la creación de una gráfica de contorno a partir de datos experimentales directos requiere el uso de un método factible de alto rendimiento y un número considerable de muestras. El ensayo, por lo tanto, tiene que ser adecuado para su uso en un diseño de placa de 96 pocillos., Las ventajas generales de esta miniaturización de tubos de reacción simple a placas de 96 pocillos ya se han demostrado para el DNSA y otros ensayos colorimétricos . Todos los Ensayos utilizados en este estudio fueron adecuados para el formato de placa de 96 pocillos. Para producir una gráfica de contorno, las mezclas de enzimas y sustratos se incubaron a ocho niveles de pH diferentes. Esos ocho niveles de pH se incubaron a 12 temperaturas diferentes utilizando un ciclador de gradiente PCR, lo que resultó en 96 condiciones de reacción únicas. Se utilizó un lector de placas para obtener los datos., Los resultados se transformaron en actividades relativas con la actividad más alta en cada placa se estableció en 100%. La medición se realizó por triplicado y los valores promediados se transformaron posteriormente en una gráfica de contorno utilizando SigmaPlot, como se describe en la sección materiales y métodos. La actividad (eje z) se representa como color de púrpura a rojo en lugar de un eje normal para mejorar la vista del gráfico de contorno.,
sistema tampón
un requisito previo para la determinación fiable del pH y la temperatura óptima es un sistema tampón estable que sea adecuado con respecto a la actividad enzimática y casi resistente a un cambio de pH con el aumento de la temperatura. Alternativamente, este efecto podría ser considerado en la gráfica de contorno. La influencia de la temperatura sobre el pKa de los tampones y por lo tanto el pH es un hecho que debe tenerse en cuenta, especialmente para tampones alcalinos como Tris ., Como requisito para el ensayo, se probaron todas las variaciones de pH de nuestro sistema tampón citrato–fosfato para detectar cambios en el pH entre 35 ° C y 80 °c (Ver archivo adicional 4). Todos los tampones muestran una ligera disminución del pH con el aumento de la temperatura, y los tampones a valores de pH más altos muestran desviaciones más altas. La dependencia de la temperatura aumenta con la cantidad de fosfato, que se correlaciona con los coeficientes de temperatura de fosfato (− 0.0028) y citrato (0)., Dado que las variaciones de pH dependientes de la temperatura de todos los tampones eran solo menores, podrían ser descuidadas en la compilación de las gráficas de contorno dentro del rango de valores utilizados aquí. Sin embargo, si se debe utilizar otro sistema tampón con un coeficiente de temperatura más alto, es fácilmente posible adaptar la gráfica de contorno para el cambio en el pH asignando a cada tampón un pH individual a cada temperatura., Estos valores se determinan experimentalmente como se describe en la sección de materiales y métodos respectivos o se derivan de los coeficientes de temperatura y, en consecuencia, se pueden utilizar para adaptar el eje x (pH) del archivo Sigmaplot proporcionado.
determinación del rango de actividad para Cel8A
en la tabla 1 se presenta una visión general de las diferentes enzimas, sustratos y Ensayos utilizados en este estudio para la creación de las respectivas gráficas de contorno.,
Cel8A es una celulasa, más específicamente una endo-glucanasa, de C. thermocellum y fue la primera enzima de glucósido hidrolasa familia 8 con una estructura de cristal resuelto . En este estudio, la enzima se incubó con BBG para validar nuestro método propuesto utilizando el ensayo DNSA. Se ha notificado que Cel8A tiene una temperatura óptima a 75 ° C y un pH óptimo entre 5,5 y 6,5 ., Estos valores están de acuerdo con los resultados de nuestra gráfica de contorno, ya que están dentro de la región de > 90% de actividad (Fig. 1). Nuestra gráfica de contorno, sin embargo, muestra que la enzima es altamente activa bajo una amplia gama de condiciones diferentes. La enzima exhibe actividades aceptables a valores de pH más bajos cuando está entre 60 ° C y 65 °C y también realiza con más del 60% de su actividad máxima cuando está en valores de pH por debajo de 4.5. Nuestro método proporciona los medios para visualizar tales efectos y evaluar el rendimiento de una enzima en cualquier punto dentro de los parámetros probados de un vistazo.,
gráfico de contorno de Cel8A utilizando el ensayo DNSA con cebada-β-glucano como sustrato
para probar si nuestro método es adecuado para diferentes métodos de ensayo de hidrolasa, se produjo una gráfica de contorno utilizando cel8a con AZO-cm-celulosa como sustrato y el ensayo respectivo (fig. 2). La gráfica muestra un óptimo similar a 75 ° C y pH 5.5. Sin embargo, el uso de Azo-CM-celulosa como sustrato resultó en un rango de actividad ligeramente menor., Las diferencias menores entre los dos ensayos podrían deberse a las diferentes estructuras y tipos de enlace de ambos sustratos, por lo que difieren en sus propiedades de unión a la enzima. Azo-CM-cellulose es un substrato no-natural con los grupos añadidos del tinte, que podrían añadir más lejos a este efecto. Usando Cel8A, pudimos demostrar que nuestro método proporciona datos válidos y es adecuado para su uso en dos ensayos diferentes establecidos para hidrolasas: DNSA y azo-CM-cellulose.
gráfico de contorno de Cel8A utilizando Azo-CM-cellulose
determinación del rango de actividad para Celluclast®
Además de una sola enzima, se estudió una mezcla de enzimas. Celluclast ® es un producto de celulasa comercial ampliamente utilizado derivado de Trichoderma reesei. Se compone principalmente de celobiohidrolasas y Endo-1,4-β-glucanasas, pero también cuenta con xilanasas y al menos una β-xilosidasa . El manual del producto indica que las actividades óptimas están entre 50 ° C y 60 °C y pH 4.,5 y 6.0 . En este trabajo, PRIMERO producimos una gráfica de contorno para Celluclast ® con BBG como sustrato utilizando el método DNSA (Fig. 3). La gráfica de contorno BBG se verificó mediante una curva de temperatura estándar (Fig. 4). Los resultados de la curva de temperatura a pH 5,5 están de acuerdo con los resultados de la gráfica de contorno, mostrando el mismo rango de actividad. Sin embargo, la medición de curvas separadas es inadecuada para describir la actividad de Celluclast® en BBG. El rango de pH en el que la mezcla enzimática muestra una alta actividad depende en gran medida de la temperatura., Cuanto mayor sea la temperatura, menor será el pH para lograr una alta actividad. Alrededor de 45 °C, Celluclast® es altamente activo (> 60%) hasta un pH de 6,5, mientras que a 65 °C, es altamente activo solo hasta un pH de 5,0. Por lo tanto, describir la actividad con dos curvas separadas depende estrictamente del valor elegido como parámetro estático. Los gráficos de temperatura, por ejemplo, aquellos tomados en los dos extremos del rango de pH indicado (4.5 y 6.0) deberían dar resultados significativamente diferentes. Lo mismo se aplica a los gráficos de pH tomados a diferentes temperaturas., Para hacer evidente este efecto, se produjeron gráficos de pH estándar a 45 ° C, 55 °C y 65 °C (Fig. 5). Estas tres curvas de pH muestran que, con el aumento de la temperatura, el borde de pH para una actividad alta cambia a valores de pH más ácidos. Las tres curvas verifican así los resultados vistos en la gráfica de contorno. Además, muestran las limitaciones de la determinación convencional de la actividad separada, que al menos para Celluclast® es, en el caso de las curvas de pH, dependiente de la temperatura elegida., El uso de nuestro método de trazado de contornos evita este problema completamente midiendo el efecto de la temperatura y el pH en un solo paso.
el gráfico de Contorno de Celluclast® con la DNSA ensayo con cebada-beta-glucano como sustrato
Convencional temperatura óptima determinación de Celluclast® a pH 5.0., La temperatura óptima de Celluclast ® en cebada-β-glucano se determinó a pH 5.0. El enfoque convencional muestra la actividad máxima de alrededor de 55 °C y está en conformidad con los resultados observados en el gráfico de contorno correspondiente
Convencional pH óptimo determinación de Celluclast® a tres temperaturas. El pH óptimo de Celluclast ® en el β-glucano de cebada se determinó a 45 ° C, 55 ° C y 65 °C., A temperaturas más bajas, la enzima puede tolerar valores de pH más altos. Esto está de acuerdo con la gráfica de contorno correspondiente y muestra el fuerte impacto del parámetro fijo elegido al determinar el pH o la temperatura óptima por separado
el rango de actividad de Celluclast® en arabinoxilano (AX) (Fig. 6) difiere de la que tiene BBG como sustrato. La actividad se desplaza notablemente hacia temperaturas más bajas, sin actividades altas observadas por encima de 60 °C., Como Celluclast ® es una mezcla de varias enzimas, es muy probable que estas diferentes enzimas tengan características diferentes. Sin embargo, el patrón de actividad es similar al de BBG; por ejemplo, a pH 4.5, La mezcla enzimática es altamente activa hasta casi 60 °C, mientras que a pH 6.5, solo es altamente activa hasta 50 °C. en la literatura, el óptimo de Celluclast® en AX soluble en trigo se determinó mediante un modelo de superficie de respuesta (RSM) y se encontró que estaba alrededor de pH 4.4 y 39 °C., Nuestra gráfica de contorno muestra la actividad más alta en el mismo rango de temperatura y a un pH ligeramente más alto, que todavía está dentro del óptimo determinado por el RSM. Mientras que el óptimo es casi el mismo para ambos métodos, nuestra gráfica de contorno muestra sorprendentemente la actividad exacta de Celluclast ® en AX dentro de todo el rango de las condiciones probadas y exhibe una disposición más detallada que el RSM. Con nuestras gráficas de contorno de Celluclast ® en BBG y AX, pudimos demostrar que las mezclas enzimáticas complejas pueden ser analizadas con el método propuesto.
gráfico de contorno de Celluclast® utilizando el ensayo DNSA con arabinoxilano como sustrato
para demostrar aún más la versatilidad de nuestra determinación del rango de actividad, se evaluó su uso con sustratos y ensayos adicionales. Se probó la actividad de Celluclast® sobre el P-NP-β-D-glucopiranósido y la gráfica de contorno se muestra en la Fig. 7. La alta actividad en este sustrato se limita a un rango bastante estrecho entre pH 4.0 a 5.5 y 55 ° C a 70 °C., Esto sugiere que solo una o unas pocas enzimas dentro de la mezcla de enzimas Celluclast® probablemente muestran actividad hacia p-NP-β-D-glucopiranósido. los glucósidos de p-NP se pueden utilizar como sustratos para la preparación de gráficos de contorno. Sin embargo, no todos los glucósidos de p-NP son sustratos adecuados en el ensayo, ya que varios de ellos muestran un fondo alto debido a la inestabilidad (Ver archivo adicional 5), especialmente cuando se combinan altas temperaturas con altos valores de pH.
contour plot of Celluclast® using P-NP-β-D-glucopiranoside
para probar la aplicación de nuestro método en una muestra de biomasa natural, elegimos utilizar un sustrato a base de paja. La liberación de glucosa por Celluclast ® se detectó mediante el ensayo comercial D-glucosa HK (Megazyme). El componente principal en la pared celular de la paja es la celulosa, que es la principal fuente de glucosa liberada enzimáticamente. La gráfica de contorno (Fig., 8), por lo tanto, muestra predominantemente la actividad de Celluclast® sobre la celulosa cristalina, que es recalcitrante hacia la degradación enzimática . La mayor liberación de glucosa se observó a un pH aproximado de 4,0 a 5,5 y de 40 ° C a 60 °C. el rango con alta actividad es, por lo tanto, menos amplio que el determinado para BBG, que debe tenerse en cuenta para un proceso destinado principalmente a degradar la celulosa., Con el uso de D-glucosa HK y P-NP-β-D-glucopiranósido como ensayos alternativos, podríamos demostrar la adaptabilidad de nuestro método a un total de cuatro ensayos de glicósido hidrolasa diferentes y comúnmente utilizados. El uso de paja mostró que nuestro método también es adecuado para sustratos naturales de relevancia industrial y podría ser utilizado para la evaluación de procesos y sustratos complejos. Celluclast ® muestra diferentes perfiles de actividad en diferentes sustratos., Colectivamente para todos los métodos, es, por lo tanto, crucial determinar los datos de pH y rango de temperatura de una enzima con el sustrato de interés.
gráfico de contorno de Celluclast® utilizando el ensayo d-glucosa HK con un sustrato natural a base de paja
consideraciones al usar el método
cuando se produce una gráfica de contorno con el método propuesto, hay varias consideraciones que deben tenerse en cuenta., El sustrato tiene que ser estable y el fondo medido reproducible en toda la gama de condiciones en la placa de 96 pocillos. Esto es un requisito previo, ya que el control del sustrato debe restarse de todos los valores antes de la conversión en actividades relativas, pero no puede medirse directamente en la placa para cada una de las 96 condiciones. Varios sustratos de glucósidos de p-NP, por ejemplo, no se pueden usar, ya que muestran un fondo altamente dependiente de la temperatura y el pH. Es necesario un pipeteo muy preciso para obtener niveles aceptables de desviación estándar de los triplicados., Se recomienda encarecidamente el uso de pipetas de 96 cabezales y 8 canales, ya que mejoran significativamente la precisión y aceleran el procedimiento. Además, el lector de placas y el ciclador de PCR de gradiente son requisitos técnicos para ejecutar el método correctamente. El rango de temperatura en el que se puede realizar el método se puede adaptar de acuerdo con las propiedades técnicas del ciclador de PCR de gradiente, que generalmente está limitado a 30 °C o 40 °C y a menudo no puede incluir valores por debajo de 20 °C., Convertimos directamente la absorbancia en actividad relativa de una enzima, porque todos los valores están en una curva de calibración lineal (no se muestran los datos). Sin embargo, si ese no es el caso, la actividad debe calcularse primero, por ejemplo, en U/mg, y estos valores se pueden usar para producir el gráfico de contorno. Cuando se quiere producir una gráfica de contorno para una enzima que es fuertemente dependiente de iones metálicos divalentes, se debe usar un sistema tampón diferente, ya que los tampones a base de citrato–fosfato complejan esos iones.,
mientras que los enfoques RSM son una herramienta indiscutiblemente poderosa para evaluar relaciones complejas, por ejemplo, diversas variables que afectan a múltiples factores, determinar el efecto de solo pH y temperatura en la actividad no es demasiado complejo para ser alcanzado por medición directa. La determinación de los valores de borde correctos del modelo puede tomar varios enfoques y puede influir en el modelo resultante. El modelo RSM se deriva de solo un pequeño número de mediciones alrededor del punto central de la actividad de la enzima y la precisión hacia los valores experimentales reales tiene que ser probada después., La resolución global del RSM es, por lo tanto, inferior a la obtenida con nuestro método, lo que dificulta ver los efectos de la actividad como se muestra para Celluclast® a temperaturas y/o valores de pH más altos. Nuestro método no requiere la capacidad de diseñar modelos estadísticos complejos y se puede realizar con requisitos técnicos mínimos y relativamente estándar. Un inconveniente que tanto nuestro método como RSM comparten es que la visualización directa de la desviación estándar dentro de la gráfica tridimensional no es posible., Sin embargo, nuestro método permite el cálculo de la desviación estándar para cada punto de datos individual. La mayoría de los modelos RSM determinan la desviación estándar para todo el modelo solo a partir de los datos del punto de datos central del modelo, mientras que los otros puntos de datos solo se miden una vez . Las desviaciones estándar son naturalmente más altas en los bordes de la actividad de una enzima e ilustran un fuerte impacto en la actividad dentro de un ligero cambio de condiciones. Alrededor del óptimo y dentro de áreas de actividad nula o baja, las desviaciones son significativamente menores., Dado que el método propuesto da como resultado un conjunto completo de datos factoriales, sería posible calcular un modelo estadístico si fuera necesario para un análisis posterior. El modelo estadístico derivado se basaría directamente en datos experimentales, pero es un paso adicional que no debería ser necesario para las aplicaciones estándar del método.
En resumen, la fácil evaluación de la idoneidad de una enzima o una mezcla enzimática para una combinación de parámetros de proceso es de crucial importancia cuando se diseñan procesos biotecnológicos a escala de laboratorio o industrial., La temperatura y el pH son dos de los factores de proceso más importantes que influyen en la actividad enzimática. Los enfoques convencionales para probar el efecto de esos factores sobre las enzimas se basan en la suposición de que existe una correlación bidimensional entre la temperatura y la actividad, así como el pH y la actividad. En contraste, los nuevos enfoques determinan la relación en materia tridimensional, pero están basados en estadísticas, son complejos de diseñar y su precisión con los datos reales puede variar., El método introducido aquí, por otro lado, permite la determinación rápida y fácil del efecto que la temperatura y el pH tienen sobre la actividad de la enzima simultáneamente utilizando placas de 96 pocillos, pipetas multicanal y un ciclador de PCR de gradiente. Con este equipo técnico básico, es posible producir diagramas de contorno de pH, temperatura y actividad que se basan directamente en datos experimentales. El método se probó para varios ensayos de glucósido hidrolasa generalizados, así como sustratos complejos y modelos.