Blutentnahme und-verarbeitung
Alle Verfahren, bei denen menschliches Blut von gesunden Freiwilligen entnommen wurde, waren in Übereinstimmung mit der Ethikkommission für Humanforschung der Universität Sydney (Genehmigung HREC 2014/244) und die informierte Zustimmung wurde von allen Personen eingeholt., Alle Verfahren zur Entnahme von menschlichem Blut von ECMO-Patienten entsprachen der Alfred Hospital Ethics, Monash University Standing Committee for Research in Humans (Genehmigung 388/13) und die Einwilligung nach Aufklärung wurde von allen Personen eingeholt. Alle Verfahren entsprachen der Helsinki-Erklärung von 1983. Blut wurde durch Venesektion mit einer 21 g Butterfly Terumo-Nadel von 10 gesunden Spendern ohne Medikamente (vier Männer, sechs Frauen, 22-58 Jahre alt) entnommen., Die ersten 5 ml Blut wurden verworfen, um Thrombin zu vermeiden, das möglicherweise um die Nadeleinführungsstelle herum erzeugt und dann in Röhrchen mit 3,2% v/v Natriumcitrat gezogen wurde. Blut von acht Patienten in einem einzigen Zentrum, die ECMO-Unterstützung hatten (vier Männer, vier Frauen, 34-67 Jahre alt), wurde in ACD-A-Röhrchen (BD Vacutainer) gezogen., Patienten mit ECMO-Unterstützung erhielten Antikoagulations-und / oder thrombozytenaggregationshemmende Medikamente nach Ermessen der Kliniker oder nach institutionellen Richtlinien, bei denen Patienten typischerweise mit Warfarin, Target International Normalized Ratio (INR) 2-3, mit überbrückender Heparin-Infusion und Aspirin-Therapie sowie Dipyridamol für diejenigen, die als hohes Thromboserisiko gelten. Plasma wurde durch doppelte Zentrifugation bei 800 × g für 20 min bei Raumtemperatur hergestellt., Bei einigen Gelegenheiten wurde gesundes Spenderplasma mit Raten von 2000 s−1 oder 10000 s−1 für 5 min bei Raumtemperatur mit einem Kinexus pro+ Rheometer geschert.
Hepatozytenfibrinogensammlung
Die humane Leberkrebszelllinie HepG2 (ATCC, HB-8065) wurde in DMEM, 10% fetalem Kalbsserum und Glutamax bei 5% CO2 und 37 ° C kultiviert. Zellen bei 80-90% Zusammenfluss wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, 18 h in DMEM ohne Serum bei 5% CO2 und 37 °C oder in einer hypoxischen Kammer bei 1% O2, 5% CO2 und 37 °C inkubiert., Das konditionierte Medium wurde gesammelt (1 ml pro 4 × 106 Zellen) und das sezernierte Fibrinogen sofort wie unten beschrieben verarbeitet.
Fibrinogen-und Fibrinassays
Plasmaproben wurden unbehandelt oder inkubiert mit Thrombin und/oder dem Fibrinpolymerisationsinhibitor GPRP (Sigma). Fibrin wurde in 1 ml Plasma unter Zugabe von 50 Einheiten Rinderthrombin (Sigma) und 10 mM CaCl2 und MgCl2 für 40 min bei 22 °C hergestellt., In einem Experiment wurde Plasma (2 ml) mit 27 Einheiten/ml Thrombin und 10 mM CaCl2 und MgCl2 für 40 min bei 22 °C inkubiert und das Fibrinpolymer auf einem Kunststoffstab gesammelt und entfernt. Das aufgebrauchte Plasma wurde mit einem weiteren Aliquot von 27 Einheiten/ml Thrombin inkubiert und das neue Fibrinpolymer gesammelt und entfernt. Ein Aliquot von Plasma (0,2 ml) wurde vor und nach Zugabe beider Chargen Thrombin, 150 µM d-Phenylalanyl-Prolyl-Arginylchlormethylketon (PPACK, Sigma) zur Hemmung der Thrombinaktivität entnommen und die Proben für 16 h bei 22 °C inkubiert., Der Fibrinogengehalt der Plasmaproben wurde geschätzt, indem das Protein auf polyklonalen Antifibrinogen-antikörperbeschichteten Perlen gesammelt wurde (siehe folgenden Abschnitt), das Fibrinogen auf SDS-SEITE aufgelöst und mit kolloidaler Coomassie gefärbt wurde. In einem anderen Experiment wurde Plasma mit 8 mM GPRP (Sigma) für 5 min bei 22 °C inkubiert, bevor 50 Einheiten/ml Thrombin für 60 min bei 22 °C hinzugefügt wurden.Die Reaktion wurde mit 150 µM PPACK für 10 min bei 22 °C abgeschreckt. Gereinigte Fibrinogene wurden aus gesundem, frisch gefrorenem Spenderplasma durch β-Alanin-Fällung32 isoliert oder kommerziell erhalten (Sigma F4883).,
Quantifizierung der Redoxzustände von Fibrinogen-und Fibrindisulfidbindungen
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) wurden mit 16 µg polyklonalen Antifibrinogen-Antikörpern (Dako, Cat A0080, Lot 00015063) in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 22 °C beschichtet und der überschüssige Antikörper durch dreimaliges Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt. Plasma (0,7 ml) oder HepG2-konditioniertes Medium (4,5 ml) wurde mit den 2 mg beschichteten Kügelchen auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 22 °C inkubiert., Die Perlen wurden unter Verwendung eines Magneten gesammelt, überschüssiges Plasma abgesaugt, um das Volumen zu reduzieren, und in 0,3 ml 5 mM 12C-IPA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung inkubiert, die 10% DMSO für 1 h bei 22 °C im Dunkeln enthielt, um ungepaarte Cys-Thiole in den Proteinen zu alkylieren. Die Überstände wurden abgesaugt und die Beads mit NuPAGE LDS Sample Buffer (Life Technologies) inkubiert, der weitere 5 mM 12C-IPA für 30 min bei 60 °C enthielt., Im Plasma erzeugte Fibrinpolymere wurden auf einem Kunststoffstab gesammelt und sofort in 1 ml 5 mM 12C-IPA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO für 1 h bei 22 °C im Dunkeln eingetaucht. Das Fibrin wurde 3 mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, bevor das Polymer in 1 ml 20 mM Essigsäure für 24 h bei 22 °C gelöst wurde. Zwanzig Mikroliter der Lösung wurden mit NuPAGE LDS-Probenpuffer (Life Technologies) mit 5 mM 12C-IPA für 30 min bei 60 °C inkubiert und die Proteine auf SDS-SEITE aufgelöst., Gereinigtes Fibrinogen (12 µg) wurde mit 5 mM 12C-IPA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO für 1 h bei 22 °C im Dunkeln inkubiert und das Protein auf SDS-PAGE aufgelöst.
Die SDS-PAGE-Gele wurden mit kolloidaler Coomassie (Sigma) gefärbt und die Fibrin(ogen) – Bänder ausgeschnitten, entfärbt, getrocknet, mit 40 mm Dithiothreitol inkubiert und gewaschen 14. Die Gelscheiben wurden mit 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotope) für 1 h bei 22 °C im Dunkeln inkubiert, um die Disulfidbindung Cys zu alkylieren, gewaschen und vor dem Verdauung von Proteinen mit 12 getrocknet.,5 ng / µL Trypsin (Promega) in 25 mM NH4CO2 über Nacht bei 25 °C. Peptide wurden mit 5% Ameisensäure, 50% Acetonitril aus den Scheiben eluiert. Die Nano-Flüssigchromatographie (Nano-LC) wurde mit einem Ultimate 3000 HPLC-und Autosampler-System (Dionex) durchgeführt. Die Proben wurden in eine fritlose Nano-LC-Säule (75 µm x ~12 cm) mit C18-Medien (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) injiziert und für alle Auflagen auf 45 °C erhitzt. Peptide wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten über 52 min mit einer Flussrate von 0,2 µL/min eluiert. Die Mobile phase Bestand aus 0.,1% Ameisensäure in H2O, während die Phase B aus Acetonitril:H2O (8:2) mit 0,1% Ameisensäure bestand. Der Gradient betrug: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37,5 min 80% B, 39 min 2% B und 52 min 2% B. Hochspannung (2000 V) wurde an ein niedervolumiges T-Stück (bis 2000 V) angelegt und die Säulenspitze ~0,5 cm von der erhitzten Kapillare (T = 275 °C) eines LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) Massenspektrometers entfernt. Positive Ionen wurden durch Elektrospray-Ionisation erzeugt und das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus betrieben., Vollständige Scan-MS-Spektren wurden von der Orbitrap mit einer Auflösung von 30.000 (m/z 350-1750) erfasst. Die 15 am häufigsten vorkommenden Ionen (>5000 counts) mit Ladungszuständen ≥ +2 wurden sequentiell isoliert und fragmentiert innerhalb der linearen Ionenfalle mittels kollisional induzierter Dissoziation mit einer Aktivierung q = 0,25 und Aktivierungszeit von 10 ms bei einem Zielwert von 30.000 Ionen. M/z-Verhältnisse, die für MS / MS ausgewählt wurden, wurden für 35 s dynamisch ausgeschlossen. Ionenfalle Zoom AGC Ziel: 3000.00. Ionen Falle Volle AGC Ziel: 30000.00. Ionenfalle SIM AGC Ziel: 10000.00. Ionenfalle MSn AGC Ziel: 10000.00., Die Daten wurden mit Mascot Daemon (Version 2.5.0, Matrix Science) gegen Swissprot Datenbank analysiert. Suchparameter wurden Vorläufertoleranz von 6 ppm und Produktionentoleranzen von ±0,6 Da und Iodoacetanilidderivat (Cys), Iodoacetanilid 13C-Derivat (Cys), Oxidation (Met) als variable Modifikationen mit vollständiger tryptischer Spaltung von bis zu drei verpassten Spaltungen ausgewählt. Mit der Liste der cysteinhaltigen Peptide, die mit Mascot identifiziert wurden, wird ihr monoisotopes Masse/Ladungsverhältnis (m/z) von +2, +3 und +4 unter Verwendung von MS-Product (Version v 6.2.2, Protein Prospector Tools) berechnet., Mit 12C-IPA oder 13C-IPA gekennzeichnetes Cys hat eine Masse von 133.05276 bzw. Dreißig Cys-haltige Peptide wurden analysiert (Ergänzende Tabellen 1 und 2). Die verschiedenen Redoxformen der Cys-Rückstände wurden aus der relativen Ionenfülle von mit 12C-IPA und/oder 13C-IPA markierten Peptiden quantifiziert. Um die Ionenfülle von Peptiden zu berechnen, wurden extrahierte Ionenchromatogramme mit XCalibur Qual Browser (v2.1.0; Thermo Scientific) erzeugt. Die Fläche wurde mithilfe der in die Software integrierten automatischen Spitzenerkennungsfunktion berechnet., Die Daten wurden routinemäßig nach Peptiden gesucht, die freie Cys-Thiole enthielten, und diese wurden nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Alkylierung ungepaarter Cys-Reste durch 12C-IPA oder 13C-IPA im Protein vollständig war.
Fibrinogendisulfid-verknüpfte Peptidanalyse
Gesundes Spenderplasma (0,7 ml) wurde mit polyklonalen Antifibrinogen-Antikörper-beschichteten Dynabeads auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 22 °C inkubiert.Die Perlen wurden gesammelt, überschüssiges Plasma aspiriert und 0,3 ml 5 mM 12C-IPA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO wurden zugegeben und für 1 h bei 22 °C im Dunkeln inkubiert., Dann wurde der Überstand abgesaugt, die Perlen mit NuPAGE LDS Probenpuffer für 30 min bei 60 °C inkubiert und die Überstände auf SDS-SEITE aufgelöst. Gelscheiben, die das Fibrinogen enthielten, wurden vor der Verdauung mit 12 ng/µL Trypsin (Promega) für 4 h bei 37 °C gewaschen und getrocknet.Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5% (v/v) Ameisensäure und Peptiden, die mit 5% Ameisensäure und 50% (v/v) Acetonitril aus den Gelscheiben eluiert wurden, gestoppt. Peptide in 0.,1% Ameisensäure (Endvolumen 12 µL) wurden auf einer 35 cm × 75 µm C18 Reverse Phase Analysesäule unter Verwendung eines 2-35% Acetonitrilgradienten über 22 min bei einer Durchflussrate von 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) aufgelöst und wie oben beschrieben auf einem LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer analysiert. Disulfid-verknüpfte Peptide wurden mit Hilfe der Byonic-Analyse-Software (Version 3.9-7, Proteinmetriken) mit einer falschen Entdeckungsrate von 1% gegen die menschliche Fibrinogensequenz durchsucht. Alle disulfidgebundenen Peptide wurden manuell auf Genauigkeit geprüft., Vorläufermassentoleranz und Fragmenttoleranz wurden auf 10 ppm bzw. Variable Modifikationen wurden definiert als oxidierte Met, oxidierte Cys (Mono, di und tri) und glutathionylierte Cys mit vollständiger Trypsinspaltung von bis zu drei verpassten Spaltungen.
Fibrinogenfunktionalitätstest
Gereinigtes Fibrinogen (0,2 ml von 10 mg / ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 5 mm 12C-IPA für 1 h bei 22 °C im Dunkeln zu Alkylat ungepaarten Cys-Thiolen im Protein inkubiert., Die nicht realisierte IPA wurde mit einer 7 kDa MWCO Zeba Spin-Entsalzungssäule (Thermo Fisher) entfernt. Fibrinogen oder fibrinogen-IPA (1,1 mg/mL in 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) inkubiert wurde mit 1 Einheit/mL bovinem thrombin (Sigma) für 5 h bei 22 °C in einem Volumen von 0,2 mL in ein 1,5 mL mikrozentrifuge Rohre. Die Fibrinpolymere wurden bei 13.000 × g für 15 min pelletiert und die Konzentration des im Überstand verbleibenden Fibrinogens gemessen. Die Funktionalität wird in % des Fibrinogens ausgedrückt, das bei der Fibrinpolymerbildung verbraucht wird.,
Fibrinpolymerbildung gemessen durch Lichtstreuung
Gereinigtes Fibrinogen oder Fibrinogen-IPA (1 mg/ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 1 Einheit/ml Rinderthrombin (Sigma) inkubiert. Die Erhöhung der Absorption bei 350 nm wurde alle 30 s für 15 min aufgezeichnet.
Fibrinpolymerstruktur gemessen durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Fibrinogen oder Fibrinogen-IPA (1 mg/ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 1 Einheit/ml Rinderthrombin (Sigma) für 2 h bei 22 °C in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml inkubiert., Die Fibrinpolymere wurden zweimal mit 0,1 M Phosphatpuffersalzlösung (PBS) gespült, mit 2,5% Glutaraldehyd in PBS über Nacht bei 4 °C fixiert, mit 1% OsO4 in PBS postfixiert, mit abgestufter Reihe von Ethanol dehydriert und der nächste kritische Punkt mit einem Leica EM CPD300 getrocknet. Die Proben wurden mit 15 nm Gold (K550X, Emitech) überzogen und mit einem Zeiss SigmaHD Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop abgebildet. Die SEM-Mikrographen wurden mit 5 kV Beschleunigungsspannung und einem Arbeitsabstand von 5 mm aufgenommen. Faserdurchmesser wurden mit ImageJ gemessen.,
Fibrinpolymerpermeationstest
Fibrinogen oder Fibrinogen-IPA (1 mg/ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 1 Einheit/ml Rinderthrombin (Sigma) für 2 h bei 22 °C in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml in Polypropylen-Chromatographiesäulen mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm inkubiert. das versickerte in 20 min., Die Permeationskonstante (Darcy) wurde aus der Beziehung Ks = JƞA/LP berechnet, wobei J der Fluss (cm3 / s), ƞ die Viskosität des Puffers (0,01 Poise bei Raumtemperatur), A der Querschnitt des Gerinnsels (0,17 cm2), L die Länge des Gerinnsels (1,1 cm) und P der hydrostatische Druck (1,018,218 Dyne/cm2) ist.
Fibrinpolymerverdichtungstest
Fibrinogen oder Fibrinogen-IPA (1 mg/ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 1 Einheit/ml Rinderthrombin (Sigma) für 16 h bei 22 °C in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml in 1 inkubiert.,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die zuvor mit 10 mg/ml PEG-20000 in Wasser beschichtet und an der Luft getrocknet wurden. Die Fibrinpolymere wurden bei 13.000 × g für 5 bis 2400 s zentrifugiert und das Volumen der aus dem Polymer extrudierten Flüssigkeit gemessen.
Fibrinolyse-Assay
Fibrinogen oder Fibrinogen-IPA (1,8 mg/ml in 50 mm Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) wurde mit 1 Einheit/ml Rinderthrombin (Sigma) für 2 h bei 22 °C in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml in 24-Well-Platten (15,6 mm Durchmesser) für 2 h bei 22 °C inkubiert.,59 µM) in die Mitte der Vertiefungen gegeben und die Platten 18 h bei 37 °C in feuchter Umgebung inkubiert. Die Lysebereiche wurden aus dem Durchschnitt von zwei rechtwinklig gemessenen Durchmessern ermittelt.
Quantifizierung der Redoxzustände von α2-Makroglobulindisulfidbindungen
Die oben beschriebenen 10 gesunden Spenderplasmen zur Analyse von Fibrinogen wurden zur Analyse von α2-Makroglobulin nach den gleichen Verfahren verwendet. Plasma – (0.,7 ml) wurde mit polyklonalem Anti-α2-Makroglobulin-Antikörper (Dako, Cat Q0102, Lot 20068567)-beschichteten Dynabeads (Life Technologies) auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 22 °C inkubiert.Die Kügelchen wurden gesammelt, überschüssiges Plasma abgesaugt und in 0,3 ml 5 mM 12C-IPA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO für 1 h bei 22 °C im Dunkeln inkubiert, um ungepaarte Cys-Thiole in den Proteinen zu alkylieren. Die Überstände wurden abgesaugt und die Beads mit NuPAGE LDS Sample Buffer (Life Technologies) inkubiert, der weitere 5 mM 12C-IPA für 30 min bei 60 °C enthielt., Die SDS-PAGE-Gele wurden mit kolloidaler Coomassie (Sigma) gefärbt und das α2-Makroglobulin-Band mit 40 mm Dithiothreitol ausgeschnitten, entfärbt, getrocknet, inkubiert und gewaschen. Die Gelscheiben wurden mit 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotope) für 1 h bei 22 °C im Dunkeln inkubiert, um die Disulfidbindung Cys zu alkylieren, gewaschen und getrocknet, bevor Proteine mit 12,5 ng/µl Trypsin (Promega) in 25 mM NH4CO2 über Nacht bei 25 °C verdaut wurden., Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie und Datenanalyse wurden wie für Fibrinogen34 beschrieben durchgeführt. 17 Cys-haltige Peptide wurden analysiert (Ergänzende Tabellen 2 und 4). Die verschiedenen Redoxformen der Cys-Rückstände wurden aus der relativen Ionenfülle von mit 12C-IPA und/oder 13C-IPA markierten Peptiden quantifiziert.
Berichtszusammenfassung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verknüpften Nature Research Reporting Summary.