Luominen ääriviivat juoni suoraa kokeellista tietoa edellyttää mahdollista suurikapasiteettisten menetelmä ja huomattava määrä näytteitä. Määrityksen on siksi oltava sopiva käytettäväksi 96-kaivolevyn suunnittelussa., Yleiset edut tämä miniatyrisointi yhden reaktion putket 96-kuoppalevyillä on jo osoitettu DNSA ja muut kolorimetrisiä määrityksiä . Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt määritykset soveltuivat 96-kaivolevyformaattiin. Varjostimen tuottamiseksi entsyymi-ja substraattiseoksia inkuboitiin kahdeksalla eri pH-tasolla. Näitä kahdeksaa pH-tasoa inkuboitiin 12 eri lämpötilassa käyttäen gradientti PCR-sykleriä, mikä johti 96 ainutlaatuiseen reaktioon. Tietojen hankkimiseen käytettiin levylukijaa., Tulokset muutettiin suhteellisiksi toiminnoiksi, joissa kunkin levyn korkein aktiivisuus asetettiin 100 prosenttiin. Mittaus suoritettiin kolme kertaa ja keskimäärin arvot olivat myöhemmin muuntaa ääriviivat juoni käyttäen SigmaPlot, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät-osiossa. Toiminta (z-akseli) on edustettuna väri violetti punainen sijaan normaali akseli parantaa näkymä ääriviivat juoni.,
Puskuri järjestelmä
Yksi edellytys luotettava määrittäminen pH-ja lämpötila-optima on vakaa puskuri-järjestelmä, joka sopii koskevat entsyymin toimintaa ja lähes kestävät pH-muutos lämpötilan kasvaessa. Vaihtoehtoisesti tätä vaikutusta voidaan tarkastella ääriviivat juoni. Alaisena lämpötilan pKa puskurit ja siten pH on tosiasia, joka olisi otettava huomioon, erityisesti emäksinen puskureita, kuten Tris ., Määrityksen vaatimuksena sitraatti-fosfaattipuskurijärjestelmämme kaikki pH-vaihtelut testattiin pH: n muuttamiseksi välillä 35 °C-80 °C (KS.lisätiedosto 4). Kaikissa puskureissa pH-arvo laskee hieman lämpötilan noustessa, ja korkeampien pH-arvojen Puskurit osoittavat suurempia poikkeamia. Lämpötilan riippuvuus kasvaa määrä fosfaatti, joka korreloi lämpötilan kertoimet fosfaatti (− 0.0028) ja sitraatti (0)., Koska lämpötila-riippuvainen pH: n vaihtelut kaikki puskurit olivat vain vähäisiä, ne voitaisiin jättää huomiotta-kooste ääriviivat tonttien arvojen rajoissa käyttää täällä. Kuitenkin, jos toinen puskuri järjestelmä, jossa on korkeampi lämpötila kerrointa pitäisi käyttää, se on helposti mahdollista sopeutua ääriviivat tontin muutos pH määrittämällä kunkin puskuri yksittäisen pH kussakin lämpötilassa., Nämä arvot ovat joko kokeellisesti määritetty kuvattu kunkin materiaalit ja menetelmä-osa tai johdettu lämpötila kertoimet ja voi sitten vastaavasti voidaan mukauttaa x-akselin (pH) edellyttäen, Sigmaplot-tiedoston avaamiseen.
Toiminta-alue määrittäminen on Cel8A
yleiskatsaus eri entsyymien substraatteja, ja määrityksissä käytetään tässä tutkimuksessa luomiseen kunkin ääriviivat tontteja on esitetty Taulukossa 1.,
Cel8A on sellulaasi, erityisesti endo-glukanaasi, alkaen C. thermocellum ja oli ensimmäinen entsyymi glykosidiannoksen hydrolaasi perhe 8 kanssa ratkaista crystal rakenne . Tässä tutkimuksessa entsyymiä inkuboitiin BBG: n kanssa validoimaan ehdotettu menetelmä DNSA-määrityksellä. Cel8A: n lämpötilan on raportoitu olevan optimaalinen 75 °C: ssa ja pH optimaalinen 5,5-6,5: ssä ., Nämä arvot ovat sopusoinnussa tulokset meidän ääriviivat juoni, koska ne ovat alueella > 90% aktiivisuus (Fig. 1). Meidän contour juoni kuitenkin osoittaa, että entsyymi on erittäin aktiivinen monenlaisia eri olosuhteissa. Entsyymi ei näytteille hyväksyttävää toimintaa alemmilla pH-arvoilla, kun välillä 60 °C ja 65 °C ja suorittaa myös enemmän kuin 60 prosenttia sen suurin aktiivisuus kun pH on alle 4,5. Menetelmämme tarjoaa keinon visualisoida tällaisia vaikutuksia ja arvioida entsyymin suorituskykyä milloin tahansa testattujen parametrien sisällä yhdellä silmäyksellä.,
Ääriviivat juoni Cel8A käyttää DNSA assay ohra-β-glukaania kuin alustan
testata, onko menetelmä soveltuu eri hydrolaasi määritysmenetelmät, tuotimme ääriviivat juoni käyttäen Cel8A kanssa Atso-CM-selluloosaa substraattina ja niiden määritys (Fig. 2). Kuviossa on samanlainen optima 75 °C: ssa ja pH 5,5: ssä. Atso-CM-selluloosan käyttö substraattina johti kuitenkin hieman pienempään aktiivisuusalueeseen., Pieniä eroja kaksi määrityksissä voi olla, koska erilaisia rakenteita ja sidos tyypit sekä alustoille, mikä eroaa heidän sitovia ominaisuuksia entsyymi. Atso-CM-selluloosa on ei-luonnollinen substraatti, johon on lisätty väriaineryhmiä, mikä voisi lisätä tätä vaikutusta entisestään. Käyttämällä Cel8A, voisimme osoittaa, että menetelmä antaa luotettavia tietoja ja soveltuu käytettäväksi kahdessa eri perustettu määritykset hydrolaasien: DNSA ja Atso-CM-selluloosaa.
Ääriviivat juoni Cel8A käyttäen Atso-CM-selluloosaa
Toiminta-alue määrittäminen on Celluclast®
lisäksi yhden entsyymin, entsyymiä, seos oli tutkittu. Celluclast® on laajalti käytetty kaupallinen sellulaasi tuote, joka on johdettu Trichoderma reesei. Se koostuu enimmäkseen sellobiohydrolaaseista ja endo-1,4-β-glukanaaseista, mutta sisältää myös ksylanaaseja ja ainakin yhden β-ksylosidaasin . Tuotekäsikirjassa todetaan, että optimaalinen toiminta on välillä 50 °C-60 °C ja pH 4.,5 ja 6.0 . Tässä työssä, meidän on ensin tuotettu ääriviivat juoni Celluclast® BBG alustana käyttäen DNSA menetelmä (Kuva. 3). BBG-ääriviivakäyrä varmistettiin normaalilla lämpötilakäyrällä (Kuva. 4). Tulokset lämpötila käyrä pH 5.5 mukaisesti, tulokset ääriviivat juoni, näytetään sama valikoima toimintaa. Erillisten käyrien mittaaminen ei kuitenkaan riitä kuvaamaan CELLUCLAST®: n aktiivisuutta BBG: ssä. PH-alue, jossa entsyymiseoksella on suuri aktiivisuus, on voimakkaasti lämpötilariippuvainen., Mitä korkeampi lämpötila, sitä alhaisempi pH on saavuttaa korkea aktiivisuus. Noin 45 °C, Celluclast® on erittäin aktiivinen (> 60%), jopa pH-arvo on 6,5, kun taas 65 °C, se on erittäin aktiivinen vain, jopa pH: ssa 5.0. Aktiivisuuden kuvaaminen kahdella erillisellä käyrällä riippuu siis tiukasti staattiseksi parametriksi valitusta arvosta. Lämpötila kaavioita, esimerkiksi, ne otetaan kahden ääripään totesi pH-alueella (4.5 ja 6.0) pitäisi antaa huomattavasti erilaisia tuloksia. Sama pätee eri lämpötiloissa otettuihin pH-kuvaajiin., Jotta tämä vaikutus olisi ilmeinen, tuotimme vakiomuotoisia pH-käyriä 45 °C: ssa, 55 °C: ssa ja 65 °C: ssa (Kuva. 5). Nämä kolme pH-käyrää osoittavat, että lämpötilan noustessa suuren aktiivisuuden pH-raja siirtyy happamampiin pH-arvoihin. Nämä kolme käyrää vahvistavat siten contour-piirteen tulokset. Lisäksi ne osoittavat rajoitukset perinteisen erillisen toiminnan määritys, joka ainakin Celluclast® on, jos pH-käyrät, riippuvainen valitun lämpötilan., Contour-havaintomenetelmämme käyttö kiertää tämän ongelman täysin mittaamalla lämpötilan ja pH: n vaikutuksen yhdessä vaiheessa.
Ääriviivat juoni Celluclast® käyttää DNSA assay ohra-β-glukaania kuin alustan
Perinteiset lämpötila optimaalinen määrittäminen Celluclast® pH 5.0., Celluclast®: n lämpötila ohra-β-glukaanille määritettiin pH 5,0: ssa. Perinteinen lähestymistapa osoittaa, että suurin aktiivisuus on noin 55 °C ja on sopusoinnussa tulosten nähnyt vastaavaa ääriviivat juoni
Perinteiset pH optimaalinen määrittäminen Celluclast® kolme lämpötiloissa. Celluclast®-valmisteen pH-optimi ohra-β-glukaanille määritettiin 45 °C: ssa, 55 °C: ssa ja 65 °C: ssa., Alemmissa lämpötiloissa entsyymi sietää korkeampia pH-arvoja. Tämä on mukaisesti vastaava ääriviivat juoni ja osoittaa voimakas vaikutus valittu kiinteä parametri määritettäessä pH: n tai lämpötilan optimaalinen erikseen
toiminta-alue Celluclast® arabinoksylaani (AX) (Fig. 6)eroaa siitä, että BBG substraattina. Aktiivisuus on huomattavasti siirtynyt kohti alhaisempia lämpötiloja, eikä korkeita toimintoja ole havaittu yli 60 °C: ssa., Koska Celluclast® on useiden entsyymien seos, on erittäin todennäköistä, että näillä eri entsyymeillä on erilaiset ominaisuudet. Kuitenkin, aktiivisuus kuvio on samanlainen kuin BBG; esimerkiksi, pH 4.5, entsyymin seos on erittäin aktiivinen lähes 60 °C, kun taas pH 6.5, se on vain erittäin aktiivinen jopa 50 °C. kirjallisuudessa, optimaalinen ja Celluclast® vehnän liukoinen AX määritettiin vastaus pinnan malli (RSM) ja sen on todettu olla noin pH 4. 4 ja 39 °C: ssa ., Meidän ääriviivat juoni näyttää korkeimman toimintaa samalla lämpötila-alueella ja hieman korkeampi pH-arvo, joka on vielä sisällä optimaalinen määräytyy RSM. Kun optimi on lähes sama molemmilla menetelmillä, meidän ääriviivat juoni silmiinpistävän näyttää tarkan toiminnan Celluclast® AX sisällä koko valikoima testattuja ehtoja ja näyttelyitä tarkempi disposition kuin RSM. Kun celluclast® on BBG ja AX, voimme osoittaa, että kompleksisia entsyymiseoksia voidaan analysoida ehdotetulla menetelmällä.
Ääriviivat juoni Celluclast® käyttää DNSA assay kanssa arabinoksylaani substraattina
osoittaa edelleen monipuolisuutta meidän toiminta-alue päättäväisyyttä, olemme arvioineet sen käyttö ylimääräisiä alustoille ja määritykset. Celluclast® – valmisteen aktiivisuus p-NP-β-d-glukopyranosidilla testattiin ja ääriviivat näkyvät kuvassa. 7. Korkea aktiivisuus tällä substraatilla on rajoitettu melko kapealle alueelle välillä pH 4,0-5,5-55 °C-70 °C., Tämä viittaa siihen, että vain yksi tai muutama entsyymit sisällä Celluclast® entsyymin seos todennäköisesti osoittaa aktiivisuutta kohti p-NP-β-d-glykopyranosidi. P-NP-glykosideja voidaan käyttää substraatteina ääriviivojen valmistuksessa. Kuitenkin, ei kaikki p-NP glykosidit ovat sopivia substraatteja määritys, koska useat niistä osoittavat korkea tausta, koska epävakaus (ks Tiedostojen 5), varsinkin kun korkeat lämpötilat yhdistettynä korkea pH-arvot.
Ääriviivat juoni Celluclast® käyttämällä p-NP-β-d-glykopyranosidi
testaa sovellus meidän menetelmä luonnon biomassa näyte, päätimme käyttää olki-pohjainen alustaan. Glukoosin vapautuminen Celluclast® – menetelmällä havaittiin kaupallisella D-glukoosi HK-määrityksellä (Megazyme). Oljen soluseinän pääkomponentti on selluloosa, joka on entsymaattisesti vapautuvan glukoosin pääasiallinen lähde. Ääriviivat juoni (Kuva., 8) osoittaa siis pääasiassa celluclast®: n aktiivisuutta kiteisessä selluloosassa, joka on sitoutumaton entsymaattiseen hajoamiseen . Korkein release glukoosia havaittiin noin pH 4,0-5,5 ja 40 °C-60 °C. alue, jossa korkea aktiivisuus on siis yhtä laaja kuin määritetty BBG, jotka olisi otettava huomioon prosessi, lähinnä pyrittiin hajottamaan selluloosaa., Käyttämällä d-glukoosi HK ja p-NP-β-d-glykopyranosidi vaihtoehtoisia määrityksiä, voisimme osoittaa sopeutumiskykyä meidän menetelmä yhteensä neljä erilaista ja yleisesti käytetty glykosidiannoksen hydrolaasi määrityksissä. Olkien käyttö osoitti, että menetelmämme soveltuu myös teollisuuden kannalta merkittäville luonnollisille alustoille, ja sitä voidaan käyttää monimutkaisten prosessien ja substraattien arviointiin. Celluclast® näyttää erilaisia aktiivisuusprofiileja eri alustoilla., Yhdessä kaikki menetelmät, se on siksi tärkeää määrittää pH-ja lämpötila-alue tiedot entsyymin substraatin kanssa kiinnostaa.
Ääriviivat juoni Celluclast® käyttäen d-glukoosi HK assay olki-pohjainen luonnollinen substraatti,
Näkökohtia, kun käyttää menetelmää
Kun ääriviivat juoni on valmistettu ehdotettu menetelmä, on olemassa useita näkökohtia, jotka olisi otettava huomioon., Alustan on oltava vakaa ja mitataan tausta toistettavissa yli täyden valikoiman ehtoja 96-kuoppalevy. Tämä on edellytys, koska alustan ohjaus on vähennettävä kaikki arvot ennen muuntaminen suhteellinen toimintaa, mutta sitä ei voida suoraan mitata lautaselle kullekin 96 ehtoja. Esimerkiksi useita p – NP-glykosidisubstraatteja ei voida käyttää, koska niissä on hyvin lämpötilasta ja pH: sta riippuvainen Tausta. Erittäin tarkka pipetointi on tarpeen, jotta saadaan hyväksyttävät standardipoikkeamat kolmioliuskasta., 96-ja 8-kanavaisten pipettien käyttö on erittäin suositeltavaa, koska ne parantavat merkittävästi tarkkuutta ja nopeuttavat menettelyä. Lisäksi levylukija ja gradientti PCR-sykleri ovat teknisiä vaatimuksia menetelmän moitteettomalle toteuttamiselle. Lämpötila-alue, jossa menetelmä voidaan suorittaa voidaan mukauttaa mukaisesti tekniset ominaisuudet gradientti PCR cycler, joka on yleensä rajoitettu 30 °C tai 40 °C, ja usein ei voi sisältää arvoja alle 20 °C., Me suoraan muuntaa absorbanssi osaksi suhteellinen aktiivisuus entsyymi, koska arvot ovat kaikki lineaarinen kalibrointi käyrä (tiedot eivät ole näkyvissä). Jos näin ei ole, kuitenkin aktiivisuus on laskettava ensin, esimerkiksi U/mg, ja näitä arvoja voidaan sitten käyttää tuottamaan ääriviivat juoni. Kun halutaan tuottaa ääriviivat juoni entsyymi, joka on vahvasti riippuvainen kaksiarvoisen metalli-ioneja, eri puskuri järjestelmä on käytettävä, koska sitraatti–fosfaatti-pohjainen puskurit monimutkaisia ne ioneja.,
Kun RSM lähestymistapoja ovat kiistatta tehokas keino arvioida monimutkaisia suhteita, esimerkiksi, erilaisia muuttujia, jotka vaikuttavat useita tekijöitä, määritetään vaikutus vain pH-ja lämpötila-toimintaa ei ole liian monimutkainen, jotta voidaan saavuttaa suora mittaus. Mallin oikeiden raja-arvojen määrittäminen voi ottaa useita lähestymistapoja ja vaikuttaa tuloksena olevaan malliin. RSM-malli on johdettu vain pieni määrä mittauksia ympäri keski kohta entsyymin toimintaa ja tarkkuutta kohti varsinaisia kokeellisia arvoja on testattu jälkeenpäin., Yleinen resoluutio RSM on siis pienempi kuin saatu meidän menetelmä, joka tekee se vaikea nähdä toiminnan vaikutuksia, kuten on esitetty Celluclast® korkeammissa lämpötiloissa ja/tai pH-arvot. Meidän menetelmä ei vaadi kyky suunnitella monimutkaisia tilastollisia malleja ja voidaan suorittaa pienellä ja suhteellisen standardin tekniset vaatimukset. Haittapuoli sekä menetelmämme että RSM: n osuus on, että suora visualisointi standardipoikkeamasta kolmiulotteisessa juonessa ei ole mahdollista., Menetelmämme mahdollistaa kuitenkin keskihajonnan laskemisen kunkin yksittäisen datapisteen osalta. Useimmat RSM-mallit määrittävät koko mallin keskihajonnan vain mallin keskitietopisteen tiedoista, kun taas muut datapisteet mitataan vain kerran . Standardipoikkeamat ovat luonnollisesti korkeampia entsyymin toiminnan rajoilla ja kuvaavat voimakasta vaikutusta aktiivisuuteen lievässä olosuhteiden muutoksessa. Optimaalisella alueella ja alueilla, joilla ei ole lainkaan tai vähän toimintaa, poikkeamat ovat huomattavasti pienempiä., Koska ehdotettu menetelmä tulokset full factorial data set, se olisi mahdollista laskea tilastollinen malli, jos tarvitaan tarkempaa analyysiä. Saatu tilastollinen malli olisi pohja suoraan kokeelliset tiedot, mutta on ylimääräinen askel, joka pitäisi olla tarpeen, vakio-sovelluksia menetelmän.
yhteenvetona, helppo arviointi entsyymiä tai entsyymi seoksen soveltuvuutta yhdistelmä prosessin parametrit on ratkaisevan tärkeää, kun suunnitellaan bioteknologian prosessit joko laboratorio-tai teollisessa mittakaavassa., Lämpötila ja pH ovat kaksi tärkeintä entsyymin toimintaan vaikuttavia prosessitekijöitä. Perinteiset lähestymistavat testata vaikutusta näiden tekijöiden entsyymejä perustuvat oletukseen, että siellä on kaksi-ulotteinen korrelaatio lämpötilan ja toimintaa sekä pH ja toimintaa. Sen sijaan uusia lähestymistapoja määritellä suhde kolmiulotteisessa väliä, mutta on tilastoihin perustuva, monimutkainen suunnittelu ja niiden tarkkuus todelliset tiedot voivat vaihdella., Menetelmän käyttöön täällä toisaalta mahdollistaa nopea ja helppo määritys vaikutus, että lämpötila ja pH on entsyymin toimintaa samanaikaisesti käyttäen 96-kuoppalevyillä, monikanavaiset pipetit, ja gradientti PCR cycler. Tämän perusteknisen laitteiston avulla on mahdollista tuottaa ääriviivoja pH: sta, lämpötilasta ja aktiivisuudesta, jotka perustuvat suoraan kokeelliseen tietoon. Menetelmässä testattiin useita laajoja glykosidihydrolaasimäärityksiä sekä malli-ja kompleksisubstraatteja.