La création d’un tracé de contour à partir de données expérimentales directes nécessite l’utilisation d’une méthode réalisable à haut débit et d’un nombre considérable d’échantillons. Le test doit donc être adapté à une utilisation dans une conception de plaque à 96 puits., Les avantages généraux de cette miniaturisation des tubes à réaction simple aux plaques à 96 puits ont déjà été démontrés pour le DNSA et d’autres tests colorimétriques . Tous les essais utilisés dans cette étude étaient adaptés au format de la plaque à 96 puits. Pour produire un tracé de contour, les mélanges d’enzymes et de substrats ont été incubés à huit niveaux de pH différents. Ces huit niveaux de pH ont été incubés à 12 températures différentes à l’aide d’un cycleur de PCR à gradient, ce qui a donné lieu à 96 conditions de réaction uniques. Un lecteur de plaques a été utilisé pour obtenir les données., Les résultats ont été transformés en activités relatives, l’activité la plus élevée sur chaque plaque étant fixée à 100%. La mesure a été effectuée en trois exemplaires et les valeurs moyennes ont ensuite été transformées en un tracé de contour à L’aide de SigmaPlot, comme décrit dans la section matériaux et méthodes. L’activité (axe z) est représentée sous forme de couleur allant du violet au rouge au lieu d’un axe normal pour améliorer la vue du tracé de contour.,
système tampon
Une condition préalable à la détermination fiable du pH et de la température optima est un système tampon stable qui convient en ce qui concerne l’activité enzymatique et presque résistant à un changement de pH avec l’augmentation de la température. Alternativement, cet effet pourrait être considéré dans le tracé de contour. L’influence de la température sur le pKa des tampons et donc le pH est un fait qui doit être pris en compte, en particulier pour les tampons alcalins tels que Tris ., Comme exigence pour le test, toutes les variations de pH de notre système tampon citrate-phosphate ont été testées pour un changement de pH entre 35 °C et 80 °C (voir le fichier supplémentaire 4). Tous les tampons montrent une légère diminution du pH avec la hausse de la température, Les tampons à des valeurs de pH plus élevées montrant des écarts plus élevés. La dépendance à la température augmente avec la quantité de phosphate, qui est en corrélation avec les coefficients de température du phosphate (− 0,0028) et du citrate (0)., Étant donné que les variations de pH en fonction de la température de tous les tampons n’étaient que mineures, elles pouvaient être négligées dans la compilation des courbes de niveau dans la plage de valeurs utilisée ici. Néanmoins, si un autre système tampon avec un coefficient de température plus élevé doit être utilisé, il est facilement possible d’adapter le tracé de contour pour la variation du pH en attribuant à chaque tampon un pH individuel à chaque température., Ces valeurs sont déterminées expérimentalement comme décrit dans la section matériaux et méthode respectifs ou dérivées des coefficients de température et peuvent ensuite être utilisées pour adapter l’axe x (pH) du fichier Sigmaplot fourni.
détermination de la plage D’activité pour Cel8A
le tableau 1 donne un aperçu des différentes enzymes, substrats et analyses utilisés dans cette étude pour la création des courbes de niveau respectives.,
Cel8A est une cellulase, plus précisément une endo-glucanase, de C. thermocellum et a été la première enzyme de la glycoside hydrolase famille 8 avec une structure cristalline résolue . Dans cette étude, l’enzyme a été incubée avec BBG pour valider notre méthode proposée à l’aide du test DNSA. Il a été rapporté que Cel8A avait une température optimale à 75 °C et un pH optimal entre 5,5 et 6,5 ., Ces valeurs sont conformes aux résultats de notre Tracé de contour car elles sont dans la région de> 90% d’activité (Fig. 1). Notre tracé de contour, cependant, montre que l’enzyme est très active dans un large éventail de conditions différentes. L’enzyme présente des activités acceptables à des valeurs de pH inférieures entre 60 °C et 65 °C et fonctionne également avec plus de 60% de son activité maximale à des valeurs de pH inférieures à 4,5. Notre méthode fournit les moyens de visualiser de tels effets et d’évaluer la performance d’une enzyme à tout moment dans les paramètres testés en un coup d’œil.,
Tracé de contour de Cel8A en utilisant le test DNSA avec du β-glucane d’orge comme substrat
pour tester si notre méthode convient à différents types de méthodes d’analyse hydrolase, nous avons produit un tracé de contour en utilisant cel8a avec azo-cm-cellulose comme substrat et le test respectif (Fig. 2). Le graphique montre des optima similaires à 75 °C et à pH 5,5. Cependant, l’utilisation de L’Azo-CM-cellulose comme substrat a entraîné une plage d’activité légèrement plus petite., Les différences mineures entre les deux essais pourraient être dues aux structures et aux types de liaison dissemblables des deux substrats, ce qui diffère dans leurs propriétés de liaison à l’enzyme. Azo-CM-cellulose est un substrat non naturel avec des groupes de colorants ajoutés, ce qui pourrait ajouter davantage à cet effet. En utilisant Cel8A, nous avons pu montrer que notre méthode fournit des données valides et convient à deux tests établis différents pour les hydrolases: DNSA et Azo-CM-cellulose.
tracé du Contour de Cel8A à L’aide D’AZO-CM-cellulose
détermination de la plage d’activité pour Celluclast®
en plus d’une seule enzyme, un mélange enzymatique a été étudié. Celluclast® est un produit de cellulase commerciale largement utilisé dérivé de Trichoderma reesei. Il se compose principalement de cellobiohydrolases et d’endo-1,4-β-glucanases, mais comporte également des xylanases et au moins une β-xylosidase . Le manuel du produit indique que les activités optimales se situent entre 50 °C et 60 °C et pH 4.,5 et 6.0 . Dans ce travail, nous avons d’abord réalisé un tracé de contour pour Celluclast® avec BBG comme substrat en utilisant la méthode DNSA (Fig. 3). Le tracé du contour BBG a été vérifié par une courbe de température standard (Fig. 4). Les résultats de la courbe de température à pH 5,5 sont conformes aux résultats du tracé de contour, montrant la même plage d’activité. Cependant, la mesure de courbes séparées est inadéquate pour décrire l’activité de Celluclast® sur BBG. La plage de pH dans laquelle le mélange enzymatique montre une activité élevée dépend fortement de la température., Plus la température est élevée, plus le pH doit être bas pour atteindre une activité élevée. Autour de 45 °C, Celluclast® est très actif (> 60%) jusqu’à un pH de 6,5, alors qu’à 65 °C, il n’est très actif que jusqu’à un pH de 5,0. Décrire l’activité avec deux courbes distinctes dépend donc strictement de la valeur choisie comme paramètre Statique. Les graphiques de température, par exemple, ceux pris aux deux extrêmes de la plage de pH indiquée (4,5 et 6,0) devraient donner des résultats significativement différents. Il en va de même pour les graphiques de pH pris à différentes températures., Pour rendre cet effet évident, nous avons produit des graphiques de pH standard à 45 °C, 55 °C et 65 °C (Fig. 5). Ces trois courbes de pH montrent que, avec l’augmentation de la température, la limite de pH pour une activité élevée se déplace vers des valeurs de pH plus acides. Les trois courbes vérifient ainsi les résultats vus dans le tracé de contour. En outre, ils montrent les limites de la détermination conventionnelle de l’activité séparée, qui au moins pour Celluclast® est, dans le cas des courbes de pH, dépendante de la température choisie., L’utilisation de notre méthode contour plot contourne complètement ce problème en mesurant l’effet de la température et du pH en une seule étape.
tracé de Contour de Celluclast® à l’aide de la DNSA dosage avec de l’orge-ß-glucane comme substrat
détermination optimale de la température conventionnelle du Celluclast® à pH 5,0., L’optimum de température de Celluclast® sur le β-glucane d’orge a été déterminé à pH 5,0. L’approche conventionnelle montre le maximum d’activité autour de 55 °C et est en conformité avec les résultats observés dans le tracé de contour
détermination optimale du pH conventionnel du Celluclast® à trois températures. Le pH optimum de Celluclast® sur le β-glucane d’orge a été déterminé à 45 °C, 55 °C et 65 °C., À des températures plus basses, l’enzyme peut tolérer des valeurs de pH plus élevées. Ceci est conforme au tracé de contour correspondant et montre le fort impact du paramètre fixe choisi lors de la détermination du pH ou de la température optimale séparément
la plage d’activité de Celluclast® sur arabinoxylan (AX) (Fig. 6) diffère de celui avec BBG comme substrat. L’activité est notamment déplacée vers des températures plus basses, aucune activité élevée n’étant observée au-dessus de 60 °C., Celluclast® étant un mélange de plusieurs enzymes, il est fort probable que ces différentes enzymes aient des caractéristiques différentes. Cependant, le modèle d’activité est similaire à celui du BBG; par exemple, à pH 4,5, le mélange enzymatique est très actif jusqu’à près de 60 °C, alors qu’à pH 6,5, il n’est très actif que jusqu’à 50 °C. Dans la littérature, L’optimum de Celluclast® sur la hache soluble du blé a été déterminé par un modèle de surface de réponse (RSM) et s’est avéré être autour de pH 4,4 et 39 °C., Notre Tracé de contour montre l’activité la plus élevée dans la même plage de température et à un pH légèrement plus élevé, qui est toujours dans l’optimum déterminé par le RSM. Alors que l’optimum est presque le même pour les deux méthodes, notre Tracé de contour montre de manière frappante l’activité exacte de Celluclast® sur AX dans toute la gamme des conditions testées et présente une disposition plus détaillée que le RSM. Avec nos tracés de contour de Celluclast® sur BBG et AX, nous avons pu montrer que des mélanges enzymatiques complexes peuvent être analysés avec la méthode proposée.
Tracé de contour de Celluclast® en utilisant le test DNSA avec arabinoxylan comme substrat
pour démontrer davantage la polyvalence de notre gamme d’activités détermination, nous avons évalué son utilisation avec des substrats et des dosages supplémentaires. L’activité de Celluclast® sur le P-NP-β-D-glucopyranoside a été testée et le tracé de contour est illustré à la Fig. 7. L’activité élevée sur ce substrat est limitée à une plage assez étroite entre pH 4,0 à 5,5 et 55 °C à 70 °C., Cela suggère que seulement une ou quelques enzymes dans le mélange d’enzymes Celluclast® montre probablement une activité vers le P-NP-β-D-glucopyranoside. les glycosides p-NP peuvent être utilisés comme substrats pour la préparation de tracés de contour. Cependant, tous les glycosides de P-NP ne sont pas des Substrats appropriés dans le test, car plusieurs d’entre eux montrent un fond élevé en raison de l’instabilité (voir le fichier supplémentaire 5), en particulier lorsque des températures élevées sont combinées avec des valeurs de pH élevées.
tracé de Contour de Celluclast® à l’aide de p-NP-β-d-glucopyranoside
Pour tester l’application de notre méthode sur une biomasse naturelle de l’échantillon, nous avons choisi d’utiliser une paille à base de substrat. La libération du glucose par Celluclast® a été détectée à l’aide du test commercial d-glucose HK (Megazyme). Le composant principal dans la paroi cellulaire de la paille est la cellulose , qui est la principale source de glucose libéré enzymatiquement. Le contour de la parcelle (Fig., 8), montre donc principalement l’activité de Celluclast® sur la cellulose cristalline, qui est récalcitrante à la dégradation enzymatique . La libération la plus élevée de glucose a été observée à un pH approximatif de 4,0 à 5,5 et de 40 °C à 60 °C. La plage d’activité élevée est donc moins large que celle déterminée pour le BBG, ce qui doit être pris en compte pour un procédé visant principalement à dégrader la cellulose., Avec l’utilisation de d-glucose HK et de P-NP-β-D-glucopyranoside comme tests alternatifs, nous avons pu démontrer l’adaptabilité de notre méthode à un total de quatre tests différents et couramment utilisés de glycoside hydrolase. L’utilisation de la paille a montré que notre méthode est également adaptée aux substrats naturels d’intérêt industriel et pourrait être utilisée pour l’évaluation de processus et de substrats complexes. Celluclast® montre différents profils d’activité sur différents substrats., Collectivement pour toutes les méthodes, il est donc crucial de déterminer le pH et de température données d’une enzyme avec le substrat d’intérêt.
tracé du contour de Celluclast® en utilisant le dosage d-glucose HK avec un substrat naturel à base de paille
considérations lors de l’utilisation de la méthode
lorsqu’un tracé de contour est produit avec la méthode proposée, plusieurs considérations doivent être prises en compte., Le substrat doit être stable et le fond mesuré reproductible dans toute la gamme de conditions dans la plaque à 96 puits. Ceci est une condition préalable, car le contrôle du substrat doit être soustrait de toutes les valeurs avant la conversion en activités relatives, mais ne peut pas être mesuré directement sur la plaque pour chacune des 96 conditions. Plusieurs substrats de glycoside p-NP, par exemple, ne peuvent pas être utilisés, car ils présentent un fond fortement dépendant de la température et du pH. Un pipetage très précis est nécessaire pour obtenir des niveaux acceptables d’écart type par rapport aux triplicats., L’utilisation de pipettes à 96 têtes et à 8 canaux est fortement recommandée car elles améliorent considérablement la précision et accélèrent la procédure. De plus, le lecteur de plaques et le cycleur de PCR à gradient sont des exigences techniques pour exécuter correctement la méthode. La plage de température dans laquelle la méthode peut être effectuée peut être adaptée en fonction des propriétés techniques du cycleur PCR à gradient, qui est généralement limitée à 30 °C ou 40 °C et ne peut souvent pas inclure des valeurs inférieures à 20 °C., Nous avons directement converti l’absorbance en activité relative d’une enzyme, car les valeurs sont toutes sur une courbe d’étalonnage linéaire (données non représentées). Si ce n’est pas le cas, toutefois, l’activité doit être calculé, par exemple, en U/mg, et ces valeurs peuvent ensuite être utilisées pour produire le tracé de contour. Lorsqu’on veut produire un tracé de contour pour une enzyme qui dépend fortement des ions métalliques divalents, un système tampon différent doit être utilisé, car les tampons à base de citrate–phosphate complexent ces ions.,
bien que les approches RSM soient un outil incontestablement puissant pour évaluer des relations complexes, par exemple, diverses variables affectant de multiples facteurs, la détermination de l’effet du pH et de la température uniquement sur l’activité n’est pas trop complexe pour être réalisée par mesure directe. La détermination des valeurs de bordure correctes du modèle peut prendre plusieurs approches et peut influencer le modèle résultant. Le modèle RSM est dérivé de seulement un petit nombre de mesures autour du point central de l’activité de l’enzyme et la précision vers les valeurs expérimentales réelles doit être testée par la suite., La résolution globale du RSM est donc inférieure à celle obtenue avec notre méthode, ce qui rend difficile de voir les effets d’activité comme indiqué pour Celluclast® à des températures et/ou des valeurs de pH plus élevées. Notre méthode ne nécessite pas la capacité de concevoir des modèles statistiques complexes et peut être réalisée avec des exigences techniques minimales et relativement standard. Un inconvénient de notre méthode et de la part de RSM est que la visualisation directe de l’écart-type dans le graphique en trois dimensions n’est pas possible., Cependant, notre méthode permet de calculer l’écart type pour chaque point de données individuel. La plupart des modèles RSM déterminent l’écart type pour l’ensemble du modèle uniquement à partir des données du point de données central du modèle, tandis que les autres points de données ne sont mesurés qu’une seule fois . Les écarts-types sont naturellement plus élevés aux frontières de l’activité d’une enzyme et illustrent un fort impact sur l’activité dans un léger changement de conditions. Autour de l’optimum et dans les zones d’activité nulle ou faible, les écarts sont significativement plus faibles., Étant donné que la méthode proposée donne un ensemble complet de données factorielles, il serait possible de calculer un modèle statistique si nécessaire pour une analyse plus approfondie. Le modèle statistique dérivé reposerait directement sur des données expérimentales, mais constitue une étape supplémentaire qui ne devrait pas être nécessaire pour les applications standard de la méthode.
En résumé, une évaluation facile de l’aptitude d’une enzyme ou d’un mélange enzymatique à une combinaison de paramètres de processus est d’une importance cruciale lors de la conception de processus biotechnologiques à l’échelle de laboratoire ou industrielle., La température et le pH sont deux des facteurs de processus les plus importants influençant l’activité enzymatique. Les approches conventionnelles pour tester l’effet de ces facteurs sur les enzymes sont basées sur l’hypothèse qu’il existe une corrélation bidimensionnelle entre la température et l’activité ainsi que le pH et l’activité. En revanche, les nouvelles approches déterminent la relation dans la matière tridimensionnelle, mais sont basées sur des statistiques, complexes à concevoir et leur exactitude par rapport aux données réelles peut varier., La méthode introduite ici permet en revanche de déterminer rapidement et facilement l’effet que la température et le pH ont sur l’activité de l’enzyme simultanément à l’aide de plaques à 96 puits, de pipettes multicanaux et d’un cycleur de PCR à gradient. Avec cet équipement technique de base, il est possible de produire des courbes de niveau de pH, de température et d’activité qui sont basées directement sur des données expérimentales. La méthode a été testée pour plusieurs essais de glycoside hydrolase répandus ainsi que pour des substrats modèles et complexes.