crecimiento y dinámica de nutrientes de Ochromonas sp.,, cepa bg-1
se cree que la Fagotrofia por flagelados fototróficos confiere ventajas ecológicas significativas a las algas que exhiben el comportamiento (Flynn y Mitra, 2009), pero también parece haber limitaciones (aunque en gran medida no caracterizadas) para llevar a cabo la nutrición mixta simultáneamente en una sola célula (Raven, 1997). Estas limitaciones pueden implicar costos o compensaciones para mantener maquinarias celulares duales (en comparación con competidores especializados), o tal vez una conversación cruzada entre las vías bioquímicas anabólicas y catabólicas que confunden el desempeño de ambas actividades simultáneamente., Desafortunadamente, no existe prácticamente información cuantitativa sobre los costos y beneficios del comportamiento mixotrófico, ni si ambos procesos son llevados a cabo secuencialmente o simultáneamente por estas especies. La partición Temporal podría ser un mecanismo para mantener ambas habilidades en celdas diminutas (aunque poniendo un proceso ‘en espera’ en un momento dado)., Evaluar si ambos comportamientos ocurren simultáneamente, el beneficio fisiológico específico(S) para la nutrición heterotrófica en algas mixotróficas y la respuesta de este comportamiento a variables abióticas y bióticas son aspectos de la nutrición mixotrófica que han sido difíciles de establecer utilizando enfoques y métodos tradicionales.
estudiamos el crisófito mixotrófico Ochromonas sp., cepa BG – 1 porque se puede cultivar en cultivo axénico (libre de bacterias) y se ha informado previamente que es un organismo predominantemente heterotrófico que alcanza altas tasas de crecimiento solo en presencia de bacterias (Sanders et al., 2001). El crecimiento en el cultivo axénico evitó potencialmente complicar las interacciones biológicas y los flujos elementales resultantes de las actividades de otros microorganismos vivos en los cultivos, lo que permitió una comparación entre nanosimos y mediciones de IRMS a granel y una mejor comprensión de las fuentes específicas de carbono y nitrógeno utilizadas para el crecimiento por el alga.,
Además, el uso de una sola fuente inorgánica de nitrógeno simplificó nuestro diseño experimental de modo que las únicas fuentes de nitrógeno en el medio eran amonio o HKB. Las algas generalmente poseen mecanismos para la absorción y asimilación de amonio y nitrato, pero los datos transcriptómicos indican que algunos crisófitos, incluyendo Ochromonas sp. la cepa BG-1, podría estar perdiendo la capacidad genética para la asimilación de nitratos (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Además, el tampón MES no se añadió al medio en nuestros experimentos porque esto podría haber proporcionado una fuente alternativa de nitrógeno. El MES también podría haber constituido una fuente de carbono orgánico para el alga (Sanders et al., 2001), y su eliminación garantizó que las únicas fuentes de carbono en el medio fueran bicarbonato o HKB. El análisis transcriptómico de experimentos realizados de la misma manera que los presentados en este manuscrito muestran que la maquinaria fotosintética de Ochromonas sp. la cepa BG – 1 se expresa y se regula al alza en presencia de luz (Lie et al., 2017)., Este enfoque simplificado, combinado con el etiquetado de isótopos estables, nos permitió determinar qué Fuente(s) de nitrógeno y carbono fueron utilizados para el crecimiento por el alga.
Las tasas de crecimiento significativas de Ochromonas en el presente estudio se alcanzaron solo mientras que los HKB eran abundantes como presa (figura 1a). La dinámica de Chl a en el cultivo también reflejó las altas tasas de crecimiento debido al pastoreo en HKB, ya que la concentración de CHL a célula−1 disminuyó en un orden de magnitud durante las primeras 48 h de incubación para los cultivos cultivados en la luz y en la oscuridad continua (figura 1D)., Estos cambios en la clorofila celular podrían estar relacionados con una dilución de Chl a dentro de las células debido a las altas tasas de crecimiento del alga (Hansen et al., 2000), de modo que la reducción de la célula Chl a−1 fue consecuencia del rápido crecimiento del alga y no de una reducción directa de la tasa de biosíntesis de la clorofila. Sin embargo, también es posible que haya alguna regulación de la biosíntesis de clorofila cuando HKB estaban presentes, ya que el análisis transcriptómico de esta alga sugiere una regulación ascendente de los genes relacionados con la síntesis de clorofila en presencia de luz cuando HKB se agotaron (Lie et al., 2017)., En cualquier caso, estas observaciones están de acuerdo con estudios previos de Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001) que observó una capacidad heterotrófica bien desarrollada, lo que sugiere que la fijación de carbono y quizás otras estructuras celulares y procesos involucrados en la fotosíntesis se reducen cuando crecen mixotróficamente, como se observó para algunas otras algas (Wan et al., 2011).
amonio disuelto, así como fosfato, acumulado en los cultivos de Ochromonas durante las primeras 48 h de los experimentos, cuando HKB fueron pastados activamente (Figura 2)., Este resultado indica que el exceso de nitrógeno y fósforo del HKB pastado fue excretado por el alga. Los cálculos del balance de masas basados en los cambios en la abundancia de presas/algas y su contenido de nitrógeno celular indicaron que hasta el 50% del nitrógeno contenido en el HKB consumido fue asimilado por el alga, mientras que una cantidad considerable del exceso de nitrógeno fue liberada principalmente como amonio durante el período de pastoreo bacteriano activo (Figura 2)., Estos valores de asimilación de nitrógeno (y excreción) son consistentes con eficiencias de asimilación de protistas heterótrofos de tamaño similar (Taylor, 1982; Caron y Goldman, 1990), consistentes con la conclusión de que Ochromonas estaba creciendo predominantemente como heterótrofo cuando las presas eran abundantes. Además, los análisis transcriptómicos han demostrado que diferentes transportadores de amonio son expresados por Ochromonas sp. la cepa BG-1 crece en HKB en comparación con el crecimiento después de que las bacterias han sido pastadas a abundancias muy bajas(Lie et al., 2017)., Por lo tanto, parece que los transportadores para la exportación de amonio fuera de la célula pueden ser diferentes de los utilizados para la absorción de amonio, como se ha observado para otros organismos (Shnaiderman et al., 2013).
curiosamente, las concentraciones de amonio, pero no de fosfato, disminuyeron en el medio una vez que el HKB había sido eliminado por pastoreo (es decir, después de 48 h; Figura 2) cuando Ochromonas se cultivó en la luz., Este resultado parece indicar que el alga absorbió activamente amonio (pero no fosfato) del medio cuando las bacterias ya no estaban disponibles y se indujo la fotosíntesis (figura 1D). En contraste, tanto el amonio como el fosfato en los cultivos cultivados en la oscuridad continuaron aumentando a lo largo del experimento (líneas punteadas en la Figura 2). No se produjo un crecimiento significativo de la población neta de algas después del agotamiento de la presa, incluso a la luz, y la explicación de la dicotomía en la absorción de estos dos elementos no está clara., Especulamos que el amonio fue tomado porque fue específicamente requerido para reconstruir la maquinaria fotosintética de la célula.
la aparición continua de fosfato en el medio de cultivo durante la parte posterior de los experimentos contrasta con los estudios de algunas otras especies de Ochromonas que han reportado una absorción de fosfato cuando el alga está creciendo autotróficamente (Rothhaupt, 1996)., La falta de absorción de fosfato por la cepa BG-1 podría indicar que esta Ochromonas era incapaz de absorción efectiva de fosfato (lo que también podría explicar, en parte, la pobre capacidad de crecimiento fototrófico de esta cepa), o que el fósforo no era necesario en cantidades significativas para la reorganización celular asociada con el cambio a crecimiento fototrófico, y por lo tanto la absorción no fue estimulada por el cambio a fototrofia., Es poco probable que los aumentos continuos en la concentración de fosfato se deban a la descomposición de compuestos orgánicos de fósforo disueltos en el medio porque los cultivos no tenían bacterias vivas.
las inferencias de experimentos de sondeo de isótopos estables
el análisis de isótopos estables (nanosimios y análisis elemental a granel-IRMS) reveló que tanto los sustratos inorgánicos (13C-bicarbonato y 15N-amonio) como los HKB marcados con 13C / 15N fueron asimilados por Ochromonas, contribuyendo al enriquecimiento celular de 15N y 13C después de 48 h de incubación (Figura 4)., Sin embargo, la magnitud del enriquecimiento a partir de sustratos inorgánicos o HKB indicó que, durante el crecimiento mixotrófico, las fuentes primarias de carbono y nitrógeno se derivaron de la fagotrofia. El balance de masa isotópica indicó que el 88-95% del nitrógeno y el 84-99% del carbono se derivaron de HKB cuando Ochromonas crecía mixotróficamente en la luz. Se observó un enriquecimiento de 13C en algas cultivadas en la luz en comparación con la oscuridad (Experimento 1 vs Experimento 3) cuando se disponía de bicarbonato de 13C (Figura 4)., Sin embargo, la contribución calculada de la fijación fotosintética de carbono fue solo del 1-10% del carbono asimilado a la biomasa. La mayor eficiencia de la incorporación de nitrógeno de la presa observada en la luz en relación con la oscuridad continua (Figura 3; experimentos 1, 2 vs Experimento 3) sugiere que la luz jugó un papel, aunque menor, en la eficiencia fagotrófica del alga., Por lo tanto, a pesar de supuestas reducciones en la maquinaria fotosintética de Ochromonas que crecen fagotróficamente en HKB (como lo demuestran las bajas cuotas celulares de Chl a; figura 1D), la luz tuvo un impacto menor y positivo en la nutrición de las algas. Debido a que la cantidad de carbono fijada por la fotosíntesis representaba una pequeña fracción de carbono asimilado por el alga al crecer en HKB, especulamos que el aparato fotosintético podría proporcionar energía en lugar de carbono para el material celular, como se ha hipotetizado para Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
nuestros cálculos de balance de masa isotópica tienen dos advertencias. En primer lugar, no controlamos la evolución del pH dentro de los cultivos, lo que habría dado una mejor comprensión del equilibrio de carbonato que podría haber sido afectado por la respiración y la fijación de carbono, y el intercambio con la atmósfera. Como tal, nuestra estimación basada en los experimentos con carbono inorgánico etiquetado podría haber subestimado la cantidad de carbono inorgánico fijada por Ochromonas sp. BG-1 (1% según el balance de masa isotópica)., En cualquier caso, el experimento con HKB etiquetado no debería haber sido afectado por esta advertencia, y la estimación de 10% de carbono derivado de sustrato inorgánico es probablemente realista. En segundo lugar, Ochromonas es considerado un fijador de carbono ineficiente debido a la falta de mecanismos de concentración de carbono (Maberly et al. 2009)que aumentan la concentración de CO2 a través del transporte de CO2 y / o bicarbonato a la enzima RubisCO (Raven et al., 2008). Por otro lado, el análisis transcriptómico ha demostrado que la maquinaria fotosintética de la cepa BG-1 es funcional (Lie et al.,, 2017), y nuestros experimentos con bicarbonato etiquetado mostraron un enriquecimiento significativo de la abundancia fraccional 13C en Ochromonas (Figuras 4 y 5); por lo tanto, Ochromonas sp. la cepa BG – 1 tiene cierta capacidad para usar carbono inorgánico, aunque de manera ineficiente.
Sin embargo, la fuerte actividad heterotrófica de Ochromonas mientras crece mixotróficamente es probable que aumente la piscina intracelular de CO2, así como su flujo. Como regla general, se considera que los protistas heterotróficos asimilan el 40% de la materia orgánica ingerida, mientras que liberan el 30% y respiran otro 30% (Sleigh, 1989)., Con base en esto, la cantidad total de carbono liberado por Ochromonas como CO2 durante el crecimiento exponencial podría ser tan alta como el bicarbonato total agregado al inicio de la incubación, lo que tiene consecuencias para el balance de masa isotópica que hemos presentado. Si asumimos que el CO2 enriquecido isotópicamente derivado de la respiración HKB está disponible en los mismos niveles que el carbono inorgánico disuelto, la incubación realizada con Ochromonas y etiquetado HKB indicó que ~84% del carbono se derivó del HKB., Hasta el 20% del carbono asimilado derivado de HKB podría corresponder al carbono que fue inicialmente respirado y luego fijado por Ochromonas. Si es correcto, la respiración derivada de la actividad fagotrófica actuaría como un mecanismo de concentración de carbono para este Ochromonas. Mientras que la fuente primaria de carbono para Ochromonas que crecen mixotróficamente se derivó de HKB, una cantidad no despreciable podría haberse derivado de la respiración y luego de la fijación de CO2 de la biomasa bacteriana.,
Ochromonas desplazó su metabolismo hacia la autotrofia cuando se incubó a la luz, pero solo después de haber agotado el HKB en los cultivos (≈ 48 h de crecimiento). Este cambio se reflejó en la abundancia fraccionada del IRMS 13C en masa para el tratamiento con HKB etiquetado, donde se observó una reducción entre 48 h y 145 h (Experimento 2 en la Figura 5), indicativo de la incorporación de carbono no etiquetado a la biomasa de algas a través de procesos ligeros. Las crisófitas generalmente se consideran fijadores de carbono autotróficos deficientes debido a los mecanismos de concentración de carbono deficientes (Maberly et al., 2009)., Sin embargo, estos resultados indican que hubo un nivel significativo de asimilación de carbono inorgánico. Una comparación de los cultivos cultivados en la luz (Experimento 1 en la Figura 5) y la oscuridad continua (Experimento 3 en la Figura 5) reveló que la abundancia fraccional de 15N de los cultivos oscuros no cambió después de 95 h, mientras que los cultivos en la luz continuaron enriqueciéndose en 15N, lo que indica que Ochromonas continuó asimilando nitrógeno para mantener su metabolismo una vez que se agotó el HKB., Estos resultados fueron consistentes con las disminuciones observadas en la concentración de amonio en el medio durante este período de tiempo (figura 3a), aunque la aparición continuada de fosfato en el medio durante este período es inexplicable.
obtuvimos una buena concordancia general entre las mediciones de isótopos a granel y las mediciones de nanosimos para nitrógeno, consistente con las observaciones en estudios anteriores(Popa et al., 2007; huérfano y Casa, 2009; Kopf et al., 2015; figura 4c)., Sin embargo, las mediciones a granel fueron algo más bajas en términos de valores de abundancia fraccionada para el carbono, particularmente para muestras altamente enriquecidas (figura 4d). Se especula que las diferencias entre los nanosimios y las mediciones de isótopos a granel para el carbono pueden estar relacionadas con el hecho de que las muestras de nanosimios se conservaron con glutaraldehído, mientras que las muestras para el análisis a granel no lo fueron. Se ha demostrado que la fijación influye en el carbono celular (Musat et al., 2014), aunque podríamos haber esperado que esto diluyera el 13C en las mediciones de nanosimios en relación con los valores a granel., Una explicación más probable es que las mediciones de una sola célula no están influenciadas por los desechos celulares en el cultivo que pueden estar menos enriquecidos. El valor total de 13C puede ser diluido por estos componentes en relación con las mediciones de nanosimios, lo que implica que los datos de nanosimios pueden reflejar con mayor precisión la absorción de carbono y nitrógeno por las algas. Sin embargo, la variabilidad de célula a célula también puede haber contribuido a las diferencias menores entre las mediciones de masa y nanosimios.,
el uso de nanosimos en este estudio representa su primera aplicación hacia el estudio de los flujos de carbono y nutrientes en un alga mixotrófica, y ha permitido una mejor comprensión de la adquisición de carbono y energía por parte de esta especie, y el metabolismo celular. Nuestros hallazgos amplían la información disponible de los análisis tradicionales de Ochromonas sp. cepa BG – 1 cultivada bajo diversas condiciones de luz y disponibilidad de presas (Sanders et al., 2001), confirmando que la mayor parte del nitrógeno y el carbono utilizados para el crecimiento se obtienen a través de sus presas bacterianas., Aunque los resultados no pueden extrapolarse directamente a todas las especies a lo largo del continuo de algas con diferentes estrategias mixotrofas, nuestro trabajo valida el uso de experimentos de sondeo de isótopos estables y nanosimos para comprender mejor los fundamentos metabólicos de la mixotrofia en una especie. Además, proporciona un enfoque para evaluar la nutrición mixotrófica en muestras ambientales. Ochromonas sp. la cepa BG-1 proporcionó un sistema modelo ideal para comparar el análisis de isótopos a granel con nanosimios porque las bacterias se eliminaron rápidamente al pastar dentro de las primeras 48 h de los experimentos., El Acuerdo entre estas dos mediciones demuestra que los nanosimios capturaron con precisión la dinámica de la adquisición de carbono y nutrientes en este mixótrofo, y por lo tanto podrían aplicarse más ampliamente para explorar la mixotrofia en comunidades mixtas complejas donde las medidas a granel serían insuficientes para capturar estas dinámicas. Este y futuros estudios detallados continuarán produciendo mejoras en nuestra comprensión de la nutrición de las algas mixotróficas.