Veren kerääminen ja käsittely
Kaikki menettelyt, joissa kokoelma ihmisen veressä kuin terveillä vapaaehtoisilla olivat mukaisesti Human Research Ethics Committee of the University of Sydney (hyväksyntä HREC 2014/244) ja tietoinen suostumus oli saatu kaikki yksilöitä., Kaikki toimenpiteet, joihin liittyy kokoelma ihmisen verta ECMO potilaat olivat mukaisesti Alfred Hospital Etiikka, Monash University Pysyvän Komitean Tutkimus Ihmisillä (hyväksyntä 388/13) ja tietoinen suostumus oli saatu kaikki yksilöitä. Kaikki menettelyt olivat vuoden 1983 Helsingin julistuksen mukaisia. Verta kerättiin venesection käyttäen 21 g perhonen Terumo neula 10 terveillä luovuttajilla ei lääkkeitä (neljä uros, kuusi naaras, 22-58 vuotta vanha)., Ensimmäinen 5 mL verta oli hävitettävä, jotta vältetään trombiinia, joka on voitu tuottaa noin neulan insertiokohdan ja sitten vedetään putket sisältävät 3.2% v/v natriumsitraatti. Verta kahdeksan potilaita, joilla on yksi keskus, joka oli ECMO-tuki (neljä uros, neljä naarasta, 34-67 vuotta vanha) oli laadittu osaksi ACD-A-putkiin (BD Vacutainer)., Potilaiden ECMO saatu tuki anti-hyytyminen ja/tai anti-verihiutaleiden lääkitys perustuu tällä kliinikot harkintansa mukaan tai laitosten ohjeissa, joissa potilasta tyypillisesti alkoi varfariinin, target international normalized ratio (INR) 2-3, bridging-hepariini-infuusio ja aspiriini hoito, sekä dipyridamoli niille, jotka ovat pitää korkea riski veritulpan. Plasma valmistettiin kaksi kertaa sentrifugoimalla 800 × g: n lämpötilassa 20 min huoneenlämmössä., Joissakin tapauksissa tervettä luovuttajan plasmaa kerittiin 2000 s−1: n tai 10000 s−1: n nopeudella 5 minuutin ajan huoneenlämmössä Kinexus pro+ rheometrillä.
Maksasolujen fibrinogeeni-kokoelma
ihmisen maksan syöpä-solulinja HepG2 (ATCC, HB-8065) oli sivistynyt DMEM, 10% vasikan sikiön seerumia ja glutamax 5% CO2 ja 37 °C. Solut 80-90% yhtymäkohta pestiin fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, inkuboitiin 18 h DMEM ilman seerumia 5% CO2 ja lämpötila 37 °C tai hypoksinen jaosto 1% O2, 5% CO2, ja 37 °C: ssa., Käsitelty aine kerättiin (1 mL 4 × 106 solua kohti) ja erittynyt fibrinogeeni käsiteltiin välittömästi alla kuvatulla tavalla.
Fibrinogeenin ja fibriinin määritykset
Plasma näytteet olivat hoitamatta tai inkuboitiin trombiinilla ja/tai fibriinin polymerointi estäjä, GPRP (Sigma). Fibriinin valmistettiin 1 mL plasmaa, jonka lisäksi 50 yksikköä naudan trombiinille (Sigma) ja 10 mM CaCl2 ja MgCl2 40 min 22 °C. fibriinin polymeerit kerättiin käyttämällä muovinen sauva., Eräässä kokeessa, plasma (2 mL) ja inkuboitiin 27 Yksikköä/mL trombiinin ja 10 mM CaCl2 ja MgCl2 40 min 22 °C, ja fibriinin polymeeri kerätään muovi sauva ja poistaa. Köyhdytettyä plasma inkuboitiin toinen erä 27 Yksikköä/mL trombiinin ja uusi fibriinin polymeeri kerättävä ja poistettava. Määräosa plasman (0,2 mL) otettiin näyte ennen ja jälkeen lisäämällä sekä paljon trombiinin, 150 µM d-enyylialanyyli-prolyl-arginyl kloorimetyyli ketoni (PPACK, Sigma) lisätään estävät trombiinin toimintaa ja näytteitä inkuboitiin 16 h 22 °C., Fibrinogeeni-pitoisuus plasma-näytteet oli arvioitu keräämällä proteiini polyklonaalisia anti-fibrinogeeni-vasta-aineella päällystetyt helmet (ks. seuraava luku), ratkaista fibrinogeeni on SDS-PAGE ja värjäys kolloidinen Coomassie. Toisessa kokeessa, plasma inkuboitiin 8 mM GPRP (Sigma) 5 min 22 °C ennen lisäksi 50 yksikköä/mL trombiinin 60 min 22 °C. reaktio oli sammutettiin 150 µM PPACK 10 min 22 °C. Puhdistettu fibrinogens eristettiin terveistä luovuttajan tuorepakastettu plasma-β-alaniini precipitation32 tai saatu kaupallisesti (Sigma F4883).,
määrittäminen redox-valtioiden fibrinogeenin ja fibriinin disulfidisidoksia
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) oli päällystetty 16 µg polyklonaalisia anti-fibrinogeeni-vasta-aineita (Dako, Kissa A0080, Paljon 00015063) 1 mL fosfaattipuskuroitua suolaliuosta pyörivä pyörä 1 h 22 °C ja ylimääräinen vasta-aine poistaa pesemällä kolme kertaa 1 mL fosfaattipuskuroitua suolaliuosta. Plasman (0.7 mL) tai HepG2-conditioned medium (4.5 mL) ja inkuboitiin 2 mg päällystetyt helmet pyörivän pyörän 1 h 22 °C., Helmiä on kerätty käyttäen magneetti, ylimääräinen plasma-hengittävä vähentää äänenvoimakkuutta, ja inkuboidaan 0, 3 mL 5 mM 12C-IPA: fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, joka sisältää 10% DMSO-1 h 22 °C pimeässä alkylaatti parittomia Cys tiolit vuonna proteiineja. Se supernatantit olivat hengittävä, ja helmiä inkuboitiin kanssa NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), joka sisältää vielä 5 mM 12C-IPA 30 min 60 °C. supernatantit ratkaistiin SDS-PAGE., Fibriinin polymeerit syntyy plasmassa on kerätty muovi sauva ja heti upotetaan 1 mL 5 mM 12C-IPA: fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, joka sisältää 10% DMSO-1 h 22 °C pimeässä. Fibriinin pestiin 3 kertaa fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta ennen liuottamalla polymeeri 1 mL 20 mM etikkahappo 24 s 22 °C. Kaksikymmentä mikrolitraa liuosta inkuboitiin kanssa NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), jotka sisältävät 5 mM 12C-IPA 30 min 60 °C ja proteiineja päätti SDS-PAGE., Puhdistettu fibrinogeeni (12 mikrog) inkuboitiin 5 mM 12C-IPA: fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, joka sisältää 10% DMSO-1 h 22 °C pimeässä ja proteiinia päätti SDS-PAGE.
SDS-PAGE-geelit värjättiin kolloidinen coomassie (Sigma) ja fibriini(ogen) bändit leikattiin, destained, kuivatut, inkuboitiin 40 mM ditiotreitolia ja washed14. Geeli viipaleet olivat inkuboitiin 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotoopit) 1 h 22 °C pimeässä alkylaatti, että disulfidi joukkovelkakirjojen Cys, pestään ja kuivataan ennen ruoansulatusta proteiineja 12.,5 ng/µL trypsiiniä (Promega) 25 mM NH4CO2 yöpyminen 25 °C. Peptidit olivat eluoida viipaleiksi 5% muurahaishappoa, 50% asetonitriili. Nano-nestekromatografia (nano-LC) suoritettiin käyttäen Perimmäinen 3000 HPLC-ja autosampler-järjestelmä (Dionex). Näytteet olivat ruiskutetaan fritless nano-LC-sarake (75 µm x ~12 cm) sisältää C18 media (1.9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Tohtori Maisch GmbH) ja kuumennetaan 45 °C: ssa kaikki toimii. Peptidit eluoitiin lineaarisella gradientilla yli 52 min virtausnopeudella 0,2 µL / min. Mobiilivaihe a koostui 0.,1% muurahaishappoa H2O, kun liikkuva faasi B koostui asetonitriili:H2O (8:2) 0,1% muurahaishappoa. Kaltevuus oli: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37.5 min 80% B, 39 min 2% B ja 52 min 2% B. Korkea jännite (2000 V) oli soveltaa pieni määrä t-paita (Upchurch Tieteellinen) ja sarake vinkki sijoitettu ~0,5 cm päässä lämmitetty kapillaari (T = 275 °C) on LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) massaspektrometri. Positiivisia ioneja kertyi electrospray ionisaatio ja massaspektrometrien, joita käytetään tietojen riippuvainen hankinta-tilassa., Full scan MS spectra hankittiin (m/z 350-1750) Orbitrap resoluutiolla 30 000. 15 runsain ioneja (>5000 lukemaa) kanssa ilmaiseksi todetaan ≥ +2 olivat peräkkäin yksittäisiä ja hajanaisia sisällä lineaarinen ioniloukku käyttäen collisionally aiheuttama dissosiaatio aktivoiminen q = 0,25 ja aktivointi aika 10 ms kohde arvo 30000 ioneja. MS/MS: lle valitut m / z-suhteet suljettiin dynaamisesti pois 35 s. Ioniloukku Zoom AGC-tavoite: 3000,00. Ioni ansa täysi AGC tavoite: 30000.00. Ioni ansa SIM AGC tavoite: 10000.00. Ioni ansa MSn AGC tavoite: 10000.00., Tiedot analysoitiin Mascot Daemonin (versio 2.5.0, Matrix Science) avulla Swissprot-tietokantaa vastaan. Haku parametrit olivat esiaste toleranssi 6 ppm ja tuote-ion toleranssit ±0.6 Da, ja iodoacetanilide johdannainen (Cys), iodoacetanilide 13C johdannainen (Cys), hapettuminen (Met) valittu muuttuja muutoksia täynnä tryptisten pilkkominen jopa kolme jäi pilkkoutuminen. Luettelo kysteiiniä sisältäviä peptidejä tunnistaa käyttämällä Maskotti, niiden monoisotopic mass/charge ratio (m/z) +2, +3 ja +4 on laskettu käyttäen MS-Tuote (Versio v 6.2.2, Proteiinia Prospector-Työkalut)., Cys-merkitty 12C-IPA tai 13C-IPA on massa 133.05276 tai 139.07289, vastaavasti. Analysoitiin kolmekymmentä Cys: ää sisältävää peptidiä (täydentävät taulukot 1 ja 2). Eri redox muotoja Cys jäämät olivat määrällisesti suhteellinen ion runsaasti peptidejä merkitty 12C-IPA ja/tai 13C-IPA. Laskea ion runsaasti peptidejä, uutettu ioni-kromatogrammien saatiin käyttämällä XCalibur Kars-Selain (v2.1.0; Thermo Scientific). Alue laskettiin ohjelmistoon rakennetulla automatisoidulla huipputunnistustoiminnolla., Tiedot oli rutiininomaisesti etsinyt peptidejä sisältävät ilmainen Cys tiolit ja näitä ei havaittu, mikä osoittaa, että alkyloinnin parittomia Cys jäämiä, joita 12C-IPA tai 13C-IPA oli täydellinen proteiini.
Fibrinogeeni disulfidi-toisiinsa peptidi-analyysi
Terveen luovuttajan plasmassa (0.7 mL) inkuboitiin kanssa polyklonaalisia anti-fibrinogeeni-vasta-aineella päällystetyt Dynabeads pyörivä pyörä 1 h 22 °C. helmiä on kerätty, ylimääräinen plasma-hengittävä ja 0,3 mL 5 mM 12C-IPA: fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, joka sisältää 10% DMSO oli lisätty ja inkuboitiin 1 h 22 °C pimeässä., Sitten supernatantti oli vapaasti hengittävä, helmiä inkuboitiin kanssa NuPAGE LDS sample buffer 30 min 60 °C, ja supernatantit päätti SDS-PAGE. Geeli viipaleet sisältävät fibrinogeeni oli pesty ja kuivattu ennen ruoansulatusta 12 ng/µL trypsiiniä (Promega) 4 h 37 °C. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 5% (v/v) muurahaishappo ja peptidit eluoitiin geelistä viipaleiksi 5% muurahaishappoa ja 50% (v/v) asetonitriili. Peptidit 0.,1% muurahaishappoa (lopullinen tilavuus 12 µL) ratkaistiin 35 cm x 75 µm C18 käänteinen vaihe analyyttinen sarake käyttämällä 2-35% asetonitriili kaltevuus yli 22 min virtausnopeudella 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) ja analysoida siitä LTQ Orbitrap Velos massaspektrometri, kuten edellä on kuvattu. Disulfidi-liittyvät peptidit olivat etsineet vastaan ihmisen fibrinogeeni järjestyksessä käyttäen Byonic analyysi-ohjelmisto (Versio 3.9-7, Proteiinia Mittarit) kanssa false discovery rate 1%. Kaikki disulfidisidoksiset peptidit tarkastettiin käsin tarkkuuden varmistamiseksi., Prekursorimassatoleranssiksi asetettiin 10 ppm ja fragmenttitoleranssiksi 0,6 Da. Muuttujan muuttaminen oli määritelty hapettunut Tavannut, hapettunut Cys (mono -, di-ja tri -) ja glutathionylated Cys täysin trypsiini pilkkominen jopa kolme jäi pilkkoutuminen.
Fibrinogeeni toiminnallisuuden määritys
Puhdistettu fibrinogeeni (0,2 mL 10 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 5 mM 12C-IPA 1 h 22 °C pimeässä alkylaatti parittomia Cys tiolit proteiinia., Reagoimaton IPA poistettiin käyttämällä 7 kDa MWCO Zeba spin desalting-kolonnia (Thermo Fisher). Fibrinogeeni tai fibrinogeeni-IPA (1,1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma) 5 h 22 °C kokonaistilavuus 0,2 mL 1,5 mL microcentrifuge putket. Fibriinin polymeerit olivat pelletoitiin 13000 x g 15 min ja pitoisuus fibrinogeeni jäljellä supernatantti mitata. Toiminnallisuus ilmaistaan prosentteina fibrinogeenistä, joka kulutetaan fibriinipolymeerin muodostumisessa.,
Fibriinin polymeerin muodostumiseen mitataan valonsironta
Puhdistettu fibrinogeenin tai fibrinogeeni-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma). Absorbanssin kasvu 350 nm: ssä kirjattiin 30 s välein 15 minuutin ajan.
Fibriinin polymeeri rakenne mitattuna skannaus elektronimikroskoopilla (SEM)
Fibrinogeenin tai fibrinogeeni-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma) 2 h 22 °C kokonaistilavuus on 0,2 mL., Fibriinin polymeerit olivat huuhdellaan kahdesti 0,1 M fosfaatti-puskuri suolaliuosta (PBS), kiinteä 2,5% glutaraldehydi PBS yön yli 4 °C, post-kiinteä 1% OsO4 PBS, kuivattu, jossa arvostellaan sarja etanolia, ja seuraava kriittinen kohta kuivataan Leica EM CPD300. Näytteet olivat sputteroitiin 15 nm kulta (K550X, Emitech) ja kuvattavan Zeiss SigmaHD Field Emission Scanning Electron Microscope. SEM micrographs kirjattiin 5 kV: n kiihdytysjännitteellä ja työskentely etäisyys 5 mm. Kuidun halkaisijat mitattiin käyttäen ImageJ.,
Fibriinin polymeeri läpäisevyyden määritys
Fibrinogeenin tai fibrinogeeni-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma) 2 h 22 °C kokonaistilavuus 0,2 mL: n polypropyleeni nestekromatografiassa sisähalkaisija 4.6 mm. Sarakkeet olivat overlayed 0,8 mL Hepes-puskuria ja flux (J) oli laskettu paino laskee, että percolated 20 min., Sen läpäisevyys (Darcy) constant33 oli laskettu suhde, Ks = JƞA/BJ, missä J on valovirta (cm3/s), ƞ on viskositeetti buffer (0.01 ryhti huoneenlämmössä), A on poikkipinta-hyytymä (0.17 cm2), L on pituus hyytymä (1,1 cm), ja P on hydrostaattinen paine (1,018,218 dyne/cm2).
Fibriinin polymeeri tiivistyminen pitoisuus
Fibrinogeenin tai fibrinogeeni-IPA (1 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma) 16 h 22 °C yhteenlaskettu tilavuus on 0,5 mL 1.,5 mL microcentrifugiputkia, jotka on aiemmin päällystetty 10 mg/mL PEG-20000: lla vedessä ja ilmakuivattu. Fibriinin polymeerit olivat sentrifugoidaan 13000 x g 5 2400 s ja tilavuus nestettä puristetusta polymeeri mitata.
Fibrinolyysin pitoisuus
Fibrinogeenin tai fibrinogeeni-IPA (1,8 mg/mL 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) inkuboitiin 1 yksikkö/mL naudan trombiinille (Sigma) 2 h 22 °C yhteenlaskettu tilavuus on 0,5 mL 24-kuoppalevyillä (15,6 mm halkaisija) 2 h 22 °C. määräosa plasmiini (5 µL 0.,59 µM) lisättiin kaivojen keskelle ja levyjä inkuboitiin 18 tunnin ajan 37 °C: ssa kosteassa ympäristössä. Lyysialueet määritettiin kahden läpimitan keskiarvosta mitattuna suorassa kulmassa.
määrittäminen redox-valtioiden α2-macroglobulin disulfidisidoksia
10 terveen luovuttajan plasma edellä kuvattu analyysi fibrinogeenin olivat työsuhteessa analyysi α2-macroglobulin käyttämällä sama menettelyjä. Plasma (0.,7 mL) inkuboitiin kanssa polyklonaalisia anti-α2-macroglobulin vasta-aine (Dako, Kissa Q0102, Paljon 20068567)-päällystetty Dynabeads (Life Technologies) pyörivä pyörä 1 h 22 °C. helmiä on kerätty, ylimääräinen plasma-hengittävä, ja inkuboidaan 0, 3 mL 5 mM 12C-IPA: fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta, joka sisältää 10% DMSO-1 h 22 °C pimeässä alkylaatti parittomia Cys tiolit vuonna proteiineja. Se supernatantit olivat hengittävä, ja helmiä inkuboitiin kanssa NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), joka sisältää vielä 5 mM 12C-IPA 30 min 60 °C. supernatantit ratkaistiin SDS-PAGE., SDS-PAGE-geelit värjättiin kolloidinen coomassie (Sigma) ja α2-macroglobulin band leikattiin, destained, kuivatut, inkuboitiin 40 mM ditiotreitolia ja washed14. Geeli viipaleet olivat inkuboitiin 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotoopit) 1 h 22 °C pimeässä alkylaatti, että disulfidi joukkovelkakirjojen Cys, pestään ja kuivataan ennen ruoansulatusta proteiineja 12,5 ng/µl trypsiiniä (Promega) 25 mM NH4CO2 yöpyminen 25 °C. Peptidit olivat eluoida viipaleiksi 5% muurahaishappoa, 50% asetonitriili., Nestekromatografia, massaspektrometria ja data-analyysi tehtiin fibrinogeenille34 kuvatulla tavalla. 17 Cys-sisältävät peptidit analysoitiin (Täydentävät Taulukot 2 ja 4). Eri redox muotoja Cys jäämät olivat määrällisesti suhteellinen ion runsaasti peptidejä merkitty 12C-IPA ja/tai 13C-IPA.
Raportointi yhteenveto
lisätietoja tutkimuksen suunnittelu on saatavilla Luonne, Tutkimuksen Raportointi Yhteenveto liittyvät tämän artikkelin.