recolección y procesamiento de sangre
todos los procedimientos que involucraron la recolección de sangre humana de voluntarios sanos estuvieron de acuerdo con el Comité de Ética en investigación humana de la Universidad de Sydney (aprobación HREC 2014/244) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los individuos., Todos los procedimientos que involucraron la recolección de sangre humana de pacientes con ECMO estuvieron de acuerdo con la ética del Hospital Alfred, Comité Permanente de Investigación en humanos de la Universidad de Monash (aprobación 388/13) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los individuos. Todos los procedimientos se ajustaban a la Declaración de Helsinki de 1983. La sangre fue recolectada por venesección usando una aguja de Terumo de mariposa de 21 g de 10 donantes sanos sin medicamentos (cuatro hombres, seis mujeres, 22-58 años)., Los primeros 5 mL de sangre se desecharon para evitar cualquier trombina que pudiera haberse generado alrededor del lugar de inserción de la aguja y luego se introdujeron en tubos que contenían citrato de sodio al 3,2% v/V. La sangre de ocho pacientes en un solo centro que tenían soporte ECMO (cuatro hombres, cuatro mujeres, 34-67 años de edad) se extrajo en tubos ACD-A (BD Vacutainer)., Los pacientes con apoyo ECMO recibieron medicamentos anticoagulantes y / o antiplaquetarios basados en la discreción de los médicos o las directrices institucionales donde los pacientes generalmente comenzaron con warfarina, el índice internacional normalizado (INR) objetivo 2-3, con infusión de heparina en puente y terapia con aspirina, así como dipiridamol para aquellos que se consideran de alto riesgo de trombosis. El Plasma se preparó por centrifugación doble a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente., En algunas ocasiones, el plasma sano del donante fue esquilado a velocidades de 2000 s−1 o 10000 s−1 durante 5 min a temperatura ambiente utilizando un reómetro Kinexus pro+.
colección de fibrinógeno de hepatocitos
La línea celular de cáncer de hígado humano HepG2 (ATCC, HB-8065) se cultivó en DMEM, suero fetal al 10% y glutamax al 5% de CO2 y 37 °C. Las células a la confluencia del 80-90% se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se incubaron durante 18 h en DMEM sin suero al 5% de CO2 y 37 °C o en una cámara hipóxica al 1% de O2, 5% de CO2 y 37 °C., Se recogió el medio acondicionado (1 mL por 4 × 106 células) y el fibrinógeno secretado se procesó inmediatamente como se describe a continuación.
ensayos de fibrinógeno y fibrina
Las muestras plasmáticas no fueron tratadas o incubadas con trombina y / o el inhibidor de polimerización de fibrina, Gprp (Sigma). La fibrina se preparó en 1 mL de plasma mediante la adición de 50 unidades de trombina bovina (Sigma) y CaCl2 y MgCl2 de 10 mM durante 40 min a 22 °C. Los polímeros de fibrina se recogieron utilizando una varilla de plástico., En un experimento, se incubó plasma (2 mL) con 27 unidades/mL de trombina y CaCl2 y MgCl2 de 10 mM durante 40 min a 22 °C, y el polímero de fibrina se recogió en una varilla de plástico y se retiró. El plasma agotado se incubó con otra alícuota de 27 unidades/mL de trombina y se recogió y retiró el nuevo polímero de fibrina. Se muestreó una alícuota de plasma (0,2 mL) antes y después de la adición de ambos lotes de trombina, 150 µM de D-fenilalanil-prolil-arginil clorometilcetona (PPACK, Sigma) añadida para inhibir la actividad de la trombina y las muestras se incubaron durante 16 h a 22 °C., El contenido de fibrinógeno de las muestras plasmáticas se estimó recolectando la proteína en perlas policlonales recubiertas de anticuerpos antifibrinógeno (ver sección siguiente), resolviendo el fibrinógeno en la SDS-PAGE y tinción con Coomassie coloidal. En otro experimento, se incubó plasma con Gprp de 8 mM (Sigma) durante 5 min a 22 °C antes de agregar 50 unidades/mL de trombina durante 60 min a 22 °C. La reacción se apagó con 150 µM de PPACK durante 10 min a 22 °C. Los fibrinógenos purificados se aislaron de plasma fresco congelado de donantes sanos mediante precipitación de β-alanina32 u obtenidos comercialmente (Sigma F4883).,
cuantificación de los Estados redox de los enlaces fibrinógeno y disulfuro de fibrina
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) se recubrieron con 16 µg de anticuerpos antifibrinógeno policlonales (Dako, Cat A0080, lote 00015063) en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato en una rueda giratoria durante 1 h a 22 °C y el exceso de anticuerpo se eliminó lavando tres veces con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato. Se incubó plasma (0,7 mL) o medio acondicionado HepG2 (4,5 mL) con los 2 mg de perlas recubiertas en una rueda giratoria durante 1 h a 22 °C., Los granos fueron recolectados usando un imán, el exceso de plasma aspirado Para reducir el volumen, e incubados en 0.3 mL de 5 mM 12C-IPA en solución salina tamponada con fosfato que contiene 10% DMSO durante 1 h a 22 ° C En la oscuridad para alquilar tioles Cys no emparejados en las proteínas. Los sobrenadantes fueron aspirados, y las perlas incubadas con nupage LDS sample buffer (Life Technologies) conteniendo otros 5 mM 12C-IPA durante 30 min a 60 °C. los sobrenadantes fueron resueltos en SDS-PAGE., Los polímeros de fibrina generados en plasma se recolectaron en una varilla de plástico y se sumergieron inmediatamente en 1 mL de 12C-IPA de 5 mM en solución salina tamponada con fosfato que contenía DMSO al 10% durante 1 h a 22 °C En la oscuridad. La fibrina se lavó 3 veces con solución salina tamponada con fosfato antes de disolver el polímero en 1 mL de ácido acético de 20 mM durante 24 h a 22 °C. veinte microlitros de la solución se incubaron con nupage LDS sample buffer (Life Technologies) conteniendo 5 mM 12C-IPA durante 30 min a 60 °C y las proteínas se resolvieron en SDS-PAGE., El fibrinógeno purificado (12 µg) se incubó con 12C-IPA de 5 mM en solución salina tamponada con fosfato que contenía DMSO al 10% durante 1 h a 22 °C En la oscuridad y la proteína se resolvió en SDS-PAGE.
los geles SDS-PAGE fueron teñidos con coomassie coloidal (Sigma) y las bandas de fibrina(ogen) extirpadas, desteñidas, secadas, incubadas con ditiotreitol de 40 mM y lavadas14. Las rodajas de gel se incubaron con 5 mM 13C-IPA (isótopos de Cambridge) durante 1 h a 22 °C En la oscuridad para alquilarel enlace disulfuro Cys, lavado y secado antes de la digestión de las proteínas con 12.,5 ng / µL de tripsina (Promega) en 25 mM NH4CO2 durante la noche a 25 °C. Los péptidos se elutaron de las rodajas con ácido fórmico al 5%, acetonitrilo al 50%. La cromatografía Nano-líquida (nano-LC) se realizó utilizando un último 3000 HPLC y el sistema de muestreador automático (Dionex). Las muestras se inyectaron en una columna nano-LC sin frituras (75 µm x ~12 cm) que contenía medios C18 (1,9 µm, 120 Å ReproSil-Pur 120 C18-AQ, Dr Maisch GmbH) y se calentaron a 45 °C para todas las tiradas. Los péptidos se elutaron utilizando un gradiente lineal de más de 52 min, a un caudal de 0,2 µL / min. La fase móvil A consistió en 0.,1% de ácido fórmico en H2O, mientras que la fase móvil B consistió en acetonitrilo:H2O (8: 2) con 0,1% de ácido fórmico. El gradiente fue: 0 min 2% B; 4 min 2% B, 36 min 45% B, 37 min 80% B, 37.5 min 80% B, 39 min 2% B y 52 min 2% B. Se aplicó alta tensión (2000 V) a un tee de bajo volumen (Upchurch Scientific) y la punta de la columna se posicionó a ~0.5 cm del capilar calentado (T = 275 °C) de un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron). Los iones positivos se generaron por ionización de electrospray y el espectrómetro de masas operó en modo de adquisición dependiente de datos., Los espectros MS de exploración completa fueron adquiridos (m/z 350-1750) por el Orbitrap a una resolución de 30.000. Los 15 iones más abundantes (>5000 recuentos) con estados de carga ≥ +2 fueron aislados secuencialmente y fragmentados dentro de la trampa de iones lineal usando disociación inducida colisionalmente con una activación q = 0.25 y un tiempo de activación de 10 ms a un valor objetivo de 30.000 iones. Las relaciones M / z seleccionadas para MS / MS se excluyeron dinámicamente para 35 S. Ion Trap Zoom AGC objetivo: 3000.00. Trampa de iones objetivo AGC completo: 30000.00. Trampa de iones SIM AGC objetivo: 10000.00. Trampa de iones MSn AGC objetivo: 10000.00., Los datos fueron analizados usando Mascot Daemon (Versión 2.5.0, Matrix Science) contra la base de datos Swissprot. Los parámetros de búsqueda fueron tolerancia al precursor de 6 ppm y tolerancias de iones del producto de ±0.6 Da, y derivado de iodoacetanilida (Cys), derivado de iodoacetanilida 13C (Cys), oxidación (Met) seleccionados como modificaciones variables con escisión triptica completa de hasta tres escisiones perdidas. Con la lista de péptidos que contienen cisteína identificados mediante Mascot, su relación masa/Carga monoisotópica (m/z) de +2, +3 y +4 se calcula utilizando MS-Product (Versión v 6.2.2, Protein Prospector Tools)., Cys Etiquetados con 12C-IPA o 13C-IPA tiene una masa de 133.05276 o 139.07289, respectivamente. Se analizaron treinta péptidos que contenían Cys (tablas suplementarias 1 y 2). Las diferentes formas redox de los residuos de Cys se cuantificaron a partir de la abundancia iónica relativa de péptidos Etiquetados con 12C-IPA y/o 13C-IPA. Para calcular la abundancia iónica de péptidos, se generaron cromatogramas iónicos extraídos utilizando Xcalibur Qual Browser (v2.1.0; Thermo Scientific). El área se calculó utilizando la función automática de detección de picos integrada en el software., Los datos se buscaron rutinariamente para péptidos que contenían tioles CYS libres y estos no se detectaron, lo que indica que la alquilación de residuos de Cys no emparejados por 12C-IPA o 13C-IPA fue completa en la proteína.
análisis de péptidos ligados a disulfuro de fibrinógeno
se incubó plasma de donante sano (0,7 mL) con Dynabeads policlonales recubiertos con anticuerpos antifibrinógeno en una rueda giratoria durante 1 h a 22 °C. Se recogieron las perlas, se aspiró el exceso de plasma y se añadieron 0,3 mL de 12C-IPA de 5 mM en solución salina tamponada con fosfato que contenía DMSO al 10% y se incubaron durante 1 h a 22 °C En la oscuridad., Luego se aspiró el sobrenadante, las perlas se incubaron con tampón de muestra NuPAGE LDS durante 30 min a 60 ° C y los sobrenadantes se resolvieron en SDS-PAGE. Las rodajas de Gel que contenían fibrinógeno se lavaron y secaron antes de la digestión con 12 ng/µL de tripsina (Promega) durante 4 h a 37 °C. Las reacciones se detuvieron añadiendo ácido fórmico al 5% (v/v) y péptidos eluidos de las rodajas de gel con ácido fórmico al 5% y acetonitrilo al 50% (v/v). Péptidos en 0.,El ácido fórmico al 1% (volumen final 12 µL) se resolvió en una columna analítica de fase inversa C18 de 35 cm × 75 µm utilizando un gradiente de acetonitrilo del 2-35% durante 22 min a un caudal de 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) y se analizó en un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap Velos como se describió anteriormente. Los péptidos ligados a disulfuro se buscaron contra la secuencia de fibrinógeno humano utilizando un software de análisis Byónico (Versión 3.9-7, Protein Metrics) con una tasa de descubrimiento falsa del 1%. Todos los péptidos ligados a disulfuro fueron inspeccionados manualmente para verificar su precisión., La tolerancia de masa del Precursor y la tolerancia del fragmento se fijaron en 10 ppm y 0.6 Da, respectivamente. Las modificaciones variables se definieron como Met oxidada, Cys oxidados (mono, di y tri) y CYS glutationilados con escisión completa de tripsina de hasta tres escisiones perdidas.
ensayo de funcionalidad del fibrinógeno
el fibrinógeno purificado (0,2 mL de 10 mg / mL en Hepes de 50 mM, NaCl de 0,14 M, CaCl2 de 10 mM, pH 7,4) se incubó con 12C-IPA de 5 mM durante 1 h a 22 °C En la oscuridad para alquilar tioles Cys no pareados en la proteína., El IPA no reaccionado se eliminó utilizando una columna de desalinización de espín Zeba de 7 kDa MWCO (Thermo Fisher). Se incubó fibrinógeno o fibrinógeno-IPA (1,1 mg/mL en Hepes de 50 mM, NaCl de 0,14 M, CaCl2 de 10 mM, pH de 7,4) con 1 unidad/mL de trombina bovina (Sigma) durante 5 h a 22 °C En un volumen total de 0,2 mL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Los polímeros de fibrina se peletearon a 13.000 × g durante 15 min y se midió la concentración de fibrinógeno restante en el sobrenadante. La funcionalidad se expresa en el % de fibrinógeno consumido en la formación del polímero de fibrina.,
la formación de polímero de fibrina medida por dispersión de luz
se incubó fibrinógeno purificado o fibrinógeno-IPA (1 mg/mL en Hepes de 50 mM, NaCl de 0,14 M, CaCl2 de 10 mM, pH de 7,4) con 1 unidad / mL de trombina bovina (Sigma). El aumento de la absorbancia a 350 nm se registró cada 30 s durante 15 min.
estructura del polímero de fibrina medida por microscopía electrónica de barrido (SEM)
el fibrinógeno o fibrinógeno-IPA (1 mg/mL en 50 mM Hepes, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) se incubó con 1 unidad / mL de trombina bovina (Sigma) durante 2 h a 22 °C En un volumen total de 0,2 mL., Los polímeros de fibrina se enjuagaron dos veces con solución salina tampón fosfato (PBS) de 0,1 M, se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en PBS durante la noche a 4 °C, se fijaron con OsO4 al 1% en PBS, se deshidrataron con series graduadas de etanol y se secaron el siguiente punto crítico con una Leica EM CPD300. Las muestras fueron recubiertas con oro de 15 nm (K550x, Emitech) y fotografiadas con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Zeiss SigmaHD. Las micrografías SEM se registraron a una tensión de aceleración de 5 kV y una distancia de trabajo de 5 mm. los diámetros de las fibras se midieron mediante ImageJ.,
ensayo de permeación de polímero de fibrina
se incubó fibrinógeno o fibrinógeno-IPA (1 mg/mL en Hepes de 50 mM, 0,14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) con 1 unidad/mL de trombina bovina (Sigma) durante 2 h a 22 °C En un volumen total de 0,2 mL en columnas de cromatografía de polipropileno con un diámetro interno de 4,6 mm. las columnas se superpusieron con 0,8 mL de Hepes el tampón y el flujo (J) se calcularon a partir del peso de las gotas que se filtraron en 20 min. , La constante de permeación (Darcy) 33 se calculó a partir de la relación, Ks = Jaa/LP, donde J es el flujo (cm3/s), ƞ es la viscosidad del tampón (0.01 equilibrio a temperatura ambiente), A es la sección transversal del coágulo (0.17 cm2), L es la longitud del coágulo (1.1 cm), Y P es la presión hidrostática (1,018,218 dina/cm2).
ensayo de compactación del polímero de fibrina
el fibrinógeno o fibrinógeno-IPA (1 mg/mL en Hepes de 50 mM, NaCl de 0,14 M, CaCl2 de 10 mM, pH 7,4) se incubó con 1 unidad / mL de trombina bovina (Sigma) durante 16 h a 22 °C En un volumen total de 0,5 mL en 1.,Tubos de microcentrífuga de 5 mL previamente recubiertos con 10 mg/mL PEG-20000 en agua y secado al aire. Los polímeros de fibrina se centrifugaron a 13.000 × g durante 5 a 2.400 s y se midió el volumen del fluido extruido del polímero.
ensayo de fibrinólisis
se incubó fibrinógeno o fibrinógeno-IPA (1,8 mg/mL en Hepes de 50 mM, NaCl de 0,14 M, CaCl2 de 10 mM, pH de 7,4) con 1 unidad/mL de trombina bovina (Sigma) durante 2 h a 22 °C En un volumen total de 0,5 mL en placas de 24 pocillos (15,6 mm de diámetro) durante 2 h a 22 °C. plasmina (5 µl de 0.,59 µM) se añadió al centro de los pozos y las placas se incubaron durante 18 h a 37 ° C En un ambiente húmedo. Las áreas de lisis se determinaron a partir del promedio de dos diámetros medidos en ángulo recto.
cuantificación de los Estados redox de los enlaces disulfuro de α2-macroglobulina
los 10 plasmas de donantes sanos descritos anteriormente para el análisis del fibrinógeno se emplearon para el análisis de α2-macroglobulina utilizando los mismos procedimientos. Plasma (0.,7 mL) se incubaron con Dynabeads policlonales anti-α2-macroglobulina (Dako, Cat Q0102, lote 20068567) recubiertos (Life Technologies) en una rueda giratoria durante 1 h a 22 °C. Las perlas se recogieron, se aspiraron en exceso de plasma y se incubaron en 0,3 mL de 5 mM 12C-IPA en solución salina tamponada con fosfato que contenía 10% DMSO durante 1 h a 22 ° C En la oscuridad para alquilar tioles Cys no emparejados en las proteínas. Los sobrenadantes fueron aspirados, y las perlas incubadas con nupage LDS sample buffer (Life Technologies) conteniendo otros 5 mM 12C-IPA durante 30 min a 60 °C. los sobrenadantes fueron resueltos en SDS-PAGE., Los geles SDS-PAGE fueron teñidos con coomassie coloidal (Sigma) y la banda α2-macroglobulina extirpada, desteñida, secada, incubada con ditiotreitol de 40 mM y lavada14. Las rodajas de gel se incubaron con 5 mM 13C-IPA (isótopos de Cambridge) durante 1 h a 22 °C En la oscuridad para alquilarel enlace disulfuro Cys, se lavaron y secaron antes de la digestión de proteínas con 12,5 ng/µl de tripsina (Promega) en 25 mM NH4CO2 durante la noche a 25 °C. Los péptidos se elutaron de las rodajas con 5% de ácido fórmico, 50% de acetonitrilo., La cromatografía líquida, la espectrometría de masas y el análisis de los datos se realizaron según lo descrito para el fibrinogeno34. Se analizaron 17 péptidos que contenían Cys (tablas suplementarias 2 y 4). Las diferentes formas redox de los residuos de Cys se cuantificaron a partir de la abundancia iónica relativa de péptidos Etiquetados con 12C-IPA y/o 13C-IPA.
resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen de informes de Investigación de Nature vinculado a este artículo.