croissance et dynamique nutritive d’Ochromonas sp.,, souche BG-1
on pense que la Phagotrophie par des flagellés phototrophes confère des avantages écologiques significatifs aux algues qui présentent le comportement (Flynn et Mitra, 2009), mais il semble également y avoir des limitations (bien que largement non caractérisées) pour mener une nutrition mixte simultanément dans une seule cellule (Raven, 1997). Ces contraintes peuvent impliquer des coûts ou des compromis pour le maintien de machines cellulaires doubles (par rapport à des concurrents spécialisés), ou peut-être des discussions croisées entre les voies biochimiques anaboliques et cataboliques qui confondent la performance des deux activités simultanément., Malheureusement, il n’existe pratiquement aucune information quantitative sur les coûts et les avantages du comportement mixotrophe, ni sur le fait que les deux processus sont exécutés séquentiellement ou simultanément par ces espèces. Le partitionnement temporel peut être un mécanisme permettant de maintenir les deux capacités dans des cellules minuscules (bien que mettant un processus en attente à un moment donné)., Évaluer si les deux comportements se produisent simultanément, les avantages physiologiques spécifiques pour la nutrition hétérotrophe chez les algues mixotrophes et la réactivité de ce comportement aux variables abiotiques et biotiques sont des aspects de la nutrition mixotrophe qui ont été difficiles à établir en utilisant des approches et des méthodes traditionnelles.
nous avons étudié le chrysophyte mixotrophe Ochromonas sp., souche BG – 1 parce qu’elle peut être cultivée en culture axénique (sans bactéries) et qu’il a été précédemment rapporté qu’elle était un organisme principalement hétérotrophe qui n’atteint des taux de croissance élevés qu’en présence de bactéries (Sanders et al., 2001). La croissance en culture axénique a empêché de compliquer potentiellement les interactions biologiques et les flux élémentaires résultant des activités d’autres microorganismes vivants dans les cultures, permettant ainsi une comparaison entre les mesures NANOSIMS et les mesures IRMS en vrac et une meilleure compréhension des sources spécifiques de carbone et d’azote utilisées pour la croissance par l’algue.,
de plus, l’utilisation d’une seule source inorganique d’azote a simplifié notre conception expérimentale de sorte que les seules sources d’azote dans le milieu étaient l’ammonium ou le HKB. Les algues possèdent généralement des mécanismes pour l’absorption et l’assimilation de l’ammonium et du nitrate, mais les données transcriptomiques indiquent que certaines chrysophytes, y compris Ochromonas sp. souche BG-1, pourrait manquer la capacité génétique pour l’assimilation des nitrates (Terrado et al., 2015; Mensonge et coll., 2017)., De plus, le tampon MES n’a pas été ajouté au milieu dans nos expériences car cela aurait pu fournir une source alternative d’azote. Le MES pourrait également avoir constitué une source de carbone organique pour l’algue (Sanders et al., 2001), et son élimination a fait en sorte que les seules sources de carbone dans le milieu étaient soit le bicarbonate, soit le HKB. L’analyse transcriptomique des expériences réalisées de la même manière que celles présentées dans ce manuscrit montre que la machinerie photosynthétique D’Ochromonas sp. la souche BG – 1 est exprimée et régulée à la hausse en présence de lumière (Lie et al., 2017)., Cette approche simplifiée, combinée au marquage isotopique stable, nous a permis de déterminer quelles sources d’azote et de carbone ont été utilisées pour la croissance de l’algue.
Les taux de croissance significatifs d’Ochromonas dans la présente étude n’ont été atteints que lorsque le HKB était abondant comme proie (Figure 1a). La dynamique de Chl a dans la culture reflète également les taux de croissance élevés dus au pâturage sur HKB, car la concentration de CHL a cell−1 a diminué d’un ordre de grandeur au cours des 48 premières heures d’incubation pour les cultures cultivées à la lumière ainsi que dans l’obscurité continue (Figure 1d)., Ces changements dans la chlorophylle cellulaire pourraient être liés à une dilution de Chl a à l’intérieur des cellules en raison des taux de croissance élevés de l’algue (Hansen et al., 2000), de sorte que la réduction de Chl a cell−1 était une conséquence des taux de croissance rapide de l’algue et non une réduction directe du taux de biosynthèse de la chlorophylle. Néanmoins, il est également possible qu’il y ait eu une certaine régulation de la biosynthèse de la chlorophylle lorsque HKB étaient présents car l’analyse transcriptomique sur cette algue suggère une régulation à la hausse des gènes liés à la synthèse de la chlorophylle en présence de lumière lorsque HKB étaient épuisés (Lie et al., 2017)., Dans tous les cas, ces observations sont en accord avec des études antérieures sur Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) qui ont observé une capacité hétérotrophe bien développée, suggérant que la fixation du carbone et peut-être d’autres structures cellulaires et processus impliqués dans la photosynthèse sont réduits lors de la croissance mixotrophique, comme observé pour certaines autres algues (Wan et al., 2011).
l’ammonium dissous, ainsi que le phosphate, se sont accumulés dans les cultures D’Ochromonas au cours des 48 premières heures des expériences, lorsque le HKB a été activement brouté (Figure 2)., Ce résultat indique que l’excès d’azote et de phosphore du HKB brouté a été excrété par l’algue. Les calculs du bilan massique basés sur les variations de l’abondance des proies/algues et de leur teneur en azote cellulaire ont indiqué que jusqu’à 50% de l’azote contenu dans le HKB consommé était assimilé par l’algue, tandis qu’une quantité considérable de l’excès d’azote était libérée principalement sous forme d’ammonium pendant la période de pâturage bactérien actif (Figure 2)., Ces valeurs pour l’assimilation de l’azote (et l’excrétion) concordent avec l’efficacité d’assimilation des protistes hétérotrophes de taille similaire (Taylor, 1982; Caron et Goldman, 1990), ce qui concorde avec la conclusion selon laquelle Ochromonas se développait principalement en tant qu’hétérotrophe lorsque les proies étaient abondantes. De plus, des analyses transcriptomiques ont démontré que différents transporteurs d’ammonium sont exprimés par Ochromonas sp. la souche BG – 1 croît sur HKB par rapport à la croissance après que les bactéries aient été broutées à de très faibles abondances (Lie et al., 2017)., Il semble donc que les transporteurs pour l’exportation de l’ammonium hors de la cellule peuvent être différents de ceux utilisés pour l’absorption de l’ammonium, comme cela a été observé pour d’autres organismes (Shnaiderman et al., 2013).
fait intéressant, les concentrations d’ammonium, mais pas de phosphate, ont diminué dans le milieu une fois que le HKB avait été éliminé par pâturage (C’est-à-dire après 48 h; Figure 2) lorsque Ochromonas a été cultivé à la lumière., Ce résultat semble indiquer que l’algue absorbait activement l’ammonium (mais pas le phosphate) du milieu lorsque les bactéries n’étaient plus disponibles et que la photosynthèse était induite (Figure 1d). En revanche, l’ammonium et le phosphate dans les cultures cultivées dans l’obscurité ont continué à augmenter tout au long de l’expérience (lignes pointillées à la Figure 2). Aucune croissance nette significative de la population algale n’a eu lieu après l’épuisement des proies, même à la lumière, et l’explication de la dichotomie dans l’absorption de ces deux éléments n’est pas claire., Nous supposons que l’ammonium a été pris parce qu’il était spécifiquement nécessaire pour reconstruire la machinerie photosynthétique de la cellule.
L’apparition continue de phosphate dans le milieu de culture au cours de la dernière partie des expériences contraste avec les études de certaines autres espèces D’Ochromonas qui ont signalé une absorption de phosphate lorsque l’algue se développe de façon autotrophique (Rothhaupt, 1996)., Le manque d’absorption de phosphate par la souche BG-1 pourrait indiquer que cette Ochromonas était incapable d’absorption efficace de phosphate (ce qui pourrait aussi expliquer, en partie, la faible capacité de croissance phototrophe de cette souche), ou que le phosphore n’était pas nécessaire en quantités significatives pour la réorganisation cellulaire associée au changement de croissance phototrophe, et donc l’absorption n’était pas stimulée par le changement de phototrophie., Il est peu probable que les augmentations continues de la concentration de phosphate soient dues à la décomposition des composés organiques du phosphore dissous dans le milieu, car les cultures ne contenaient pas de bactéries vivantes.
déductions à partir d’expériences de sondage isotopique stable
l’analyse isotopique Stable (nanoSIMS et analyse élémentaire en vrac-IRMS) a révélé que les substrats inorganiques (13C-bicarbonate et 15N-ammonium) et le HKB marqué au 13C / 15N étaient assimilés par Ochromonas, contribuant à l’enrichissement cellulaire au 15N et au 13c après 48 h d’incubation (Figure 4)., Cependant, l’ampleur de l’enrichissement à partir de substrats inorganiques ou de HKB indique que, pendant la croissance mixotrophe, les principales sources de carbone et d’azote proviennent de la phagotrophie. Le bilan massique isotopique indique que 88 à 95% de l’azote et 84 à 99% du carbone proviennent du HKB lorsque Ochromonas croît mixotrophiquement à la lumière. Un enrichissement en 13C a été observé chez les algues cultivées à la lumière par rapport à l’obscurité (Expérience 1 vs expérience 3) lorsque le bicarbonate de 13C était disponible (Figure 4)., Cependant, la contribution calculée de la fixation photosynthétique du carbone n’était que de 1 à 10% du carbone assimilé à la biomasse. La plus grande efficacité de l’incorporation d’azote des proies observée à la lumière par rapport à l’obscurité continue (Figure 3; expériences 1, 2 vs expérience 3) suggère que la lumière a joué un rôle, quoique mineur, dans l’efficacité phagotrophe de l’algue., Par conséquent, malgré des réductions présumées de la machinerie photosynthétique d’Ochromonas poussant phagotrophiquement sur HKB (comme en témoignent les faibles quotas cellulaires de Chl a; Figure 1d), la lumière a eu un impact mineur et positif sur la nutrition des algues. Étant donné que la quantité de carbone fixée par la photosynthèse représentait une petite fraction de carbone assimilé par L’algue lors de sa croissance sur HKB, nous supposons que l’appareil photosynthétique pourrait fournir de l’énergie plutôt que du carbone pour le matériel cellulaire, comme cela a été émis pour Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
nos calculs du bilan massique isotopique comportent deux mises en garde. Premièrement, nous n’avons pas contrôlé l’évolution du pH au sein des cultures, ce qui aurait permis de mieux comprendre l’équilibre carbonaté qui aurait pu être affecté par la respiration et la fixation du carbone, et l’échange avec l’atmosphère. En tant que tel, notre estimation basée sur les expériences utilisant du carbone inorganique marqué pourrait avoir sous-estimé la quantité de carbone inorganique fixée par Ochromonas sp. BG-1 (1% selon le bilan massique isotopique)., Dans tous les cas, l’expérience utilisant du HKB marqué n’aurait pas dû être affectée par cette mise en garde, et l’estimation de 10% de carbone dérivé du substrat inorganique est probablement réaliste. Deuxièmement, Ochromonas est considéré comme un fixateur de carbone inefficace en raison de mécanismes de concentration de carbone manquants (Maberly et al. 2009) qui augmentent la concentration de CO2 par le transport du CO2 et / ou du bicarbonate vers L’enzyme RubisCO (Raven et al., 2008). D’autre part, l’analyse transcriptomique a montré que la machinerie photosynthétique de la souche BG – 1 est fonctionnelle (Lie et al.,, 2017), et nos expériences utilisant du bicarbonate marqué ont montré un enrichissement significatif de l’abondance fractionnaire de 13C dans Ochromonas (Figures 4 et 5); par conséquent, Ochromonas sp. la souche BG – 1 a une certaine capacité à utiliser du carbone inorganique, bien que de manière inefficace.
néanmoins, la forte activité hétérotrophe d’Ochromonas en croissance mixotrophique est susceptible d’augmenter le pool de CO2 intracellulaire ainsi que son flux. En règle générale, on considère que les protistes hétérotrophes assimilent 40% de la matière organique ingérée, alors qu’ils en libèrent 30% et en respirent encore 30% (Sleigh, 1989)., Sur cette base, la quantité totale de carbone libérée par Ochromonas sous forme de CO2 au cours de la croissance exponentielle pourrait être aussi élevée que le bicarbonate total ajouté au début de l’incubation, ce qui a des conséquences sur le bilan massique isotopique que nous avons présenté. Si nous supposons que le CO2 isotopiquement enrichi dérivé de la respiration de HKB est disponible aux mêmes niveaux que le carbone inorganique dissous, l’incubation réalisée avec Ochromonas et marquée HKB a indiqué que ~84% du carbone était dérivé du HKB., Jusqu’à 20% du carbone assimilé dérivé du HKB pourrait en fait correspondre au carbone initialement respiré puis fixé par Ochromonas. Si elle est correcte, la respiration dérivée de l’activité phagotrophique agirait comme un mécanisme de concentration de carbone pour cet Ochromonas. Alors que la principale source de carbone pour Ochromonas en croissance mixotrophique provient du HKB, une quantité non négligeable pourrait provenir de la respiration puis de la fixation du CO2 de la biomasse bactérienne.,
Ochromonas a déplacé son métabolisme vers l’autotrophie lorsqu’il a été incubé à la lumière, mais seulement après avoir épuisé le HKB dans les cultures (≈ 48 h de croissance). Ce changement a été reflété dans L’abondance fractionnée en vrac de L’IRMS 13C pour le traitement à L’aide de HKB marqué où une réduction a été observée entre 48 h et 145 h (expérience 2 à la Figure 5), indiquant l’incorporation de carbone non marqué dans la biomasse algale via des processus légers. Les Chrysophytes sont généralement considérées comme des fixateurs de carbone autotrophes pauvres en raison de mécanismes de concentration de carbone pauvres (Maberly et al., 2009)., Néanmoins, ces résultats indiquent qu’il y avait un niveau significatif d’assimilation du carbone inorganique. Une comparaison des cultures cultivées à la lumière (Expérience 1 à la Figure 5) et à l’obscurité continue (expérience 3 à la Figure 5) a révélé que l’abondance fractionnée de 15N des cultures sombres ne changeait pas après 95 h tandis que les cultures à la lumière continuaient à s’enrichir en 15N, ce qui indique que les Ochromonas continuaient à assimiler l’azote pour maintenir son métabolisme une fois le HKB épuisé., Ces résultats concordaient avec les diminutions observées de la concentration d’ammonium dans le milieu pendant cette période (Figure 3a), bien que l’apparition continue de phosphate dans le milieu pendant cette période soit inexpliquée.
Nous avons obtenu un bon accord global entre les mesures isotopiques en vrac et les mesures nanoSIMS pour l’azote, en accord avec les observations des études précédentes (Popa et al., 2007; Orphelin et de la House, 2009; Kopf et coll., 2015; la Figure 4c)., Cependant, les mesures en vrac étaient un peu plus faibles en termes de valeurs d’abondance fractionnaire pour le carbone, en particulier pour les échantillons hautement enrichis (Figure 4d). Nous supposons que les différences entre les nanoSIMS et les mesures isotopiques en vrac pour le carbone peuvent être liées au fait que les échantillons de nanoSIMS ont été conservés avec du glutaraldéhyde, alors que les échantillons pour l’analyse en vrac ne l’étaient pas. Il a été démontré que la Fixation influence le carbone cellulaire (Musat et al., 2014), bien que nous nous attendions à ce que cela dilue le 13c dans les mesures nanoSIMS par rapport aux valeurs globales., Une explication plus probable est que les mesures unicellulaires ne sont pas influencées par les débris cellulaires dans la culture qui peuvent être moins enrichis. La valeur en vrac de 13C peut être diluée par ces composants par rapport aux mesures de nanoSIMS, ce qui implique que les données de nanoSIMS peuvent refléter plus précisément l’absorption de carbone et d’azote par les algues. Cependant, la variabilité de cellule à cellule peut également avoir contribué aux différences mineures entre les mesures en vrac et nanoSIMS.,
l’utilisation de nanoSIMS dans cette étude représente sa première application à l’étude des flux de carbone et de nutriments dans une algue mixotrophe, et a permis une meilleure compréhension de l’acquisition de carbone et d’énergie par cette espèce, et du métabolisme cellulaire. Nos résultats élargissent les informations disponibles à partir des analyses traditionnelles d’Ochromonas sp. souche BG – 1 cultivée dans diverses conditions de lumière et de disponibilité des proies (Sanders et al., 2001), confirmant que la majeure partie de l’azote et du carbone utilisés pour la croissance sont obtenus par ses proies bactériennes., Bien que les résultats ne puissent pas être directement extrapolés à toutes les espèces le long du continuum d’algues avec différentes stratégies mixotrophes, nos travaux valident l’utilisation d’expériences de sondage d’isotopes stables et de nanoSIMS pour mieux comprendre les fondements métaboliques de la mixotrophie chez une espèce. De plus, il fournit une approche pour évaluer la nutrition mixotrophe dans des échantillons environnementaux. Ochromonas sp. la souche BG – 1 a fourni un système modèle idéal pour comparer l’analyse isotopique en vrac aux nanoSIMS, car les bactéries ont été rapidement éliminées par pâturage dans les 48 premières heures des expériences., L’accord entre ces deux mesures démontre que les nanoSIMS ont capturé avec précision la dynamique de l’acquisition du carbone et des nutriments dans ce mixotrophe, et pourraient donc être appliquées plus largement pour explorer la mixotrophie dans des communautés mixtes complexes où les mesures en masse seraient insuffisantes pour capturer ces dynamiques. Cette étude et les futures études détaillées continueront d’apporter des améliorations dans notre compréhension de la nutrition des algues mixotrophes.