sujetos del estudio
Las mujeres fueron reclutadas de una fábrica en la comunidad urbana de Cuernavaca, a 89 km al sur de la ciudad de México., La concentración de hemoglobina en todas las mujeres de la fábrica se determinó a partir de muestras de sangre pinchadas en el dedo, seguidas de una muestra de sangre venosa para determinar la ferritina sérica en mujeres no anémicas. Un total de 20 mujeres no anémicas con reservas bajas de hierro fueron reclutadas con base en la concentración de hemoglobina 1 125 g/l y la concentración de ferritina sérica <25 µg/l. los criterios de exclusión incluyeron embarazo y lactancia, trastornos gastrointestinales o metabólicos (enfermedad inflamatoria intestinal, diarrea crónica, fibrosis quística), otras enfermedades crónicas y aquellos que toman suplementos de hierro., En total, 20 niños aparentemente sanos (de 6 a 24 meses) y 20 niños aparentemente sanos (de 2 a 5 años) fueron reclutados de madres con niveles adecuados de hemoglobina. Los sujetos y los padres de los niños fueron plenamente informados sobre los objetivos y procedimientos del estudio, y se obtuvo el consentimiento por escrito. El Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud Pública de Cuernavaca (México) y el Instituto Federal Suizo de tecnología de Zürich (Suiza) revisaron y aprobaron el protocolo.,
Tamaño de la muestra
los cálculos del tamaño de la muestra se basaron en las variaciones interindividuales e intraindividuales en la absorción de hierro observadas en estudios previos de biodisponibilidad de hierro en lactantes y niños pequeños (Davidsson et al., 1994, 1997, 2000, 2004). Se estimó que 20 niños serían un tamaño muestral mínimo para detectar una diferencia significativa del 50% en la media logarítmica de absorción de hierro a partir de una media aritmética basal de absorción de hierro del 7%, con una potencia del 90%, un nivel de significación de 0,05 (prueba t no apareada) y una tasa de error Tipo I del 5%., Anticipando una tasa de deserción del 10%, estas estimaciones indicaban que al menos 20 sujetos en cada grupo serían requeridos para completar los estudios.
diseño del estudio
Las mujeres, lactantes y niños fueron asignados aleatoriamente para recibir la comida de prueba con sulfato ferroso o con fumarato ferroso en días consecutivos. La comida de prueba se administró como desayuno después de un ayuno nocturno. La aceptabilidad de la comida de prueba se confirmó con cada bebé y niño antes de la inscripción en el estudio. No se permitió comida o bebida durante 3 h después de la ingesta completa de la comida etiquetada., Los bebés y los niños permanecieron bajo estrecha supervisión durante y después de la ingesta de comida de prueba.
en total, se extrajeron 5 ml de sangre venosa en tubos tratados con EDTA justo antes de la ingesta de la primera comida de prueba y nuevamente 14 días después. Se analizaron muestras de sangre para determinar los indicadores de estado del hierro (hemoglobina y ferritina sérica) y la composición isotópica del hierro. El peso corporal y la altura se midieron en cada punto de muestreo de sangre.
comida de prueba
la comida de prueba fue una bebida de leche de maíz endulzada basada en la bebida de avena de harina de maíz mexicana local ‘atole’. Se hizo a partir de harina de maíz degermed (24.,7%), leche entera en polvo (11,7%), piloncillo (forma sólida de azúcar morena sin refinar; 63,5%) y agua purificada (200 ml) sin hierro ni ácido ascórbico añadidos. Se prepararon comidas estandarizadas de prueba especialmente para el estudio a partir de alimentos disponibles localmente comprados a granel, excepto la harina de maíz degermed que no estaba disponible en México y se obtuvo de Suiza (Swiss Mill, Zurich, Suiza). La harina de maíz Degermed se utilizó para minimizar el contenido de ácido fítico de la harina, lo que de otro modo reduciría la biodisponibilidad del hierro de la comida de prueba (Hurrell et al., 2002)., La comida de prueba se cocinó en una instalación de cocina y se transportó caliente al centro de alimentación de la fábrica, donde se preparó una porción de 220 g por mujer y 60 g por Bebé y niño como desayuno y se le siguió la ingesta de agua. Todas las comidas de prueba fueron idénticas, excepto la adición de 4 mg de Fe (mujeres) o 2,5 mg de Fe (bebés y niños) como fumarato ferroso o sulfato ferroso, que se agregaron a la comida de prueba inmediatamente antes de servir. El polvo de fumarato ferroso se agregó directamente a la comida de prueba y se agregó sulfato ferroso como solución.,
etiquetas de isótopos estables
etiquetado Isotópicamente: el fumarato ferroso fue producido por el Dr. Paul Lohmann GmbH (Emmerthal, Alemania) a partir de hierro elemental enriquecido utilizando un procedimiento de reducción de escala de su proceso de fabricación comercial equivalente. El mismo procedimiento se ha utilizado para estudios anteriores (Davidsson et al., 2000, 2001, 2002; Fidler et al., 2003; Sarker et al., 2004). Las dosis individuales de fumarato ferroso se pesaron previamente en tubos de polietileno, por lo que la cantidad exacta añadida se determinó por el peso del tubo, y luego se almacenaron., – el sulfato ferroso se preparó a partir de hierro elemental enriquecido isotópicamente (Chemgas, Boulogne, Francia), que se disolvió en 0,1 mol de H2SO4/l y se compuso hasta la concentración adecuada. La solución se mantuvo en atmósfera de argón en un frasco de polietileno hasta que fue necesario y se pesó en dosis individuales antes de la alimentación.,
la composición isotópica de ambas etiquetas se midió por triplicado mediante espectrometría de masas de ionización térmica negativa utilizando un espectrómetro de masas de campo de sector magnético (MAT262; Finnigan MAT, Bremen, Alemania) equipado con un sistema multi-colector de tazas Faraday para la detección de iones. La concentración de hierro de cada etiqueta se midió por triplicado mediante análisis de dilución isotópica inversa (Walczyk, 1997). El fumarato ferroso se disolvió en ácido nítrico concentrado antes de la dilución isotópica., El estándar de hierro de composición isotópica natural se preparó gravimétricamente a partir de un material de referencia isotópico (IRMM-014; Instituto de materiales y mediciones de Referencia de la UE, Geel, Bélgica). Las relaciones isotópicas se midieron mediante espectrometría de masas de ionización térmica negativa (Walczyk, 1997).
composición isotópica de muestras de sangre
Las muestras de sangre entera enriquecidas se mineralizaron mediante digestión por microondas utilizando una mezcla de HNO3 y H2O2 concentrados (30%) como agentes oxidantes., El hierro se separó de la matriz mediante cromatografía de intercambio aniónico y un paso de extracción líquido-líquido en éter dietílico (Walczyk et al., 1997). Los espacios en blanco químicos se procesaron durante todo el procedimiento. La composición isotópica del hierro separado se midió mediante espectrometría de masas de ionización térmica negativa.
estado del hierro
Las muestras de sangre entera recién extraídas fueron alícuotas para la medición de la concentración de hemoglobina utilizando un fotómetro HemoCue portátil (Hemocue Inc., Angelholm, Sweden) and standardized techniques., El material de control de calidad correspondiente se analizó al inicio de cada día de muestreo (Hemocue Inc., Angelholm, Suecia). Se separó una alícuota de sangre entera para las mediciones de ferritina sérica mediante inmunoensayo automatizado (Immulite One; DPC, Los Ángeles, CA, EE.UU.) en ETH, Zurich, y la sangre entera restante se congeló para un análisis posterior de la composición isotópica.,
cálculo de la absorción de hierro
Las cantidades de etiquetas isotópicas 57fe y 58Fe en sangre, 14 días después de la administración, se calcularon con base en el cambio de las relaciones isotópicas Fe y la cantidad estimada de hierro circulante en el cuerpo. Los cálculos se basaron en los principios de la dilución isotópica, teniendo en cuenta que las etiquetas isotópicas del hierro no eran monoisotópicas. El hierro circulante se calculó con base en el volumen sanguíneo y la concentración de hemoglobina. Los cálculos del volumen sanguíneo se basaron en el peso corporal y la altura según Brown et al. (1962) for women and Linderkamp et al., (1977) para niños. Para los cálculos de la absorción fraccionada de hierro, se asumió la incorporación del 80% del hierro absorbido en los eritrocitos para las mujeres (Hosein et al., 1967) y el 90% para los niños (9). Se calculó el RBV del fumarato ferroso para cada conjunto de datos.
análisis estadístico
Los valores fraccionados de absorción de hierro se presentan como medias geométricas y D. S. todos los ensayos estadísticos fueron potenciados al 80% y realizados con un intervalo de confianza del 95% sobre los datos log-transformados, ya que los valores de absorción de hierro no se distribuyen normalmente., Se utilizó la prueba t pareada de Student para comparar los datos dentro de cada grupo de edad. El RBV del fumarato ferroso entre los grupos de edad se comparó utilizando la prueba t no apareada de Student. El análisis estadístico de potencia se realizó utilizando software comercial (StatMate 2; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Se utilizó la regresión lineal para evaluar la relación entre la absorción de hierro y los depósitos de hierro (representados por la ferritina sérica) y la correlación de Pearson para examinar la relación entre la ferritina sérica y el RBV.