collecte et traitement du sang
toutes les procédures impliquant la collecte de sang humain de volontaires sains étaient conformes au Comité D’éthique de la recherche humaine de L’Université de Sydney (approbation HREC 2014/244) et le consentement éclairé, Toutes les procédures impliquant la collecte de sang humain de patients ECMO étaient conformes à L’éthique de L’Hôpital Alfred, Comité permanent de la recherche sur les humains de L’Université Monash (approbation 388/13) et le consentement éclairé a été obtenu de toutes les personnes. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration D’Helsinki de 1983. Le sang a été prélevé par venesection à l’aide d’une aiguille butterfly Terumo de 21 g provenant de 10 donneurs sains sans médicaments (quatre hommes, six femmes, 22-58 ans)., Les 5 premiers mL de sang ont été jetés pour éviter toute thrombine qui pourrait avoir été générée autour du site d’insertion de l’aiguille, puis aspirés dans des tubes contenant du citrate de sodium à 3,2% v/V. Le sang de huit patients d’un seul Centre ayant bénéficié d’un soutien ECMO (quatre hommes, quatre femmes, 34-67 ans) a été prélevé dans des tubes ACD-A (BD Vacutainer)., Les Patients avec le soutien ECMO ont reçu des médicaments anticoagulants et/ou antiplaquettaires basés sur à la discrétion des cliniciens ou des directives institutionnelles où les patients ont généralement commencé à prendre de la warfarine, du ratio international normalisé cible (INR) 2-3, avec une perfusion d’héparine de transition et un traitement à l’aspirine, ainsi que du dipyridamole pour Le Plasma a été préparé par centrifugation deux fois à 800 × g pendant 20 min à température ambiante., À certaines occasions, le plasma du donneur sain a été cisaillé à des taux de 2000 s−1 ou 10000 s−1 pendant 5 min à température ambiante à l’aide d’un rhéomètre Kinexus pro+.
collection de fibrinogène hépatocytaire
la lignée cellulaire cancéreuse hépatique humaine HepG2 (ATCC, HB-8065) a été cultivée dans le DMEM, 10% de sérum de veau fœtal et de glutamax à 5% de CO2 et 37 °C. Les cellules à 80-90% de confluence ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate, incubées pendant 18 h dans le DMEM sans sérum à 5% de CO2 et 37 °C ou dans une chambre hypoxique à 1% D’O2, 5% CO2 et 37 °C., Le milieu conditionné a été collecté (1 mL par 4 × 106 cellules) et le fibrinogène sécrété a été immédiatement traité comme décrit ci-dessous.
essais de fibrinogène et de fibrine
Les échantillons de Plasma n’ont pas été traités ou incubés avec de la thrombine et / ou l’inhibiteur de polymérisation de la fibrine, le Gprp (Sigma). La fibrine a été préparée dans 1 mL de plasma par addition de 50 unités de thrombine bovine (Sigma) et de 10 mm CaCl2 et MgCl2 pendant 40 min à 22 °C. Les polymères de fibrine ont été collectés à l’aide d’une tige en plastique., Dans une expérience, le plasma (2 mL) a été incubé avec 27 unités/mL de thrombine et 10 mm de CaCl2 et de MgCl2 pendant 40 min à 22 °C, et le polymère de fibrine a été recueilli sur une tige en plastique et retiré. Le plasma appauvri a été incubé avec une autre aliquote de 27 unités/mL de thrombine et le nouveau polymère de fibrine a été recueilli et retiré. Une aliquote de plasma (0,2 mL) a été échantillonnée avant et après l’addition des deux lots de thrombine, 150 µM de d-phénylalanyl-prolyl-arginyl chlorométhylcétone (PPACK, Sigma) ont été ajoutés pour inhiber L’activité de la thrombine et les échantillons ont été incubés pendant 16 h à 22 °C., La teneur en fibrinogène des échantillons plasmatiques a été estimée en prélevant la protéine sur des billes polyclonales recouvertes d’anticorps anti-fibrinogène (voir la section suivante), en résolvant le fibrinogène sur la page SDS et en le colorant avec du Coomassie colloïdal. Dans une autre expérience, le plasma a été incubé avec 8 mM de GPRP (Sigma) pendant 5 min à 22 °C avant l’ajout de 50 unités/mL de thrombine pendant 60 min à 22 °C. La réaction a été éteinte avec 150 µM de PPACK pendant 10 min à 22 °C. des fibrinogènes purifiés ont été isolés du plasma frais congelé de donneurs sains par précipitation de β-alanine 32 ou obtenus commercialement (Sigma F4883).,
Quantification des États redox des liaisons fibrinogène et disulfure de fibrine
Les Dynabeads (2 mg, Life Technologies) ont été enrobées de 16 µg d’anticorps polyclonaux anti-fibrinogène (Dako, Cat A0080, Lot 00015063) dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate sur une roue rotative pendant 1 h à 22 °C et l’excès d’anticorps a été éliminé par lavage trois fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate. Le Plasma (0,7 mL) ou le milieu conditionné par HepG2 (4,5 mL) ont été incubés avec les 2 mg de billes enrobées sur une roue rotative pendant 1 h à 22 °C., Les billes ont été collectées à l’aide d’un aimant, l’excès de plasma aspiré pour réduire le volume, et incubées dans 0,3 mL de 12C-IPA de 5 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 10% de DMSO pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité pour alkyler les Cys thiols non appariés dans les protéines. Les surnageants ont été aspirés et les billes incubées avec un tampon D’échantillon NuPAGE LDS (Life Technologies) contenant un autre 12C-IPA de 5 mM pendant 30 min à 60 °C. les surnageants ont été résolus sur SDS-PAGE., Les polymères de fibrine générés dans le plasma ont été collectés sur une tige en plastique et immédiatement immergés dans 1 mL de 12C-IPA de 5 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 10% de DMSO pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité. La fibrine a été lavée 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate avant de dissoudre le polymère dans 1 mL d’acide acétique de 20 mM pendant 24 h à 22 °C. vingt microlitres de la solution ont été incubés avec un tampon échantillon NuPAGE LDS (Life Technologies) contenant 5 mM 12C-IPA pendant 30 min à 60 °C et les protéines résolues sur SDS-PAGE., Le fibrinogène purifié (12 µg) a été incubé avec 5 mM de 12C-IPA dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 10% de DMSO pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité et la protéine a été résolue sur SDS-PAGE.
Les gels SDS-PAGE ont été colorés avec du Coomassie colloïdal (Sigma) et les bandes de fibrine(ogen) excisées, dénoyautées, séchées, incubées avec du dithiothréitol de 40 mM et lavées14. Les tranches de gel ont été incubées avec 5 mm 13C-IPA (isotopes de Cambridge) pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité pour alkyler la liaison disulfure Cys, lavées et séchées avant la digestion des protéines avec 12.,5 ng / µL de trypsine (Promega) dans 25 mM de NH4CO2 pendant la nuit à 25 °C. des Peptides ont été élués des tranches avec 5% d’acide formique et 50% d’acétonitrile. La chromatographie Nano-liquide (nano-LC) a été réalisée à l’aide D’une CLHP Ultimate 3000 et D’un système d’échantillonnage automatique (Dionex). Les échantillons ont été injectés dans une colonne nano-LC sans fritte (75 µm x ~12 cm) contenant des milieux C18 (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) et chauffés à 45 °C pour toutes les séries. Les Peptides ont été élués en utilisant un gradient linéaire sur 52 min, à un débit de 0,2 µL / min. La phase Mobile A était composée de 0.,1% d’acide formique dans H2O, tandis que la phase mobile B était constituée d’acétonitrile: H2O (8:2) avec 0,1% d’acide formique. Le gradient était: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% b, 37,5 min 80% b, 39 min 2% B et 52 min 2% B. Une haute tension (2000 V) a été appliquée à un tee à faible volume (Upchurch Scientific) et l’extrémité de la colonne positionnée à ~0,5 cm du capillaire chauffé (T = 275 °C) d’un spectromètre de masse LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron). Des ions positifs ont été générés par ionisation par électrospray et le spectromètre de masse a fonctionné en mode d’acquisition dépendant des données., Des spectres MS de balayage complet ont été acquis (m/z 350-1750) par L’Orbitrap à une résolution de 30 000. Les 15 ions les plus abondants (>5000 comptes) avec des états de charge ≥ +2 ont été isolés séquentiellement et fragmentés dans le piège à ions linéaire en utilisant une dissociation induite par collision avec une activation q = 0,25 et un temps d’activation de 10 ms à une valeur cible de 30 000 ions. Les rapports M / z sélectionnés pour MS / MS ont été exclus dynamiquement pour 35 s. cible AGC Zoom Piège à ions: 3000.00. Piège à ions cible AGC complète: 30000.00. Piège à ions SIM AGC cible: 10000.00. Piège à ions MSn AGC cible: 10000.00., Les données ont été analysées à L’aide de Mascot Daemon (Version 2.5.0, Matrix Science) sur la base de données Swissprot. Les paramètres de recherche ont été la tolérance aux précurseurs de 6 ppm et les tolérances aux ions produits de ±0,6 Da, et le dérivé Iodoacétanilide (Cys), le dérivé Iodoacétanilide 13C (Cys), l’oxydation (Met) sélectionnés comme modifications variables avec un clivage tryptique complet de jusqu’à trois clivages manqués. Avec la liste des peptides contenant de la cystéine identifiés à L’aide de Mascot, leur rapport masse/charge monoisotopique (M/z) de +2, +3 et +4 est calculé à L’aide de MS-Product (Version v 6.2.2, Protein Prospector Tools)., Cys marqué avec 12C-IPA ou 13C-IPA a une masse de 133,05276 ou 139,07289, respectivement. Trente peptides contenant des Cys ont été analysés (tableaux supplémentaires 1 et 2). Les différentes formes redox des résidus Cys ont été quantifiées à partir de l’abondance relative d’ions de peptides marqués au 12C-IPA et/ou au 13C-IPA. Pour calculer l’abondance ionique des peptides, des chromatogrammes ioniques extraits ont été générés à L’aide de Xcalibur Qual Browser (v2.1.0; Thermo Scientific). La surface a été calculée à l’aide de la fonction de détection automatisée des pics intégrée au logiciel., Les données ont été systématiquement recherchées pour les peptides contenant des thiols Cys libres et ceux-ci n’ont pas été détectés, ce qui indique que l’alkylation des résidus Cys non appariés par 12C-IPA ou 13C-IPA était complète dans la protéine.
analyse des peptides liés au disulfure de fibrinogène
le plasma du donneur sain (0,7 mL) a été incubé avec des Dynabeads polyclonaux revêtus d’anticorps anti-fibrinogène sur une roue rotative pendant 1 h à 22 °C. Les billes ont été recueillies, l’excès de plasma aspiré et 0,3 mL de 12C-IPA de 5 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 10% de DMSO a été ajouté et incubé pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité., Ensuite, le surnageant a été aspiré, les perles incubées avec le tampon D’échantillon NuPAGE LDS pendant 30 min à 60 °C et les surnagants résolus sur SDS-PAGE. Les tranches de Gel contenant le fibrinogène ont été lavées et séchées avant digestion avec 12 ng/µL de trypsine (Promega) pendant 4 h à 37 °C. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant 5% (v/v) d’acide formique et des peptides élués des tranches de gel avec 5% d’acide formique et 50% (v/v) d’acétonitrile. Peptides en 0.,1% d’acide formique (volume final 12 µL) ont été résolus sur une colonne analytique en phase inverse C18 de 35 cm × 75 µm en utilisant un gradient d’acétonitrile de 2-35% sur 22 min à un débit de 300 nL/min (HPLC Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000) et analysés sur un spectromètre de masse LTQ Orbitrap Velos comme décrit ci-dessus. Les peptides liés au disulfure ont été recherchés contre la séquence de fibrinogène humain à l’aide D’un logiciel D’analyse Byonique (Version 3.9-7, Mesures protéiques) avec un taux de fausse découverte de 1%. Tous les peptides liés au disulfure ont été inspectés manuellement pour en vérifier la précision., La tolérance massique des précurseurs et la tolérance aux fragments ont été fixées à 10 ppm et 0,6 Da, respectivement. Les modifications variables ont été définies comme des Met oxydés, des Cys oxydés (mono, di et tri) et des Cys glutathionylés avec un clivage complet de la trypsine pouvant aller jusqu’à trois clivages manqués.
analyse de la fonctionnalité du fibrinogène
le fibrinogène purifié (0,2 mL de 10 mg / mL dans 50 mM D’Hepes, 0,14 m de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 5 mM 12C-IPA pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité pour alkyler les Cys thiols non appariés dans la protéine., L’IPA qui n’a pas réagi a été retiré à l’aide d’une colonne de dessalement de spin Zeba de 7 kDa MWCO (Thermo Fisher). Le fibrinogène ou fibrinogène-IPA (1,1 mg/mL dans des Hepes de 50 mM, 0,14 m de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité/mL de thrombine bovine (Sigma) pendant 5 h à 22 °C dans un volume total de 0,2 mL dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Les polymères de fibrine ont été granulés à 13 000 × g pendant 15 min et la concentration de fibrinogène restant dans le surnageant a été mesurée. La fonctionnalité est exprimée au % de fibrinogène consommé dans la formation de polymère de fibrine.,
formation de polymère de Fibrine mesurée par diffusion de la lumière
fibrinogène purifié ou fibrinogène-IPA (1 mg/mL dans 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité / mL de thrombine bovine (Sigma). L’augmentation de l’absorbance à 350 nm a été enregistrée toutes les 30 s pendant 15 min.
structure polymère de Fibrine mesurée par microscopie électronique à balayage (MEB)
le fibrinogène ou fibrinogène-IPA (1 mg/mL dans 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité / mL de thrombine bovine (Sigma) pendant 2 h à 22 °C dans un volume total de 0,2 mL., Les polymères de fibrine ont été rincés deux fois avec une solution saline tampon phosphate (PBS) de 0,1 M, fixés avec 2,5% de glutaraldéhyde dans le PBS pendant la nuit à 4 °c, post-fixés avec 1% D’OsO4 dans le PBS, déshydratés avec des séries graduées d’éthanol, et le point critique suivant séché avec un Leica EM CPD300. Les échantillons ont été recouverts d’or 15 nm (K550x, Emitech) et imagés avec un Microscope électronique à balayage à émission de champ Zeiss SigmaHD. Les micrographies SEM ont été enregistrées à une tension d’accélération de 5 kV et à une distance de travail de 5 mm. les diamètres des fibres ont été mesurés à L’aide D’ImageJ.,
essai de perméation Fibrine polymère
le fibrinogène ou fibrinogène-IPA (1 mg/mL dans 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité/mL de thrombine bovine (Sigma) pendant 2 h à 22 °C dans un volume total de 0,2 mL dans des colonnes de chromatographie le tampon HEPES et le flux (j) ont été calculés à partir du poids des gouttes qui ont percolé en 20 Min. , La constante de perméation (Darcy) 33 a été calculée à partir de la relation, Ks = Jaa/LP, où J est le flux (cm3/s), ƞ est la viscosité du tampon (0,01 poise à température ambiante), A est la section transversale du caillot (0,17 cm2), L est la longueur du caillot (1,1 cm) et P est la pression hydrostatique (1 018 218 dyne/cm2).
essai de compactage Fibrine polymère
le fibrinogène ou fibrinogène-IPA (1 mg/mL dans 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité / mL de thrombine bovine (Sigma) pendant 16 h à 22 °C dans un volume total de 0,5 mL dans 1.,Tubes de microcentrifugeuse de 5 mL préalablement revêtus de 10 mg/mL PEG-20000 séchés à l’eau et à l’air. Les polymères de fibrine ont été centrifugés à 13 000 × g pendant 5 à 2 400 s et le volume du fluide extrudé du polymère a été mesuré.
essai de fibrinolyse
le fibrinogène ou fibrinogène-IPA (1,8 mg/mL dans des Hepes de 50 mM, 0,14 m de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7,4) a été incubé avec 1 unité/mL de thrombine bovine (Sigma) pendant 2 h à 22 °C dans un volume total de 0,5 mL aliquote de plasmine (5 µl de 0.,59 µM) a été ajouté au centre des puits et les plaques incubées pendant 18 h à 37 °C dans un environnement humide. Les zones de lyse ont été déterminées à partir de la moyenne de deux diamètres mesurés à angle droit.
Quantification des États redox des liaisons disulfure α2-macroglobuline
Les 10 plasmas donneurs sains décrits ci-dessus pour l’analyse du fibrinogène ont été utilisés pour l’analyse de l’α2-macroglobuline en utilisant les mêmes procédures. Plasma (0.,7 mL) a été incubé avec un anticorps polyclonal anti-α2-macroglobuline (Dako, Cat Q0102, Lot 20068567) revêtu de Dynabeads (Life Technologies) sur une roue rotative pendant 1 h à 22 °C. Les billes ont été collectées, aspirées en excès de plasma et incubées dans 0,3 mL de 12C-IPA de 5 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 10% les protéines. Les surnageants ont été aspirés et les billes incubées avec un tampon D’échantillon NuPAGE LDS (Life Technologies) contenant un autre 12C-IPA de 5 mM pendant 30 min à 60 °C. les surnageants ont été résolus sur SDS-PAGE., Les gels SDS-PAGE ont été colorés avec du coomassie colloïdal (Sigma) et la bande α2-macroglobuline excisée, dénoyautée, séchée, incubée avec du dithiothréitol de 40 mM et lavée14. Les tranches de gel ont été incubées avec 5 mm de 13C-IPA (isotopes de Cambridge) pendant 1 h à 22 °C dans l’obscurité pour alkyler la liaison disulfure Cys, lavées et séchées avant la digestion des protéines avec 12,5 ng/µl de trypsine (Promega) dans 25 mM de NH4CO2 pendant une nuit à 25 °C. des Peptides ont été élués des tranches avec 5% d’acide formique et 50% d’acétonitrile., La chromatographie liquide, la spectrométrie de masse et l’analyse des données ont été effectuées comme décrit pour le fibrinogéne34. 17 peptides contenant des Cys ont été analysés (tableaux supplémentaires 2 et 4). Les différentes formes redox des résidus Cys ont été quantifiées à partir de l’abondance relative d’ions de peptides marqués au 12C-IPA et/ou au 13C-IPA.
résumé des rapports
de plus amples renseignements sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la Nature lié à cet article.