glikozid hidroláz család első enzimje volt 8 megoldott kristályszerkezettel. Ebben a vizsgálatban az enzimet BBG-vel inkubáltuk, hogy a javasolt módszerünket a DNSA teszt segítségével érvényesítsük. A Cel8A-ról beszámoltak arról, hogy hőmérséklete optimális 75 °C-on, pH-értéke pedig 5,5-6,5 között van ., Ezek az értékek összhangban vannak a kontúrtervünk eredményeivel, mivel a > 90% – os aktivitáson belül vannak (ábra. 1). Kontúrtervünk azonban azt mutatja, hogy az enzim nagyon aktív különböző körülmények között. Az enzim 60 °C és 65 °C között alacsonyabb pH-érték mellett is elfogadható hatást fejt ki, és maximális aktivitásának több mint 60% – át teszi ki, ha a pH-érték 4,5 alatt van. Módszerünk lehetővé teszi az ilyen hatások megjelenítését, valamint egy enzim teljesítményének értékelését a vizsgált paraméterek bármely pontján.,
Kontúr telek Cel8A segítségével a DNSA assay -, árpa-béta-glükán, mint szubsztrát
tesztelni, Hogy a módszer alkalmas különböző hidroláz vizsgálat módszereit, létrehoztunk egy kontúr telek használata Cel8A a Azo-CM-cellulóz, mint hordozó, valamint a megfelelő assay (Fig. 2). A telken 75 °C-on és 5,5 pH-n hasonló optima látható. Az Azo-CM-cellulóz szubsztrátként történő alkalmazása azonban valamivel kisebb aktivitási tartományt eredményezett., A két vizsgálat közötti kisebb különbségek oka lehet a két szubsztrát eltérő szerkezete és kapcsolódási típusa, ezáltal az enzimhez való kötődési tulajdonságaikban különböznek. Az Azo-CM-cellulóz egy nem természetes szubsztrát hozzáadott festékcsoportokkal, amelyek tovább növelhetik ezt a hatást. A Cel8A használatával megmutathatjuk, hogy módszerünk érvényes adatokat szolgáltat, és két különböző hidrolázvizsgálatban alkalmazható: DNSA és AZO-CM-cellulóz.
AZO-CM-cellulóz
a Celluclast®
egyetlen enzim mellett enzimkeveréket is vizsgáltak. A Celluclast® egy széles körben használt Trichoderma reesei-ből származó kereskedelmi celluláz termék. Főleg sejtobiohidrolázokból és endo-1,4-β-glükanázokból áll, de tartalmaz xilanázokat és legalább egy β-xilozidázt is . A termék kézikönyve szerint az optimális hatás 50 °C és 60 °C, valamint 4 pH között van.,5 és 6,0 . Ebben a munkában először a Celluclast® számára készítettünk egy kontúrrajzot BBG-vel szubsztrátumként a DNSA módszerrel (ábra. 3). A BBG kontúrtervét egy szabványos hőmérsékleti görbe igazolta (ábra. 4). Az 5,5 pH-nál a hőmérsékleti görbe eredményei összhangban vannak a kontúrterv eredményeivel, amelyek ugyanazt a tevékenységi tartományt mutatják. A különálló görbék mérése azonban nem elegendő a Celluclast® BBG-n való aktivitásának leírására. A pH-tartomány, amelyben az enzimkeverék nagy aktivitást mutat, erősen hőmérsékletfüggő., Minél magasabb a hőmérséklet, annál alacsonyabb a pH a magas aktivitás eléréséhez. 45 °C körül a Celluclast® rendkívül aktív (> 60%) 6,5 pH-ig, míg 65 °C-on csak 5,0 pH-ig aktív. A tevékenység két különálló görbével történő leírása tehát szigorúan függ a statikus paraméterként kiválasztott értéktől. A hőmérsékleti grafikonok, például a megadott pH-tartomány két végleténél (4.5 és 6.0) vett hőmérsékleti grafikonoknak jelentősen eltérő eredményeket kell adniuk. Ugyanez igaz a különböző hőmérsékleten vett pH-grafikonokra is., Hogy ez a hatás nyilvánvaló legyen, standard pH-grafikonokat készítettünk 45 °C-on, 55 °C-on és 65 °C-on (ábra. 5). Ez a három pH-görbe azt mutatja,hogy a növekvő hőmérséklet mellett a nagy aktivitású pH-határ savasabb pH-értékekre vált. A három görbe ezáltal ellenőrzi a kontúrtervben látható eredményeket. Továbbá bemutatják a hagyományos különálló aktivitásmeghatározás korlátait, amelyek legalább a Celluclast® esetében a pH-görbék esetében a kiválasztott hőmérséklettől függenek., A kontúrrajz módszerünk használata teljesen kijátssza ezt a problémát azáltal, hogy egy lépésben mérjük a hőmérséklet és a pH hatását.
a Celluclast® kontúr telke a dnsa assay alkalmazásával árpa-β-glükánnal szubsztrátként
hagyományos hőmérséklet optimális meghatározása Celluclast® pH 5.0., A Celluclast® optimális hőmérsékletét az árpa-β-glükánon 5,0 pH-n határoztuk meg. A hagyományos megközelítés 55 °C körüli maximális aktivitást mutat, és összhangban van a megfelelő kontúrtervben látható eredményekkel
hagyományos Ph optimális meghatározása Celluclast® három hőmérsékleten. A Celluclast® pH-optimumát árpa-β-glükánon 45 °C-on, 55 °C-on és 65 °C-on határoztuk meg., Alacsonyabb hőmérsékleten az enzim képes elviselni a magasabb pH-értékeket. Ez összhangban van a megfelelő kontúrtervvel, és a kiválasztott fix paraméter erős hatását mutatja a pH vagy a hőmérséklet optimális külön-külön történő meghatározásakor
a Celluclast® aktivitási tartománya az arabinoxilánon (AX) (ábra) (ábra). 6) különbözik attól, hogy a BBG mint szubsztrát. Az aktivitás elsősorban az alacsonyabb hőmérsékletek felé tolódik el, a 60 °C feletti magas aktivitás nem figyelhető meg., Mivel a Celluclast® több enzim keveréke, a legvalószínűbb, hogy ezek a különböző enzimek eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek. Azonban az aktivitási mintázat hasonló a BBG-éhez; például 4,5 pH-nál az enzimkeverék rendkívül aktív, közel 60 °C-ig, míg 6,5 pH-nál csak nagyon aktív, legfeljebb 50 °C-ig .a szakirodalomban a búzában oldódó Axen található Celluclast® optimumát egy válaszfelület-modell (RSM) határozta meg, amely 4,4 pH és 39 °C körül van., Kontúrtervünk a legmagasabb aktivitást mutatja ugyanabban a hőmérsékleti tartományban, kissé magasabb pH-n, amely még mindig az RSM által meghatározott optimumon belül van. Bár mindkét módszer esetében közel azonos az optimális érték, kontúrtervünk feltűnően megmutatja a Celluclast® AX pontos aktivitását a vizsgált körülmények teljes tartományában, és részletesebb elrendezést mutat, mint az RSM. A CELLUCLAST® BBG-n és AX-en található kontúr parcelláinkkal megmutathatjuk, hogy a komplex enzimkeverékek a javasolt módszerrel elemezhetők.
Kontúr telek Celluclast® használata a DNSA vizsgálat a arabinoxylan, mint szubsztrát
igazolni, továbbá a sokoldalúság, a tevékenység tartomány meghatározása, értékeltük a használat további hordozók, illetve vizsgálatok. A Celluclast® aktivitását p-NP-β-d-glükopiranozidon teszteltük, a kontúrt pedig az ábra mutatja. 7. Ezen a szubsztrátumon a nagy aktivitás a pH 4,0-5,5 és 55 °C és 70 °C közötti meglehetősen szűk tartományra korlátozódik., Ez arra utal, hogy csak egy vagy néhány enzim a Celluclast® enzimkeverékben valószínűleg aktivitást mutat a p-NP-β-d-glükopiranozid felé. a P-NP glikozidok szubsztrátként használhatók kontúr parcellák készítéséhez. Azonban nem minden p-NP glikozid alkalmas szubsztrátok a vizsgálatban, mivel ezek közül több magas hátteret mutat az instabilitás miatt (lásd az 5.további fájlt), különösen akkor, ha a magas hőmérsékletet magas pH-értékekkel kombinálják.
Celluclast® kontúr telke p-NP-β-d-glükopiranozid
módszer a természetes biomassza minta, úgy döntöttünk, hogy egy szalma alapú szubsztrát. A glükóz felszabadulását a Celluclast® segítségével a kereskedelmi D-glükóz HK teszt (Megazyme) segítségével detektáltuk. A szalma sejtfalának fő összetevője a cellulóz, amely az enzimatikus felszabadult glükóz fő forrása. A kontúr telek (ábra., 8) ezért elsősorban a Celluclast® aktivitását mutatja kristályos cellulózon, amely ellenszenves az enzimatikus lebomlás felé . A glükóz legnagyobb felszabadulását körülbelül pH 4,0-5,5 és 40 °C-60 °C-on figyelték meg.a nagy aktivitású tartomány ezért kevésbé széles, mint a BBG esetében, amelyet figyelembe kell venni egy elsősorban a cellulóz lebontását célzó folyamat során., A D-glükóz HK és a p-NP-β-d-glükopiranozid alternatív tesztként történő alkalmazásával bizonyíthatjuk módszerünk alkalmazkodóképességét összesen négy különböző és általánosan használt glikozid hidroláz teszthez. A szalma használata azt mutatta, hogy módszerünk ipari vonatkozású természetes szubsztrátokra is alkalmas, valamint komplex folyamatok és szubsztrátok értékelésére is használható. A Celluclast® különböző aktivitási profilokat mutat különböző szubsztrátumokon., Ezért minden módszer esetében döntő fontosságú egy enzim pH-és hőmérsékleti tartományának meghatározása az érdeklődő szubsztrátummal.
a Celluclast® kontúr telke a D-glükóz HK assay segítségével szalmaalapú természetes szubsztrátummal
/h3>
amikor a javasolt módszerrel kontúrrajzot állítanak elő, számos szempontot kell figyelembe venni., A szubsztrátumnak stabilnak kell lennie,és a mért háttér reprodukálható a 96-os lemez teljes tartományában. Ez előfeltétel, mivel a szubsztrátvezérlést le kell vonni az összes értékből a relatív tevékenységekké történő átalakítás előtt, de nem lehet közvetlenül mérni a tányéron a 96 feltétel mindegyikére. Több p-NP glikozid szubsztrát például nem használható, mivel magas hőmérséklet – és pH-függő hátteret mutatnak. Nagyon pontos pipettázásra van szükség ahhoz, hogy elfogadható szintű szórást lehessen elérni a triplikátumoktól., A 96 fejű és 8 csatornás pipetták használata erősen ajánlott, mivel jelentősen javítják a pontosságot és felgyorsítják az eljárást. Ezenkívül a lemezolvasó és a gradiens PCR cycler műszaki követelmények a módszer megfelelő végrehajtásához. Az a hőmérsékleti tartomány, amelyben a módszer elvégezhető, a gradiens PCR cikler műszaki tulajdonságainak megfelelően módosítható, amely általában 30 °C-ra vagy 40 °C-ra korlátozódik, és gyakran nem tartalmazhat 20 °C alatti értékeket., Közvetlenül átalakítottuk az abszorbanciát egy enzim relatív aktivitására, mivel az értékek mind lineáris kalibrációs görbén vannak (az adatok nem jelennek meg). Ha ez nem így van, akkor a tevékenységet először ki kell számítani, például U/mg-ban, majd ezeket az értékeket fel lehet használni a kontúrterv előállításához. Ha egy kétértékű fémionoktól erősen függő enzim kontúrtervét szeretné előállítani, akkor egy másik pufferrendszert kell használni, mivel a citrát–foszfát alapú pufferek összetett ionokat tartalmaznak.,
míg az RSM megközelítések vitathatatlanul hatékony eszköz a komplex kapcsolatok értékelésére, például a több tényezőt befolyásoló különböző változók, a csak pH és hőmérséklet aktivitásra gyakorolt hatásának meghatározása nem túl bonyolult ahhoz, hogy közvetlen méréssel lehessen elérni. A modell helyes határértékeinek meghatározása több megközelítést is igénybe vehet, és befolyásolhatja a kapott modellt. Az RSM modell csak kis számú mérésből származik az enzim aktivitásának központi pontja körül, majd utána meg kell vizsgálni a tényleges kísérleti értékek pontosságát., Az RSM teljes felbontása tehát alacsonyabb, mint a módszerünkkel kapott érték, ami megnehezíti a celluclast® aktivitási hatásainak magasabb hőmérsékleten és/vagy pH-értékeken történő észlelését. Módszerünk nem igényli komplex statisztikai modellek tervezését, minimális és viszonylag szabványos műszaki követelményekkel is kivitelezhető. Hátránya mind a módszerünk, mind az RSM-megosztás, hogy a szórás közvetlen megjelenítése a háromdimenziós rajzon belül nem lehetséges., Módszerünk azonban lehetővé teszi a szórás kiszámítását minden egyes adatpontra. A legtöbb RSM modell csak a modell központi adatpontjának adataiból határozza meg a teljes modell szórását, míg a többi adatpontot csak egyszer mérik . A szórások természetesen magasabbak egy enzim aktivitásának határain, és a körülmények enyhe változásán belül erős hatást fejtenek ki az aktivitásra. Az optimális és a nem vagy alacsony aktivitású területeken az eltérések jelentősen alacsonyabbak., Mivel a javasolt módszer teljes faktoriális adatkészletet eredményez, szükség esetén statisztikai modellt lehet kiszámítani a további elemzéshez. A származtatott statisztikai modell közvetlenül a kísérleti adatokra alapozna, de egy további lépés, amely nem szükséges a módszer szokásos alkalmazásához.
összefoglalva, a biotechnológiai folyamatok laboratóriumi vagy ipari méretekben történő tervezésekor kulcsfontosságú az enzim vagy enzimkeverék alkalmasságának egyszerű értékelése a folyamatparaméterek kombinációjára., A hőmérséklet és a pH az enzimaktivitást befolyásoló két legfontosabb folyamatfaktor. Az említett tényezők enzimekre gyakorolt hatásának tesztelésére szolgáló hagyományos megközelítések azon a feltételezésen alapulnak, hogy kétdimenziós összefüggés van a hőmérséklet és az aktivitás, valamint a pH és az aktivitás között. Ezzel szemben az új megközelítések határozzák meg a háromdimenziós anyag kapcsolatát, de statisztikai alapúak, összetettek a tervezéshez, és a tényleges adatokhoz való pontosságuk változhat., Az itt bemutatott módszer viszont lehetővé teszi annak gyors és egyszerű meghatározását, hogy a hőmérséklet és a pH milyen hatással van az enzim aktivitására egyidejűleg 96-kútlemez, többcsatornás pipetta és gradiens PCR cikler segítségével. Ezzel az alapvető műszaki berendezéssel lehetőség van olyan Ph -, hőmérsékleti és aktivitási kontúr parcellák előállítására, amelyek közvetlenül kísérleti adatokon alapulnak. A módszert számos széles körben elterjedt glikozid hidrolázvizsgálatra, valamint modell-és komplex szubsztrátokra tesztelték.