Kasvu ja ravinteiden dynamiikka Ochromonas sp., siivilöi BG-1
Phagotrophy, jonka fototrofisten flagellates uskotaan antaa merkittäviä ekologisia etuja levät, jotka osoittavat käyttäytymistä (Flynn ja Mitra, 2009), mutta on myös näyttäisi olevan rajoituksista (vaikka pitkälti uncharacterized) johtamiseen sekoitettu ravitsemus samanaikaisesti yhdessä solussa (Raven, 1997). Nämä rajoitukset voivat aiheuttaa kustannuksia tai kompromissit ylläpitää dual solujen koneiden (verrattuna niihin erikoistuneita kilpailijoita), tai ehkä rajat puhua välillä anabolisia ja katabolisia biokemiallisia reittejä, jotka hämmentää kumpaakin toimintaa samanaikaisesti., Valitettavasti, ei ole käytännössä mitään määrällistä tietoa kustannuksista ja hyödyistä mixotrophic käyttäytymistä, eikä myöskään sitä, onko molemmat prosessit suoritetaan peräkkäin tai samanaikaisesti näiden lajien. Ajallinen osiointi saattaa olla mekanismi ylläpitämiseksi sekä kykyjä minuutin solut (vaikkakin laittamalla toinen prosessi pitoon milloin tahansa)., Arvioida, onko sekä käyttäytymistä tapahtuvat samanaikaisesti, erityinen fysiologinen hyöty(t) heterotrofisten ravitsemus mixotrophic levät, ja reagointikykyä tämä käyttäytyminen abioottiset ja bioottiset muuttujat ovat näkökohtia mixotrophic ravitsemus, että on ollut vaikea luoda käyttämällä perinteisiä lähestymistapoja ja menetelmiä.
tutkimme mixotrofista chrysophyte Ochromonas SP: tä., kanta BG-1, koska se voi olla kasvanut axenic culture (bakteerit-vapaa) ja se on aiemmin raportoitu olevan pääasiassa heterotrofisten organismi, joka saavuttaa korkeat kasvuluvut vain bakteerien esiintyminen (Sanders et al., 2001). Kasvu axenic culture esti mahdollisesti vaikeuttaa biologisten vuorovaikutusten ja elemental virtaa johtuvat toiminnasta muita eläviä mikro-organismeja, kulttuurien, mikä mahdollistaa vertailun nanoSIMS ja bulk-IRMS mittaukset ja ymmärtää paremmin tiettyjä lähteitä hiilen ja typen käyttää kasvun, jonka levä.,
Lisäksi, käyttää yhden epäorgaaniset lähde typen yksinkertaistettu meidän kokeellinen suunnittelu niin, että vain lähteitä typen keskipitkällä olivat ammonium-tai HKB. Levät yleensä hallussaan mekanismien käyttöönottoa ja omaksumista sekä ammonium-ja nitraattityppeä, mutta transcriptomic tiedot osoittavat, että jotkut chrysophytes, mukaan lukien Ochromonas sp. kanta BG-1, saattaa olla puuttuva geneettinen ominaisuus nitraatti-assimilaatio (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Lisäksi mes-puskuria ei lisätty väliaineeseen kokeissamme, koska se olisi voinut tarjota vaihtoehtoisen typen lähteen. MES saattoi olla myös alga: n (Sanders et al., 2001), ja sen poistaminen varmisti, että ainoat hiililähteet väliaineessa olivat joko bikarbonaatti tai HKB. Transcriptomic analyysi kokeet suoritettiin samalla tavalla kuin ne on esitetty tämän käsikirjoituksen osoittavat, että fotosynteesin koneiden Ochromonas sp. kanta BG-1 ilmaistaan ja säätellään valon läsnä ollessa (Lie et al., 2017)., Tämä yksinkertaistettu lähestymistapa yhdistettynä vakaisiin isotooppimerkintöihin antoi meille mahdollisuuden määrittää, mitä typen ja hiilen lähdettä(lähteitä) käytettiin alga: n kasvuun.
Merkittävää kasvua hinnat Ochromonas tässä tutkimuksessa saavutettiin vain, kun HKB oli runsaasti saaliiksi (Kuva 1a). Chl dynamics kulttuuri heijastuu myös korkea kasvu johtuu laiduntavat HKB, koska pitoisuus Chl solu−1 väheni suuruusluokkaa ensimmäisten 48 h inkubointi kulttuureissa kasvaneet valo sekä jatkuva pimeys (Kuva 1d)., Nämä muutokset solu-klorofylli saattavat liittyä laimennus Chl on solujen sisällä, koska korkeat kasvuluvut levä (Hansen et al., 2000), niin että vähennys Chl solu−1 oli seurausta nopeasti kasvava hinnat levä ja ole suora vähentäminen klorofylli biosynteesi tahtiin. Kuitenkin, se on myös mahdollista, että siellä oli joitakin asetuksen klorofylli biosynteesi, kun HKB olivat läsnä transcriptomic analyysi tämä levä viittaa siihen, säätelyä geenejä, jotka liittyvät klorofylli synteesi läsnä valoa, kun HKB oli tyhjentynyt (Lie et al., 2017)., Joka tapauksessa nämä havainnot ovat yhtäpitäviä Ochromonasin aiempien tutkimusten kanssa (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) on havaittu hyvin kehittynyt heterotrofisten valmiudet, mikä viittaa siihen, että hiilen korjaus-ja ehkä muiden solujen rakenteita ja prosesseja mukana fotosynteesi vähenee, kun kasvava mixotrophically, kuten havaittiin jotkut muut levät (Wan et al., 2011).
Liuennut ammonium sekä fosfaatti, kertynyt Ochromonas kulttuurien ensimmäisten 48 h kokeiluja, kun HKB olivat aktiivisesti laidunnettu (Kuva 2)., Tämä tulos osoittaa, että ylimääräinen typpi ja fosfori alkaen laiduntaa HKB olivat erittyy levä. Massa tasapaino laskelmat perustuvat muutokset saalis/levien runsaus ja typpi niiden solujen sisältö osoitti, että jopa 50 prosenttia typen sisältämät kulutetaan HKB oli sulavaa levä, vaikka huomattavan määrän ylimääräistä typpeä julkaistiin pääasiassa ammonium-aikana aktiivisesti bakteeri laiduntaminen (Kuva 2)., Nämä arvot typen assimilaatio (ja erittyminen) ovat yhdenmukaisia omaksumisen tehokkuus heterotrofisten alkueliöt samankokoisia (Taylor 1982; Caron ja Goldman, 1990), yhdenmukainen johtopäätös, että Ochromonas kasvaa pääasiassa kuin heterotroph, kun saalis oli runsas. Edelleen, transcriptomic analyysit ovat osoittaneet, että eri ammonium-kuljettajat ovat ilmaisseet Ochromonas sp. kanta BG-1 kasvaa HKB verrattuna kasvua sen jälkeen, kun bakteerit on laidunnettu hyvin alhainen runsaus (Lie et al., 2017)., Vaikuttaa siis siltä, että kuljettajat vienti ammonium ulos solusta voivat olla erilaisia kuin ne, joita käytetään ammonium-kertymä, kuten on havaittu muiden organismien (Shnaiderman et al., 2013).
Mielenkiintoista, pitoisuuksina ammonium, mutta ei fosfaatti, vähentynyt keskipitkällä kun HKB oli poistettu laiduntamalla (joka on, jälkeen 48 h; Kuva 2), kun Ochromonas oli kasvanut valossa., Tämä tulos näyttää viittaavan siihen, että levä aktiivisesti otti ammonium (mutta ei fosfaatti) keskipitkän, kun bakteerit eivät enää olleet käytettävissä, ja fotosynteesi oli aiheuttama (Kuva 1d). Sen sijaan sekä ammonium-ja fosfaatti kulttuurien kasvanut pimeässä jatkoi nousuaan koko kokeen (katkoviiva Kuvassa 2). Ei merkittäviä net levien väestönkasvu tapahtui seuraavat ehtyminen saalis jopa valossa, ja selitys kahtiajako oton nämä kaksi elementtiä on epäselvä., Arvelemme, että ammonium otettiin, koska sitä tarvittiin erityisesti solun fotosynteettisten koneiden uudelleenrakentamiseen.
jatkuva ulkonäkö fosfaatti -, kulttuuri keskipitkällä aikana myöhemmin osa kokeista on ristiriidassa tutkimusten joitakin muita Ochromonas lajeja, jotka ovat ilmoittaneet käyttöönotto fosfaatti, kun levä kasvaa autotrophically (Rothhaupt, 1996)., Puute fosfaatti ottoa kanta BG-1 saattaa osoittaa, että tämä Ochromonas oli kykenemätön tehokkaasti fosfaattia kertymä (joka saattaa myös osaltaan selittää, huono fototrofisten kasvumahdollisuuksia tämä kanta), tai että fosforia ei tarvita merkittäviä määriä solujen uudelleenjärjestely liittyy muutos fototrofisten kasvua, ja siksi kertymä ei kannustanut muutos phototrophy., On epätodennäköistä, että jatkuva nousu pitoisuus fosfaatti johtui hajoaminen liuenneen orgaanisen fosforin yhdisteitä keskipitkällä koska kulttuurit olivat eläviä bakteereja.
Päätelmiä stable isotope probing kokeiluja
Vakaa isotooppi-analyysi (nanoSIMS ja bulk-elemental analysis-IRMS) kävi ilmi, että sekä epäorgaaniset (13C-bikarbonaatti-ja 15N-ammonium) substraatteja ja 13C/15N-leimatun HKB oli sulavaa Ochromonas, edistää 15N ja 13C solujen rikastamista jälkeen 48 h inkuboinnin (Kuva 4)., Kuitenkin suuruus rikastamiseen epäorgaaninen-substraattien tai HKB ilmoitti, että aikana mixotrophic kasvua, ensisijainen lähteistä hiilen ja typen olivat peräisin phagotrophy. Isotooppien massa tase osoitti, että 88-95% typpi-ja 84-99% hiili oli peräisin HKB kun Ochromonas oli kasvava mixotrophically valossa. Rikastamiseen 13C havaittiin levää kasvatetaan kevyt verrattuna tumma (Koe 1 vs Kokeilu 3) kun 13C-bikarbonaatti oli saatavilla (Kuva 4)., Fotosynteettisen hiilensidonnan laskennallinen osuus oli kuitenkin vain 1-10 prosenttia biomassaan sulautuneesta hiilestä. Suurempi tehokkuus typen yhtiöittäminen päässä saalista havaittu valon suhteellinen jatkuva pimeys (Kuva 3; Kokeet 1, 2 vs Kokeilu 3) viittaa siihen, että valon ollut merkitystä, vaikkakin vähäinen, vuonna phagotrophic tehokkuutta levä., Tästä syystä, vaikka oletetun vähennykset fotosynteettisen koneiston Ochromonas kasvava phagotrophically on HKB (mistä on osoituksena alhainen solujen kiintiöiden Chl-a; Kuva 1d), valo on pieni ja myönteinen vaikutus levien ravitsemus. Koska hiilen määrä kiinnitetty fotosynteesi oli vain pieni murto-osa hiilen sulavaa kun levä kasvaa HKB, me spekuloida, että fotosynteesin laitteet voisi olla joka tarjoaa energian pikemminkin kuin hiiltä solujen materiaali, koska se on ollut arveltu varten Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
isotooppisissa massataselaskelmissamme on kaksi kaveaattia. Ensinnäkin, meillä ei ole valvoa pH evoluution kuluessa kulttuureista, joka olisi antanut parempia oivalluksia karbonaatti-tasapaino, joka on saattanut vaikuttaa hengitys-ja hiili-korjaus ja vaihto ilmakehän kanssa. Koska tällaiset, meidän arvio perustuu kokeita käyttäen leimatun epäorgaanisen hiilen saattaa olla aliarvioitu määrä epäorgaanisen hiilen vahvistettu Ochromonas sp. BG-1 (1% isotooppisen massataseen mukaan)., Joka tapauksessa, kokeilu käyttäen merkitty HKB ei olisi pitänyt vaikuttaa tämä varoitus, ja arvio 10% hiilestä peräisin epäorgaanisen substraatin on todennäköisesti realistinen. Toiseksi, Ochromonas pidetään tehoton hiili-tiedostoa järjestelijä, koska puuttuu hiilen pitoisuus mekanismeja (Maberly et al. 2009), jotka lisäävät CO2-pitoisuutta kuljettamalla CO2: ta ja/tai bikarbonaattia RubisCO-entsyymiin (Raven et al., 2008). Toisaalta, transcriptomic analyysi on osoittanut, että fotosynteesin koneiden rasitusta BG-1 on toimiva (Lie et al.,, 2017), ja meidän kokeita käyttäen leimattua bikarbonaatti osoitti merkittävää etua 13C murto runsaasti Ochromonas (Luvut 4 ja 5); siksi, Ochromonas sp. kanta BG-1 pystyy jonkin verran käyttämään epäorgaanista hiiltä, joskin tehottomasti.
Kuitenkin, vahva heterotrofisten toimintaa Ochromonas kasvaessaan mixotrophically on todennäköisesti lisäävät solunsisäisen CO2-allas sekä sen kulku. Koska nyrkkisääntö, se katsotaan, että heterotrofisten alkueliöt omaksua 40% nautitaan orgaanista ainesta, kun he vapauttaa 30% ja hengittävät toinen 30% (Reki, 1989)., Tämän perusteella yhteensä määrä hiiltä vapautuu Ochromonas kuin CO2 aikana eksponentiaalinen kasvu voi olla yhtä suuri kuin yhteensä bikarbonaatti lisätty alussa itämisaika, joka on seurauksia isotooppien massa tasapaino olemme esittäneet. Jos oletamme, että isotooppisesti rikastettu CO2 johdettu HKB hengitys on saatavilla samaan tasoa kuin liuenneen epäorgaanisen hiilen, inkubointi suoritetaan Ochromonas ja merkitty HKB ilmoitti, että ~84% hiili oli peräisin HKB., Jopa 20% rinnastaa hiili on peräisin HKB voisi oikeastaan vastaa hiili, joka oli alun perin hengityskaasujen ja sitten kiinnitetty Ochromonas. Jos näin on, fagotrofisesta aktiivisuudesta johdettu hengitys toimisi eräänlaisena hiilen pitoisuusmekanismina tälle Okromonalle. Vaikka ensisijaisena hiilen lähteenä Ochromonas kasvava mixotrophically oli peräisin HKB, ei-vähäinen määrä saattoi olla peräisin hengitystä ja sitten CO2 korjaus bakteerien biomassaa.,
Ochromonas siirtynyt sen aineenvaihduntaa kohti autotrophy kun inkuboitiin valossa, mutta vasta sen jälkeen, kun se oli tyhjentynyt HKB kulttuureihin (≈ 48 h kasvu). Tämä muutos näkyi siinä, että suurin IRMS 13C murto runsaasti hoitoa käyttäen merkitty HKB, jossa vähennys oli havaittavissa 48 s ja 145 h (Koe 2 Kuva 5), ohjeellinen sisällyttäminen leimaamaton hiilen osaksi leväbiomassa kautta valo prosesseja. Chrysophytes pidetään yleensä huono omavaraiset carbon kiinnitteet, koska huono hiilen pitoisuus mekanismeja (Maberly et al., 2009)., Nämä tulokset osoittavat kuitenkin, että epäorgaaninen hiilen Assimilaatio oli merkittävää. Vertailu kulttuurien kasvanut valossa (Koe 1 Kuvassa 5) ja jatkuva pimeys (Koe 3 Kuva 5) kävi ilmi, että 15N murto runsaasti pimeää kulttuurit eivät muutu, kun 95 h, kun kulttuurien valossa edelleen rikastuttaa vuonna 15N, mikä osoittaa, että Ochromonas jatkoi omaksua typen säilyttää aineenvaihduntaa kerran HKB oli tyhjentynyt., Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia havaittu vähentää pitoisuus ammonium keskipitkällä tämän jakson aikana (Kuva 3a), vaikka jatkoi ulkonäkö fosfaatti keskipitkällä tänä aikana on selittämätön.
– saimme hyvän yleiskuvan välinen sopimus bulk-isotooppien mittaukset ja nanoSIMS mittaukset typen, sopusoinnussa havaintojen aiemmissa tutkimuksissa (Popa et al., 2007; Orphan and House, 2009; Kopf ym., 2015; kuva 4c)., Kuitenkin suurin mittaukset olivat hieman alhaisemmat kannalta murto runsaasti arvot hiilen, erityisesti korkeasti rikastettua näytettä (Kuva 4d). Me spekuloida, että erot nanoSIMS ja bulk-isotooppien mittaukset hiilidioksidin voi olla liittyvät siihen, että nanoSIMS näytteet oli säilötty glutaraldehydi, ottaa huomioon, että näytteitä irtotavarana analyysi ei. Kiinnittymisen on osoitettu vaikuttavan soluhiileen (Musat et al., 2014), vaikka meillä saattaa olla odotettavissa tämä laimentaa 13C vuonna nanoSIMS mittaukset suhteessa bulk-arvot., Todennäköisempi selitys on se, että yksisolumittauksiin eivät vaikuta viljelmän solujätteet, jotka saattavat rikastua vähemmän. Suurin 13C-arvo voi olla laimennettu nämä komponentit suhteessa nanoSIMS mittaukset, mikä tarkoittaa, että nanoSIMS tiedot voivat paremmin vastaamaan hiilidioksidin ja typen ottoa levät. Kuitenkin, solujen vaihtelu voi myös osaltaan pieniä eroja suurimman ja nanoSIMS mittaukset.,
käyttö nanoSIMS tässä tutkimuksessa edustaa ensimmäisen hakemuksen kohti tutkimuksen hiilen ja ravinteiden virtaamista on mixotrophic levä, ja se on käytössä parempi käsitys hiilen ja energian hankinta tämän lajin, ja solujen aineenvaihduntaa. Havaintomme laajentavat ochromonas SP: n perinteisistä analyyseistä saatavaa tietoa. kanta BG-1 kasvatettu erilaisissa valon ja saaliin saatavuuden olosuhteissa (Sanders et al., 2001), joka vahvistaa, että suurin osa kasvuun käytetystä typestä ja hiilestä saadaan sen bakteerisaaliin avulla., Vaikka tuloksia ei voida suoraan yleistää koskemaan kaikkien lajien jatkumolla, levät eri mixotrophic strategioita, työmme vahvistaa käyttö stable isotope probing kokeiluja ja nanoSIMS ymmärtää paremmin aineenvaihdunnan perustuksista mixotrophy yksi laji. Lisäksi se tarjoaa lähestymistavan ympäristönäytteiden sisältämän mixotrofisen ravinnon arviointiin. Ochromonas sp. kanta BG-1 edellyttäen ihanteellinen malli järjestelmän vertaamalla suurimman isotooppi-analyysi nanoSIMS, koska bakteerit olivat nopeasti poistaa laiduntaminen ensimmäisten 48 h kokeiluja., Sopimus näiden kahden mittaukset osoittavat, että nanoSIMS mittaavalla dynamics hiilen ja ravinteiden hankinta tässä mixotroph, ja joka näin ollen voisi laajemmin soveltaa tutkia mixotrophy monimutkaisia sekoitetaan yhteisöissä, joissa irtotavarana toimenpiteet olisivat riittämättömiä, jotta kaapata nämä dynamiikkaa. Tämä ja tulevat yksityiskohtaiset tutkimukset parantavat edelleen mixotrofisten levien ravitsemusta koskevaa ymmärrystämme.