Eine neue Methode zur Bewertung von Temperatur vs. pH-Aktivitätsprofilen für biotechnologisch relevante Enzyme / Biotechnologie für Biokraftstoffe

Die Erstellung eines Konturdiagramms aus direkten experimentellen Daten erfordert die Verwendung einer durchführbaren Hochdurchsatzmethode und einer beträchtlichen Anzahl von Proben. Der Assay muss daher für den Einsatz in einem 96-Well-Plattendesign geeignet sein., Die allgemeinen Vorteile dieser Miniaturisierung von einzelnen Reaktionsröhrchen zu 96-Well-Platten wurden bereits für die DNSA und andere kolorimetrische Assays gezeigt . Alle in dieser Studie verwendeten Assays waren für das 96-Well-Plattenformat geeignet. Um ein Konturdiagramm zu erzeugen, wurden die Enzym – und Substratmischungen bei acht verschiedenen pH-Werten inkubiert. Diese acht pH-Werte wurden bei 12 verschiedenen Temperaturen unter Verwendung eines Gradienten-PCR-Cyclers inkubiert, was zu 96 einzigartigen Reaktionsbedingungen führte. Ein Plattenleser wurde verwendet, um die Daten zu erhalten., Die Ergebnisse wurden umgewandelt in eine relative Aktivitäten mit der höchsten Aktivität auf jeder Platte wird auf 100% gesetzt. Die Messung wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die gemittelten Werte anschließend mit SigmaPlot in ein Konturdiagramm umgewandelt, wie im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Die Aktivität (Z-Achse) wird als Farbe von lila nach Rot anstelle einer normalen Achse dargestellt, um die Ansicht des Konturdiagramms zu verbessern.,

Puffersystem

Voraussetzung für eine zuverlässige Bestimmung des pH-und Temperaturoptima ist ein stabiles Puffersystem, das hinsichtlich der Enzymaktivität geeignet und nahezu resistent gegen eine pH-Verschiebung mit steigender Temperatur ist. Alternativ könnte dieser Effekt im Konturdiagramm berücksichtigt werden. Der Einfluss der Temperatur auf pKa der Puffer und damit pH ist eine Tatsache, die insbesondere bei alkalischen Puffern wie Tris berücksichtigt werden sollte ., Als Voraussetzung für den Assay wurden alle pH–Variationen unseres Citrat-Phosphat-Puffersystems auf pH-Änderungen zwischen 35 °C und 80 °C getestet (siehe zusätzliche Datei 4). Alle Puffer zeigen eine leichte Abnahme des pH-Wertes bei steigender Temperatur, wobei die Puffer bei höheren pH-Werten höhere Abweichungen aufweisen. Die Temperaturabhängigkeit steigt mit der Phosphatmenge, die mit den Temperaturkoeffizienten Phosphat (− 0,0028) und Citrat (0) korreliert., Da die temperaturabhängigen pH-Schwankungen aller Puffer nur gering waren, konnten sie bei der Zusammenstellung der Konturdiagramme im Bereich der hier verwendeten Werte vernachlässigt werden. Wenn jedoch ein anderes Puffersystem mit einem höheren Temperaturkoeffizienten verwendet werden soll, ist es leicht möglich, das Konturdiagramm für die Änderung des pH-Wertes anzupassen, indem jedem Puffer bei jeder Temperatur ein individueller pH-Wert zugewiesen wird., Diese Werte werden entweder experimentell wie im jeweiligen Material-und Verfahrensabschnitt beschrieben ermittelt oder aus den Temperaturkoeffizienten abgeleitet und können dann entsprechend zur Anpassung der x-Achse (pH) der bereitgestellten Sigmaplot-Datei verwendet werden.

Aktivitätsbereichsbestimmung für Cel8A

Eine Übersicht der verschiedenen Enzyme, Substrate und Assays, die in dieser Studie zur Erstellung der jeweiligen Konturdiagramme verwendet werden, finden Sie in Tabelle 1.,

Tabelle 1 Überblick über die verschiedenen Enzyme, Substrate, und Testbedingungen

Cel8A ist ein cellulase, insbesondere eine endo-glucanase, aus C. thermocellum und war das erste Enzym der Glykosid hydrolase Familie 8 mit einem gelösten Kristallstruktur . In dieser Studie wurde das Enzym mit BBG inkubiert, um unsere vorgeschlagene Methode unter Verwendung des DNSA-Assays zu validieren. Es wurde berichtet, dass Cel8A sein Temperaturoptimum bei 75 °C und pH-Optimum zwischen 5,5 und 6,5 hat ., Diese Werte stimmen mit den Ergebnissen unseres Konturdiagramms überein, da sie sich im Bereich der Aktivität > 90% befinden (Abb. 1). Unser Konturdiagramm zeigt jedoch, dass das Enzym unter einer Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen hochaktiv ist. Das Enzym zeigt akzeptable Aktivitäten bei niedrigeren pH-Werten, wenn zwischen 60 °C und 65 °C und führt auch mit mehr als 60% seiner maximalen Aktivität, wenn bei pH-Werten unter 4,5. Unsere Methode bietet die Möglichkeit, solche Effekte zu visualisieren und die Leistung eines Enzyms an jedem Punkt innerhalb der getesteten Parameter auf einen Blick zu bewerten.,

Abb. 1

Konturdiagramm von Cel8A unter Verwendung des DNSA-Assays mit Gerste-β-glucan als Substrat

Um zu testen, ob unsere Methode für verschiedene Hydrolasetestmethoden geeignet ist, haben wir ein Konturdiagramm mit Cel8A mit CM-Cellulose als Substrat und der jeweilige Assay (Abb. 2). Das Diagramm zeigt ähnliche Optima bei 75 °C und pH 5.5. Die Verwendung von Azo-CM-Cellulose als Substrat führte jedoch zu einem etwas kleineren Aktivitätsbereich., Die geringfügigen Unterschiede zwischen den beiden Assays könnten auf die unterschiedlichen Strukturen und Verknüpfungstypen beider Substrate zurückzuführen sein, wodurch sich ihre Bindungseigenschaften an das Enzym unterscheiden. Azo-CM-Cellulose ist ein nicht natürliches Substrat mit zugesetzten Farbstoffgruppen, das diesen Effekt noch verstärken könnte. Mit Cel8A konnten wir zeigen, dass unsere Methode valide Daten liefert und für den Einsatz in zwei verschiedenen etablierten Assays für Hydrolasen geeignet ist: DNSA und Azo-CM-Cellulose.

Aktivitätsbereichsbestimmung für Celluclast®

Zusätzlich zu einem einzelnen Enzym wurde eine Enzymmischung untersucht. Celluclast® ist ein weit verbreitetes kommerzielles Cellulaseprodukt aus Trichoderma reesei. Es besteht hauptsächlich aus Cellobiohydrolasen und Endo-1,4-β-Glucanasen, weist aber auch Xylanasen und mindestens eine β-Xylosidase auf . Das Produkthandbuch besagt, dass die optimalen Aktivitäten zwischen 50 °C und 60 °C und pH 4 liegen.,5 und 6.0 . In dieser Arbeit haben wir zunächst ein Konturdiagramm für Celluclast® mit BBG als Substrat nach der DNSA-Methode erstellt (Abb. 3). Das BBG-Konturdiagramm wurde durch eine Standardtemperaturkurve verifiziert (Abb. 4). Die Ergebnisse der Temperaturkurve bei pH 5,5 stimmen mit den Ergebnissen des Konturdiagramms überein und zeigen den gleichen Aktivitätsbereich. Die Messung separater Kurven reicht jedoch nicht aus, um die Aktivität von Celluclast® auf BBG zu beschreiben. Der pH-Bereich, in dem das Enzymgemisch eine hohe Aktivität zeigt, ist stark temperaturabhängig., Je höher die Temperatur, desto niedriger muss der pH-Wert sein, um eine hohe Aktivität zu erreichen. Um 45 °C ist Celluclast® bis zu einem pH-Wert von 6,5 hochaktiv (> 60%), während es bei 65 °C nur bis zu einem pH-Wert von 5,0 hochaktiv ist. Die Beschreibung der Aktivität mit zwei separaten Kurven ist daher streng abhängig von dem als statischen Parameter gewählten Wert. Temperaturdiagramme, die beispielsweise an den beiden Extremen des angegebenen pH-Bereichs (4,5 und 6,0) aufgenommen wurden, sollten signifikant unterschiedliche Ergebnisse liefern. Gleiches gilt für pH-Graphen, die bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen wurden., Um diesen Effekt deutlich zu machen, erstellten wir Standard-pH-Graphen bei 45 °C, 55 °C und 65 °C (Abb. 5). Diese drei pH-Kurven zeigen, dass sich mit steigender Temperatur die pH-Grenze für hohe Aktivität auf saurere pH-Werte verschiebt. Die drei Kurven verifizieren damit die im Konturdiagramm gezeigten Ergebnisse. Weiterhin zeigen sie die Grenzen der konventionellen Einzelaktivitätsbestimmung auf, die zumindest für Celluclast® bei den pH-Kurven von der gewählten Temperatur abhängig ist., Die Verwendung unserer Konturdiagrammmethode umgeht dieses Problem vollständig, indem die Wirkung von Temperatur und pH in einem Schritt gemessen wird.

Der Aktivitätsbereich von Celluclast® auf arabinoxylan (AX) (Abb. 6) unterscheidet sich von dem mit BBG als Substrat. Die Aktivität wird insbesondere auf niedrigere Temperaturen verlagert, wobei keine hohen Aktivitäten über 60 °C beobachtet werden., Da Celluclast® eine Mischung mehrerer Enzyme ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese verschiedenen Enzyme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Das Aktivitätsmuster ähnelt jedoch dem von BBG; beispielsweise ist das Enzymgemisch bei pH 4,5 bis fast 60 °C hochaktiv, während es bei pH 6,5 nur bis 50 °C hochaktiv ist. In der Literatur wurde das Optimum von Celluclast® auf weizenlöslichen AX durch ein Response Surface Model (RSM) bestimmt und liegt zwischen pH 4,4 und 39 °C., Unser Konturdiagramm zeigt die höchste Aktivität im gleichen Temperaturbereich und bei einem etwas höheren pH-Wert, der immer noch innerhalb des vom RSM bestimmten Optimums liegt. Während das Optimum für beide Methoden nahezu gleich ist, zeigt unser Konturdiagramm auffallend die exakte Aktivität von Celluclast® auf AX im gesamten Bereich der getesteten Bedingungen und zeigt eine detailliertere Disposition als das RSM. Mit unseren Konturdiagrammen von Celluclast® auf BBG und AX konnten wir zeigen, dass komplexe Enzymmischungen mit der vorgeschlagenen Methode analysiert werden können.

Abb., 6

Konturdiagramm von Celluclast® unter Verwendung des DNSA-Assays mit arabinoxylan als Substrat

Um die Vielseitigkeit unserer Aktivitätsbereichsbestimmung weiter zu demonstrieren, haben wir deren Verwendung mit zusätzlichen Substraten und Assays bewertet. Die Aktivität von Celluclast® auf p-NP-β-d-Glucopyranosid wurde getestet und das Konturdiagramm ist in Abb. 7. Die hohe Aktivität auf diesem Substrat ist auf einen eher engen Bereich zwischen pH 4,0 bis 5,5 und 55 °C bis 70 °C begrenzt., Dies deutet darauf hin, dass nur ein oder wenige Enzyme innerhalb der Celluclast®-Enzymmischung wahrscheinlich eine Aktivität in Richtung p-NP-β-d-Glucopyranosid zeigen. p-NP Glykoside können als Substrate für die Herstellung von Konturparzellen verwendet werden. Allerdings sind nicht alle p-NP-Glykoside geeignete Substrate im Assay, da einige von ihnen aufgrund von Instabilität einen hohen Hintergrund aufweisen (siehe zusätzliche Datei 5), insbesondere wenn hohe Temperaturen mit hohen pH-Werten kombiniert werden.

Abb., 7

Konturdiagramm von Celluclast® unter Verwendung von p-NP-β-d-glucopyranosid

Um die Anwendung unserer Methode auf einer natürlichen Biomasseprobe zu testen, haben wir uns für die Verwendung eines Substrats auf Strohbasis entschieden. Die Freisetzung von Glukose durch Celluclast® wurde mit dem handelsüblichen d-Glucose HK Assay (Megazyme) nachgewiesen. Die Hauptkomponente in der Zellwand von Stroh ist Cellulose, die die Hauptquelle für enzymatisch freigesetzte Glukose ist. Das Konturdiagramm (Abb., 8) zeigt daher überwiegend die Aktivität von Celluclast® auf kristalline Cellulose, die in Richtung enzymatischen Abbau widerspenstig ist . Die höchste Freisetzung von Glukose wurde bei ungefähr pH 4,0 bis 5,5 und 40 °C bis 60 °C beobachtet C. Der Bereich mit hoher Aktivität ist daher weniger breit als für BBG bestimmt, was für einen Prozess berücksichtigt werden sollte, der hauptsächlich darauf abzielt, Cellulose abzubauen., Mit der Verwendung von d-Glucose HK und p-NP-β-d-Glucopyranosid als alternative Assays konnten wir die Anpassungsfähigkeit unserer Methode an insgesamt vier verschiedene und häufig verwendete Glykosidhydrolase-Assays demonstrieren. Die Verwendung von Stroh hat gezeigt, dass unsere Methode auch für natürliche Substrate von industrieller Relevanz geeignet ist und für die Bewertung komplexer Prozesse und Substrate verwendet werden kann. Celluclast® zeigt unterschiedliche Aktivitätsprofile auf verschiedenen Substraten., Gemeinsam für alle Methoden ist es daher entscheidend, die pH-und Temperaturbereichsdaten eines Enzyms mit dem Substrat von Interesse zu bestimmen.

Überlegungen bei Verwendung der Methode

Wenn mit der vorgeschlagenen Methode ein Konturdiagramm erstellt wird, gibt es mehrere überlegungen, die berücksichtigt werden sollten., Das Substrat muss stabil und der gemessene Hintergrund über den gesamten Bereich der Bedingungen in der 96-Well-Platte reproduzierbar sein. Dies ist eine Voraussetzung, da die Substratsteuerung von allen Werten vor der Umwandlung in relative Aktivitäten abgezogen werden muss, aber nicht direkt auf der Platte für jede der 96 Bedingungen gemessen werden kann. Mehrere p-NP Glykosidsubstrate können beispielsweise nicht verwendet werden, da sie einen stark temperatur – und pH-abhängigen Hintergrund aufweisen. Eine sehr genaue Pipettierung ist erforderlich, um eine akzeptable Standardabweichung von den Triplikaten zu erzielen., Die Verwendung von 96-Kopf-und 8-Kanal-Pipetten wird dringend empfohlen, da sie die Genauigkeit erheblich verbessern und den Vorgang beschleunigen. Darüber hinaus sind Plattenleser und Gradienten-PCR-Cycler technische Anforderungen, um das Verfahren ordnungsgemäß auszuführen. Der Temperaturbereich, in dem das Verfahren durchgeführt werden kann, kann entsprechend den technischen Eigenschaften des Gradienten-PCR-Cyclers angepasst werden, der üblicherweise auf 30 °C oder 40 °C begrenzt ist und häufig keine Werte unter 20 °C enthalten kann., Wir haben die Absorption direkt in die relative Aktivität eines Enzyms umgewandelt, da die Werte alle auf einer linearen Kalibrierkurve liegen (Daten nicht gezeigt). Wenn dies jedoch nicht der Fall ist, muss die Aktivität zuerst berechnet werden, beispielsweise in U/mg, und diese Werte können dann zur Erstellung des Konturdiagramms verwendet werden. Wenn ein Konturdiagramm für ein Enzym erstellt werden soll, das stark von zweiwertigen Metallionen abhängig ist, muss ein anderes Puffersystem verwendet werden, da Puffer auf Citratphosphatbasis diese Ionen komplex machen.,

Während RSM-Ansätze ein unbestreitbar leistungsfähiges Werkzeug sind, um komplexe Beziehungen zu bewerten, z. B. verschiedene Variablen, die mehrere Faktoren beeinflussen, ist die Bestimmung der Wirkung von nur pH und Temperatur auf die Aktivität nicht zu komplex, um durch direkte Messung erreicht zu werden. Die Bestimmung der korrekten Grenzwerte des Modells kann mehrere Ansätze umfassen und das resultierende Modell beeinflussen. Das RSM-Modell wird nur aus einer kleinen Anzahl von Messungen um den zentralen Punkt der Enzymaktivität abgeleitet und die Genauigkeit gegenüber den tatsächlichen experimentellen Werten muss anschließend getestet werden., Die Gesamtauflösung des RSM ist daher geringer als bei unserer Methode, was es schwierig macht, Aktivitätseffekte wie bei Celluclast® bei höheren Temperaturen und/oder pH-Werten zu sehen. Unsere Methode erfordert nicht die Fähigkeit, komplexe statistische Modelle zu entwerfen und kann mit minimalen und relativ standardmäßigen technischen Anforderungen durchgeführt werden. Ein Nachteil, den sowohl unsere Methode als auch RSM teilen, ist, dass eine direkte Visualisierung der Standardabweichung innerhalb des dreidimensionalen Diagramms nicht möglich ist., Unsere Methode erlaubt jedoch die Berechnung der Standardabweichung für jeden einzelnen Datenpunkt. Die meisten RSM-Modelle bestimmen die Standardabweichung für das gesamte Modell nur aus Daten des zentralen Datenpunkts des Modells, während die anderen Datenpunkte nur einmal gemessen werden . Die Standardabweichungen sind natürlich an den Grenzen der Aktivität eines Enzyms höher und zeigen einen starken Einfluss auf die Aktivität innerhalb einer leichten Änderung der Bedingungen. Um das Optimum herum und in Bereichen ohne oder mit geringer Aktivität sind die Abweichungen deutlich geringer., Da die vorgeschlagene Methode zu einem vollständigen faktoriellen Datensatz führt, wäre es möglich, bei Bedarf ein statistisches Modell für weitere Analysen zu berechnen. Das abgeleitete statistische Modell würde direkt auf experimentellen Daten basieren, ist jedoch ein zusätzlicher Schritt, der für Standardanwendungen der Methode nicht erforderlich sein sollte.

Zusammenfassend ist eine einfache Beurteilung der Eignung eines Enzyms oder eines Enzymgemisches für eine Kombination von Prozessparametern von entscheidender Bedeutung bei der Gestaltung biotechnologischer Prozesse im labor-oder industriellen Maßstab., Temperatur und pH-Wert sind zwei der wichtigsten Prozessfaktoren, die die Enzymaktivität beeinflussen. Herkömmliche Ansätze zum Testen der Wirkung dieser Faktoren auf Enzyme basieren auf der Annahme, dass eine zweidimensionale Korrelation zwischen Temperatur und Aktivität sowie pH und Aktivität besteht. Im Gegensatz dazu bestimmen neue Ansätze die Beziehung in dreidimensionaler Materie, sind aber statistikbasiert, komplex zu entwerfen und ihre Genauigkeit zu den tatsächlichen Daten kann variieren., Das hier eingeführte Verfahren ermöglicht andererseits eine schnelle und einfache Bestimmung der Wirkung, die Temperatur und pH-Wert gleichzeitig auf die Aktivität des Enzyms haben, unter Verwendung von 96-Well-Platten, mehrkanaligen Pipetten und einem Gradienten-PCR-Cycler. Mit dieser grundlegenden technischen Ausrüstung ist es möglich, Konturdiagramme von pH, Temperatur und Aktivität zu erstellen, die direkt auf experimentellen Daten basieren. Das Verfahren wurde für mehrere weit verbreitete Glykosidhydrolase-Assays sowie Modell-und Komplexsubstrate getestet.

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