az Ochromonas sp növekedése és tápanyagdinamikája.,, törzs bg-1
Fagotrófia által fototróf flagellates úgy gondolják, hogy jelentős ökológiai előnyöket algák mutatnak a viselkedés (Flynn and Mitra, 2009), de ott is úgy tűnik, hogy korlátozások (bár nagyrészt nem jellemző) lefolytatására vegyes táplálkozás egyidejűleg egyetlen sejtben (Raven, 1997). Ezek a korlátok magukban foglalhatják a kettős cellás gépek fenntartásának költségeit vagy hátrányait (a speciális versenytársakhoz képest), vagy esetleg az anabolikus és katabolikus biokémiai utak közötti keresztbeszélést, amelyek mindkét tevékenység teljesítményét egyidejűleg zavarják., Sajnos gyakorlatilag nincs mennyiségi információ a mixotróf viselkedés költségeiről és előnyeiről, sem arról, hogy mindkét folyamatot egymás után vagy egyidejűleg hajtják-e végre e fajok. Az időbeli particionálás lehet egy olyan mechanizmus, amely mindkét képességet perccellákban tartja fenn (bár egy folyamatot egy adott időpontban “várakoztatnak”)., Annak értékelése, hogy mindkét viselkedés előforduló egyidejűleg a speciális élettani előny(ok) heterotrophic táplálkozás mixotrophic alga, de a fogékonyság ez a viselkedés, hogy abiotikus pedig biotikus változók vannak olyan aspektusai, mixotrophic táplálkozás, hogy nehéz volt megállapítani, a hagyományos módszer alapján.
tanulmányoztuk a mixotróf chrysophyte Ochromonas sp., a BG-1 törzs azért, mert axenikus tenyészetben (baktériummentes) termeszthető, és korábban azt jelentették, hogy túlnyomórészt heterotróf organizmus, amely csak baktériumok jelenlétében éri el a magas növekedési rátát (Sanders et al., 2001). Növekedés axenic kultúra megelőzhető a potenciálisan bonyolítja biológiai kölcsönhatások, valamint elemi áramok eredő tevékenységét más élő mikroorganizmusok, a kultúrák, lehetővé téve, hogy egy összehasonlítása nanoSIMS, illetve ömlesztett IRMS mérések jobb megértése a konkrét források a szén, a nitrogén a növekedés, amelyet az alga.,
ezenkívül egyetlen szervetlen nitrogénforrás használata egyszerűsítette kísérleti tervünket úgy, hogy a közegben az egyetlen nitrogénforrás ammónium vagy HKB volt. Az algák általában rendelkeznek mechanizmusokkal mind az ammónium, mind a nitrát felvételére és asszimilációjára, de a transzkriptomi adatok azt mutatják, hogy néhány krizofita, beleértve az Ochromonas sp-t is. a BG-1 törzsből hiányozhat a nitrát asszimiláció genetikai képessége (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Továbbá a MES puffert nem adtuk hozzá a közeghez kísérleteinkben, mert ez alternatív nitrogénforrást biztosíthatott volna. A MES szerves szénforrást is képezhetett az alga számára (Sanders et al., 2001), valamint annak megszüntetése biztosította, hogy az egyetlen szénforrás a közegben vagy bikarbonát vagy HKB volt. Az ebben a kéziratban bemutatott kísérletekből származó transzkriptomikus elemzés azt mutatja, hogy az Ochromonas sp fotoszintetikus gépe. a BG-1 törzset fény jelenlétében fejezzük ki és szabályozzuk (Lie et al., 2017)., Ez az egyszerűsített megközelítés a stabil izotópos címkézéssel együtt lehetővé tette számunkra, hogy meghatározzuk, melyik nitrogénforrás(OK) t és szén-dioxidot használták fel az alga növekedésére.
az Ochromonák szignifikáns növekedési ütemét a jelen vizsgálatban csak akkor sikerült elérni, ha a HKB bőséges volt zsákmányként (1a.ábra). Chl a kultúra dinamikája tükrözte a HKB-n történő legeltetés miatti magas növekedési rátákat is, mivel a CHL a cella−1 koncentrációja egy nagyságrenddel csökkent a fényben, valamint folyamatos sötétben termesztett kultúrák inkubációjának első 48 órájában (1D ábra)., A celluláris klorofill ezen változásai összefüggésben lehetnek a sejtek belsejében lévő Chl a hígításával az alga magas növekedési üteme miatt (Hansen et al., 2000), úgy, hogy a CHL a cell−1 csökkenése az alga gyorsan növekvő arányának következménye volt, nem pedig a klorofill bioszintézisének közvetlen csökkenése. Mindazonáltal az is lehetséges, hogy a klorofill bioszintézis bizonyos szabályozása volt, amikor a HKB transzkriptomikus analízisként jelen volt ezen az alga-n, a klorofill szintézishez kapcsolódó gének szabályozását javasolja fény jelenlétében, amikor a HKB kimerült (Lie et al., 2017)., Mindenesetre ezek a megfigyelések megegyeznek az Ochromonas korábbi tanulmányaival (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), amely egy jól fejlett heterotróf képességet figyelt meg, ami arra utal, hogy a szénrögzítés és talán a fotoszintézisben részt vevő egyéb sejtszerkezetek és folyamatok csökkennek mixotrofikusan, amint azt néhány más alga esetében megfigyelték (Wan et al., 2011).
oldott ammónium, valamint foszfát, felhalmozódott az Ochromonas kultúrákban a kísérletek első 48 órájában, amikor a HKB-t aktívan legeltették (2.ábra)., Ez az eredmény azt jelzi, hogy a szemcsézett HKB-ből származó felesleges nitrogén és foszfor kiválasztódott az alga által. Anyagmérlegen alapuló számítások változások a zsákmányt/alga abundances a sejtek nitrogén tartalom jelezte, hogy akár 50% – kal, a nitrogén található fogyasztott HKB volt asszimilálódtak az alga, miközben jelentős mennyiségű a felesleges nitrogén megjelent elsősorban ammónium-időszakban az aktív bakteriális legeltetés (2.Ábra)., Ezek a nitrogén asszimiláció (és kiválasztás) értékei összhangban vannak a hasonló méretű heterotróf protiszták asszimilációs hatékonyságával (Taylor, 1982; Caron and Goldman, 1990), összhangban azzal a következtetéssel, hogy az Ochromonák túlnyomórészt heterotrópként növekedtek, amikor a zsákmány bőséges volt. Továbbá a transzkriptomi elemzések kimutatták, hogy a különböző ammónium transzportereket az Ochromonas sp fejezi ki. a HKB-n növekvő bg-1 törzs a baktériumok nagyon alacsony abundanciákra történő legeltetését követő növekedéshez képest (Lie et al., 2017)., Ezért úgy tűnik, hogy az ammónium sejtből történő kivitelére szolgáló transzporterek eltérhetnek az ammónium felvételéhez használt transzporterektől, amint azt más szervezetek esetében megfigyelték (Shnaiderman et al., 2013).
érdekes módon az ammónium -, de nem foszfát-koncentrációja csökkent a közegben, miután a HKB-t legeltetéssel eltávolították (azaz 48 óra után; 2.ábra), amikor az Ochromonákat a fényben termesztették., Ez az eredmény azt jelzi, hogy az alga aktívan felvette az ammóniumot (de nem a foszfátot) a táptalajból, amikor a baktériumok már nem álltak rendelkezésre, és fotoszintézist indukáltak (1D ábra). Ezzel szemben mind az ammónium, mind a foszfát a sötétben termesztett kultúrákban tovább emelkedett a kísérlet során (pontozott vonalak a 2.ábrán). A zsákmány kimerülése után még a fényben sem történt jelentős nettó alga-populáció-növekedés, és a két elem felvételének dichotómiájának magyarázata nem tisztázott., Úgy gondoljuk, hogy az ammóniumot azért vették fel, mert kifejezetten a sejt fotoszintetikus gépeinek újjáépítéséhez volt szükség.
a foszfát folyamatos megjelenése a tenyészközegben a kísérletek későbbi részében ellentétben áll néhány más Ochromonas faj vizsgálataival, amelyek foszfát felvételéről számoltak be, amikor az alga autotrofikusan növekszik (Rothhaupt, 1996)., A hiánya foszfát felvétele által törzs BG-1, arra utalhat, hogy ez a Ochromonas képtelen volt hatékony foszfát felvétele (ami szintén magyarázza, részben a szegény phototrophic növekedési kapacitása ez a törzs), vagy, hogy a foszfor nem volt szükség jelentős összegeket mobiltelefon-átszervezés kapcsolódó változás, hogy phototrophic növekedés, ezért a felvétel nem ösztönözte a változás phototrophy., Nem valószínű, hogy a foszfát koncentrációjának folyamatos növekedése a közegben oldott szerves foszforvegyületek bomlása miatt következett be, mivel a tenyészetekben nem volt élő baktérium.
Következtetések a stabil izotóp tapintó kísérletek
Stabil izotóp elemzés (nanoSIMS, illetve ömlesztett elemi analízis-IRMS) azt mutatta, hogy mind a szervetlen (13C-hidrogén-karbonát, valamint 15N-ammónium -) hordozók, illetve 13C/15N-jelölt HKB asszimilálta Ochromonas, hozzájárulva 15N, valamint 13C mobil dúsítás után 48 h inkubálás (4.Ábra)., A szervetlen szubsztrátokból vagy a HKB-ből történő dúsítás nagysága azonban azt mutatta, hogy a mixotróf növekedés során a szén és a nitrogén elsődleges forrásai fagotrófiából származtak. Az izotópos tömegegyensúly azt mutatta, hogy a nitrogén 88-95% – a és a szén 84-99% – a HKB-ből származik, amikor az Ochromonák a fényben mixotrofikusan növekedtek. 13C dúsítást figyeltek meg a fényben termesztett algákban a sötéthez képest (1.Kísérlet vs 3. Kísérlet), amikor 13C-bikarbonát állt rendelkezésre (4. ábra)., A fotoszintetikus szénrögzítés számított hozzájárulása azonban a biomasszába asszimilált szénnek csak 1-10% – a volt. A folyamatos sötétséghez képest a fényben megfigyelt zsákmányból származó nitrogén beépülésének nagyobb hatékonysága (3.ábra; 1., 2. kísérletek vs 3. kísérlet) azt sugallja, hogy a fény szerepet játszott, bár kisebb, az alga fagotróf hatékonyságában., Ezért annak ellenére, hogy az Ochromonák fotoszintetikus gépezete a HKB-n fagotrofikusan növekszik (amint azt a Chl a alacsony sejtkvóta bizonyítja; 1D ábra), a fénynek csekély és pozitív hatása volt az algák táplálkozására. Mivel a fotoszintézis által rögzített szénmennyiség az alga által asszimilált szén kis részét képviselte, amikor a HKB-n növekszik, úgy gondoljuk, hogy a fotoszintetikus készülék energiát, nem pedig szenet biztosít a celluláris anyag számára, mivel az Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
izotópos tömegmérleg-számításainknak két kikötése van. Először is, nem ellenőriztük a kultúrák pH-alakulását, ami jobb betekintést adott volna a karbonát egyensúlyába, amelyet a légzés és a szén rögzítése, valamint a légkörrel való csere befolyásolt volna. Mint ilyen, a jelzett szervetlen szén felhasználásával végzett kísérleteken alapuló becslésünk alábecsülhette az Ochromonas sp által rögzített szervetlen szén mennyiségét. BG-1 (1% az izotóp tömegmérleg szerint)., Mindenesetre a jelzett HKB-t használó kísérletet nem kellett volna érintenie ennek a figyelmeztetésnek, és a szervetlen szubsztrátumból származó szén 10% – ának becslése valószínűleg reális. Másodszor, az Ochromonas-t nem hatékony szénrögzítőnek tekintik a hiányzó szénkoncentrációs mechanizmusok miatt (Maberly et al. 2009), amelyek növelik a CO2 koncentrációt a CO2 és/vagy bikarbonát RubisCO enzimbe történő szállításával (Raven et al., 2008). Másrészt a transzkriptomi elemzés kimutatta, hogy a BG-1 törzs fotoszintetikus gépei funkcionálisak (Lie et al.,, 2017), és a jelzett bikarbonáttal végzett kísérleteink a 13C frakcionált bőség jelentős dúsítását mutatták az Ochromonasban( 4. és 5. ábra); ezért az Ochromonas sp. a BG-1 törzsnek van némi képessége szervetlen szén használatára, bár nem hatékonyan.
Mindazonáltal az Ochromonák erős heterotróf aktivitása, miközben mixotrofikusan növekszik, valószínűleg növeli az intracelluláris CO2-medencét, valamint annak fluxusát. Hüvelykujjszabályként úgy vélik, hogy a heterotróf protiszták a lenyelt szerves anyag 40% – át asszimilálják, míg 30% – ot szabadítanak fel, és további 30% – ot (szán, 1989)., Ennek alapján az Ochromonas által az exponenciális növekedés során CO2-ként felszabaduló szén teljes mennyisége olyan magas lehet, mint az inkubáció elején hozzáadott Teljes bikarbonát, amelynek következményei vannak a bemutatott izotóp tömegmérlegre. Ha feltételezzük, hogy a HKB légzésből származó izotóposan dúsított CO2 ugyanolyan szinten áll rendelkezésre, mint az oldott szervetlen szén, az Ochromonákkal végzett inkubáció és a HKB címkével jelzett jel azt jelzi, hogy a szén ~84% – a A HKB-ből származik., A HKB-ből származó asszimilált szén legfeljebb 20% – a valójában megfelelhet az eredetileg belélegzett, majd az Ochromonas által rögzített szénnek. Ha helyes, a fagotróf aktivitásból származó légzés egyfajta szénkoncentrációs mechanizmusként működne ezen Ochromonák számára. Míg az elsődleges szénforrás Ochromonas növekvő mixotrophically származik HKB, egy nem elhanyagolható mennyiségű lehetett volna származik a légzés, majd CO2 rögzítése a bakteriális biomassza.,
az Ochromonas metabolizmusát az autotrófia felé tolta, amikor a fényben inkubálták, de csak azután, hogy a tenyészetekben kimerítette a HKB-T (≈ 48 H növekedés). Ez az eltolódás tükrözi a tömeges IRMS 13C tört a bőség, a kezelés segítségével a jelölt HKB, ahol csökkenés volt megfigyelhető között 48 h 145 h (Kísérlet 2 5. Ábra), mely a beépítése jelöletlen szén-dioxid alga biomassza keresztül fény folyamatok. A krizofitákat általában rossz autotróf szén-rögzítőknek tekintik a rossz szén-koncentrációs mechanizmusok miatt (Maberly et al., 2009)., Mindazonáltal ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szervetlen szén asszimiláció jelentős szintje volt. A fényben termesztett kultúrák összehasonlítása (1. Kísérlet az 5. ábrán) és a folyamatos sötétség (3. Kísérlet az 5. ábrán) kimutatta, hogy a sötét kultúrák 15N frakcionált bősége nem változott 95 óra után, míg a fényben lévő kultúrák tovább gazdagodtak 15N-ben, jelezve, hogy az Ochromonák továbbra is asszimilálják a nitrogént, hogy fenntartsák anyagcseréjét, miután a HKB kimerült., Ezek az eredmények összhangban voltak az ammónium koncentrációjának megfigyelt csökkenésével a közegben ebben az időszakban (3a ábra), bár a foszfát folyamatos megjelenése a közegben ebben az időszakban megmagyarázhatatlan.
a korábbi vizsgálatok (Popa et al., 2007; árva és ház, 2009; Kopf et al., 2015; ábra 4c)., Az ömlesztett mérések azonban valamivel alacsonyabbak voltak a szén frakcionált bőség értékei szempontjából, különösen a magasan dúsított minták esetében (4D ábra). Úgy gondoljuk, hogy a nanoszimák és a szén ömlesztett izotópmérései közötti különbségek összefügghetnek azzal a ténnyel, hogy a nanoszimok mintáit glutaraldehiddel tartósították, míg az ömlesztett elemzéshez használt minták nem voltak. Kimutatták, hogy a rögzítés befolyásolja a celluláris szenet (Musat et al., 2014), bár várható volt, hogy ez hígítja a 13C-t a nanoSIMS mérésekben az ömlesztett értékekhez képest., Valószínűbb magyarázat, hogy az egysejtes méréseket nem befolyásolja a sejtes törmelék a tenyészetben, amely kevésbé gazdagodhat. Az ömlesztett 13C értéket ezen összetevők a nanoszimák méréseihez viszonyítva hígíthatják, ami azt jelenti, hogy a nanoszimák adatai pontosabban tükrözhetik az algák szén-és nitrogénfelvételét. Ugyanakkor a sejt-sejt variabilitás is hozzájárulhatott az ömlesztett és nanoszimák mérései közötti kisebb különbségekhez.,
a nanoszimák alkalmazása ebben a vizsgálatban az első alkalmazását jelenti a szén-és tápanyag-fluxusok vizsgálata felé egy mixotróf alga-ban, és lehetővé tette a szén-és energiatermelés jobb megértését e faj által, valamint a sejtek anyagcseréjét. Eredményeink bővítik az Ochromonas sp hagyományos elemzéseiből rendelkezésre álló információkat. a BG-1 törzset különböző fény-és ragadozó körülmények között termesztik (Sanders et al., 2001), megerősítve, hogy a növekedéshez használt nitrogén és szén nagy részét bakteriális zsákmányán keresztül nyerik., Bár az eredményeket nem lehet közvetlenül extrapolálni az összes fajra az algák kontinuumán, különböző mixotróf stratégiákkal, munkánk igazolja a stabil izotópvizsgálati kísérletek és nanoszimák használatát, hogy jobban megértsük a mixotrophia metabolikus alapjait egy fajban. Ezenkívül megközelítést biztosít a mixotrofikus táplálkozás környezeti mintákban történő értékeléséhez. Ochromonas sp. a BG-1 törzs ideális modellrendszert biztosított az ömlesztett izotóp analízis nanoszimákkal való összehasonlításához, mivel a baktériumokat a kísérletek első 48 órájában történő legeltetéssel gyorsan eltávolították., A két mérés közötti megállapodás azt mutatja, hogy a nanoszimák pontosan rögzítették a szén-és tápanyagszerzés dinamikáját ebben a mixotroph-ban, ezért szélesebb körben alkalmazhatók a komplex vegyes közösségekben a mixotrófia feltárására, ahol az ömlesztett intézkedések nem lennének elegendőek e dinamika rögzítéséhez. Ez és a későbbi részletes vizsgálatok tovább javítják a mixotróf algák táplálkozásának megértését.