Blod indsamling og behandling af
Alle procedurer, der involverer indsamling af humant blod fra raske frivillige var i overensstemmelse med den Menneskelige Forskning Etiske Udvalg af University of Sydney (godkendelse HREC 2014/244) og informeret samtykke er indhentet fra alle personer., Alle procedurer, der involverer indsamling af humant blod fra ECMO patienter, der var i overensstemmelse med Alfred Hospital Etik, Monash University Stående Udvalg for Forskning i Mennesker (godkendelse 388/13) og informeret samtykke er indhentet fra alle personer. Alle procedurer var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen fra 1983. Blod blev opsamlet ved venesektion ved hjælp af en 21 g sommerfugl Terumo-nål fra 10 sunde donorer på ingen medicin (fire mandlige, seks kvindelige, 22-58 år gamle)., De første 5 mL blod blev kasseret for at undgå enhver trombin, der kan have været genereret omkring nålen indsættelsen site og derefter trukket ind i rør, der indeholder 3.2% v/v natriumcitrat. Blod fra otte patienter i et enkelt center, der havde ECMO-støtte (fire mandlige, fire kvindelige, 34-67 år gamle) blev trukket ind i ACD-a-rør (bd Vacutainer)., Patienter med ECMO har fået støtte til anti-koagulation og/eller anti-trombocyttal medicin baseret på klinikere skøn eller institutionelle retningslinjer, hvor patienterne typisk påbegyndt på warfarin, som er rettet mod international normaliseret ratio (INR) 2-3, med heparin bridging infusion og aspirin terapi, samt dipyridamole for dem, der anses for høj risiko for trombose. Plasma blev fremstillet ved to gange centrifugering ved 800 g g i 20 minutter ved stuetemperatur., Ved nogle lejligheder blev sundt donorplasma skåret ved hastigheder på 2000 s-1 eller 10000 s−1 i 5 minutter ved stuetemperatur ved anvendelse af et Kine .us pro+ rheometer.
Hepatocyte fibrinogen collection
Den menneskelige lever kræft-celle linje HepG2 (ATCC, HB-8065) blev dyrket i DMEM, 10% føtalt kalveserum og glutamax på 5% CO2 og 37 °C. Celler på 80-90% sammenløbet blev vasket med phosphatbufferet saltopløsning, inkuberes i 18 timer i DMEM uden serum på 5% CO2 og 37 °C eller i et hypoxisk salen på 1% O2, 5% CO2 og 37 °C., Det konditionerede medium blev opsamlet (1 mL pr. 4 106 106 celler), og det udskillede fibrinogen blev straks behandlet som beskrevet nedenfor.
fibrinogen-og fibrinassays
plasmaprøver blev ubehandlet eller inkuberet med thrombin og / eller fibrinpolymerisationshæmmeren, GPRP (Sigma). Fibrin blev fremstillet i 1 mL plasma ved tilsætning af 50 enheder bovint thrombin (Sigma) og 10 mM CaCl2 og MgCl2 i 40 minutter ved 22.C. fibrinpolymererne blev opsamlet under anvendelse af en plaststang., I et forsøg blev plasma (2 mL) inkuberet med 27 enheder/mL thrombin og 10 mM CaCl2 og MgCl2 i 40 minutter ved 22.C, og fibrinpolymeren blev opsamlet på en plaststang og fjernet. Det udtømte plasma blev inkuberet med en anden alikvot på 27 enheder/mL thrombin, og den nye fibrinpolymer blev opsamlet og fjernet. Der blev udtaget en portion plasma (0,2 mL) før og efter tilsætning af begge partier thrombin, 150 µM d-phenylalanyl-prolyl-arginylchlormethylketon (PPACK, Sigma) tilsat for at hæmme thrombin-aktivitet, og prøverne inkuberes i 16 timer ved 22 C. C., Fibrinogenindholdet i plasmaprøverne blev estimeret ved at opsamle proteinet på polyklonale anti-fibrinogen antistofbelagte perler (se følgende afsnit), opløsning af fibrinogen på SDS-side og farvning med kolloid Coomassie. I et andet eksperiment, plasma blev inkuberet med 8 mM GPRP (Sigma) i 5 min ved 22 °C inden tilsætning af 50 enheder/mL thrombin for 60 min ved 22 °C. reaktionen blev standset med 150 µM af PPACK for 10 min ved 22 °C. Renset fibrinogens blev isoleret fra de raske donor frisk frosset plasma ved β-alanin precipitation32 eller fås i handelen (Sigma F4883).,
Kvantificering af redox-stater af fibrinogen og fibrin disulfid obligationer
Dynabeads (2 mg, Life Technologies) var belagt med 16 µg af polyklonale anti-fibrinogen antistoffer (Dako, Kat A0080, Masse 00015063) i 1 mL phosphatbufferet saltopløsning på et roterende hjul, for 1 timer ved 22 °C, og den overskydende antistof fjernes ved at vaske tre gange med 1 mL af phosphatbufferet saltopløsning. Plasma (0, 7 mL) eller HepG2-konditioneret medium (4, 5 mL) blev inkuberet med de 2 mg overtrukne perler på et roterende hjul i 1 time ved 22 C. C., Perlerne blev indsamlet ved hjælp af en magnet, overskydende plasma-indsugning til at reducere lydstyrken, og inkuberes i 0,3 mL 5 mM 12C-IPA i phosphatbufferet saltopløsning, der indeholder 10% DMSO for 1 timer ved 22 °C i mørke til at alkylat uparrede Cys thioler i proteiner. Supernatanterne blev aspireret, og perlerne inkuberes med NuPAGE LDS-prøvebuffer (Life Technologies) indeholdende yderligere 5 mM 12C-IPA i 30 minutter ved 60.C. supernatanterne blev løst på SDS-side., Fibrin polymerer, der genereres i plasma blev indsamlet på en plastik stang og straks neddykket i 1 mL 5 mM 12C-IPA i phosphatbufferet saltopløsning, der indeholder 10% DMSO for 1 timer ved 22 °C i mørke. Den fibrin blev vasket 3 gange med phosphatbufferet saltopløsning før opløsning af polymeren i 1 mL 20 mM eddikesyre i 24 timer ved 22 °C. Tyve microliters af løsningen blev inkuberet med NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies), der indeholder 5 mM 12C-IPA-for 30 min ved 60 °C og proteiner løst på SDS-PAGE., Renset fibrinogen (12 µg) blev inkuberet med 5 mM 12C-IPA I phosphat-bufret saltvand indeholdende 10% DMSO i 1 time ved 22.C i mørke, og proteinet blev opløst på SDS-Page.
SDS-PAGE geler blev farvet med kolloid coomassie (Sigma) og fibrin(øjne) bands der er skåret ud, destained, tørret, inkuberes med 40 mM dithiothreitol og washed14. Gelskiverne blev inkuberet med 5 mM 13C-IPA (Cambridge-isotoper) i 1 time ved 22.C i mørke for at alkylere disulfidbindingscy ‘ erne, vasket og tørret før fordøjelse af proteiner med 12.,5 ng / µL trypsin (Promega) i 25 mM nh4co2 natten over ved 25 C. C. peptider blev elueret fra skiverne med 5% myresyre, 50% acetonitril. Nano-væskekromatografi (nano-LC) blev udført under anvendelse af et ultimativt 3000 HPLC-og autosampler-system (Dione.). Prøver blev injiceret i en fritløs Nano-LC-søjle (75mm ~ ~ 12 cm) indeholdende C18-medier (1.9 µm, 120 Å ReproSil-PUR 120 C18-A., Dr Maisch GmbH) og opvarmet til 45. C i alle kørsler. Peptider blev elueret under anvendelse af en lineær gradient over 52 min, ved en strømningshastighed på 0,2ll / min. Mobil fase A bestod af 0.,1% myresyre i H2O, mens den mobile fase B bestod af acetonitril: H2O (8: 2) med 0,1% myresyre. Gradient var: 0 minutter 2% B; 4 min 2% B, 36 min og 45% B, 37 min 80% B, 37.5 min 80% B, 39 min 2% B og 52 min 2% B. Høj spænding (2000 V) blev anvendt til en lav volumen tee (Upchurch Videnskabelige) og kolonne tip placeret ~0,5 cm fra den opvarmede kapillarrør (T = 275 °C) i en LTQ Orbitrap Velos (Thermo Electron) mass spectrometer. Positive ioner blev genereret ved elektrospray ionisering og massespektrometeret drives i dataafhængig erhvervelse tilstand., Fuld scan MS spectra blev erhvervet (m / 35 350-1750) af Orbitrap ved en opløsning på 30.000. De 15 mest forekommende ioner (>5000 tæller) med ansvar stater ≥ +2 var sekventielt isoleret og fragmenterede inden for den lineære ion-fælde ved hjælp af collisionally induceret dissociation med en aktivering q = 0,25 og aktivering på 10 ms på en målværdi på 30.000 ioner. M/MS-forhold valgt for MS / MS blev dynamisk udelukket for 35 s. Ion Trap AGOOM AGC mål: 3000.00. Ion fælde fuld AGC mål: 30000.00. Ion fælde SIM AGC mål: 10000.00. Ion fælde MSN AGC mål: 10000.00., Data blev analyseret ved hjælp af Mascot Daemon (Version 2.5.0, Matri.Science) mod s .issprot database. Søg parametre, der var forløber tolerance af 6 ppm og produkt ion tolerancer på ±0.6 Da, og iodoacetanilide afledte (Cys), iodoacetanilide 13C-derivat (Cys), oxidation (Met) valgt som variabel ændringer med fuld tryptic spaltning af op til tre savnede skel. Med listen over cysteinholdige peptider identificeret ved hjælp af maskot beregnes deres monoisotopiske masse/ladningsforhold (m/)) på +2, +3 og +4 ved hjælp af MS-Produkt (Version v 6.2.2, Proteinprospektorværktøjer)., Cys mærket med 12C – IPA eller 13C-IPA har en masse på henholdsvis 133.05276 eller 139.07289. Tredive Cys-holdige peptider blev analyseret (supplerende tabeller 1 og 2). De forskellige redo .former af Cys-resterne blev kvantificeret ud fra den relative ionforekomst af peptider mærket med 12C-IPA og/eller 13C-IPA. For at beregne ionforekomst af peptider blev ekstraherede ionkromatogrammer genereret under anvendelse af Browcalibur Quual bro .ser (v2.1.0; Thermo Scientific). Området blev beregnet ved hjælp af den automatiserede topdetekteringsfunktion indbygget i Soft .aren., Dataene blev rutinemæssigt søgt efter peptider indeholdende frie Cys thioler, og disse blev ikke påvist, hvilket indikerer, at alkylering af uparrede Cys-rester af 12C-IPA eller 13C-IPA var fuldstændig i proteinet.
Fibrinogen disulfid-forbundet peptid analyse
Sund donor plasma (0.7 mL) blev inkuberet med polyklonale anti-fibrinogen antistof-coatede Dynabeads på et roterende hjul i 1 time ved 22 °C. De perler, der blev indsamlet, overskydende plasma-indsugning og 0,3 mL 5 mM 12C-IPA i phosphatbufferet saltopløsning, der indeholder 10% DMSO-blev tilsat, og der inkuberes i 1 time ved 22 °C i mørke., Derefter blev supernatanten aspireret, perlerne inkuberet med NuPAGE LDS-prøvebuffer i 30 minutter ved 60.C, og supernatanterne blev løst på SDS-side. Gel skiver, der indeholder fibrinogen blev vasket og tørret, før fordøjelse med 12 ng/µL trypsin (Promega) i 4 timer ved 37 °C. Reaktioner blev standset ved tilsætning af 5% (v/v) myresyre og peptider elueres fra gel-skiver med en 5% myresyre og 50% (v/v) acetonitril. Peptider i 0.,1% myresyre (sidste bind 12 µL), blev løst på en 35 cm x 75 µm C18 modsat fase (reverse phase analytiske kolonne ved hjælp af en 2-35% acetonitril gradient over 22 min ved et flow på 300 nL/min (Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 HPLC) og analyseres på en LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer, som beskrevet ovenfor. Disulfid-forbundet peptider var søgt mod human fibrinogen sekvens ved hjælp af Byonic analyse-software (Version 3.9-7 -, Protein-Variabler) med en falsk opdagelse på 1%. Alle disulfidbundne peptider blev manuelt inspiceret for nøjagtighed., Precursormassetolerance og fragment tolerance blev sat til henholdsvis 10 ppm og 0,6 Da. Variabel ændringer blev defineret som oxideret Opfyldt, oxideret Cys (mono -, di-og tri) og glutathionylated Cys med fuld trypsin spaltning af op til tre savnede skel.
Fibrinogen funktionalitet analysen
Renset fibrinogen (0,2 mL af 10 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 5 mM 12C-IPA for 1 timer ved 22 °C i mørke til at alkylat uparrede Cys thioler i protein., Den ureagerede IPA blev fjernet ved hjælp af en 7 kDa m .co Meba spin afsaltningskolonne (Thermo Fisher). Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1,1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma) i 5 timer ved 22 °C i en samlet mængde 0.2 mL 1,5 mL mikrocentrifuge rør. Fibrinpolymerne blev pelleteret ved 13.000 g g i 15 minutter, og koncentrationen af fibrinogen tilbage i supernatanten blev målt. Funktionalitet udtrykkes ved % af fibrinogen, der forbruges ved dannelse af fibrinpolymer.,
Fibrin polymer dannelsen målt ved lysspredning
Renset fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma). Stigningen i absorbans ved 350 nm blev registreret hver 30 s i 15 min.
Fibrin polymer struktur målt ved scanning elektron mikroskopi (SEM)
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma) i 2 timer ved 22 °C i en samlet mængde 0.2 mL., Den fibrin polymerer blev skyllet to gange med 0,1 M fosfat-buffer saltvand (PBS), fastgjort med 2,5% glutaraldehyd i PBS natten over ved 4 °C, efter fast med 1% OsO4 i PBS, dehydreret med gradueret serie af ethanol, og næste kritiske punkt tørres med en Leica EM CPD300. Prøver blev sputter belagt med 15 nm guld (K550., Emitech) og afbildet med en Electreiss SigmaHD felt Emission Scanning elektronmikroskop. Sem-mikrograferne blev registreret ved 5 kV accelerationsspænding og en arbejdsafstand på 5 mm. fiberdiametre blev målt ved hjælp af ImageJ.,
Fibrin polymer gennemsivning analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma) i 2 timer ved 22 °C i en samlet mængde 0.2 mL i polypropylen kromatografi kolonner med en indre diameter på 4,6 mm. De kolonner, der var overlejret med 0,8 mL Hepes-buffer og flux (J) blev beregnet ud fra vægten af de dråber, som sivet i 20 min., Den gennemsivning (Darcy) constant33 blev beregnet ud fra forholdet, Ks = JƞA/LP, hvor J er den flux (cm3/s), ƞ er viskositeten af buffer (0.01 poise ved stuetemperatur), A er tværsnitsarealet af den blodprop (0.17 cm2), L er længden af den blodprop (1,1 cm), og P er det hydrostatiske tryk (1,018,218 dyne/cm2).
Fibrin polymer jordpakning analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma) i 16 timer ved 22 °C i en samlet mængde på 0,5 mL i 1.,5 mL mikrocentrifugerør, der tidligere er overtrukket med 10 mg/mL PEG-20000 i vand og lufttørret. Fibrinpolymerne blev centrifugeret ved 13.000 g g i 5 til 2400 s, og volumenet af væsken ekstruderet fra den målte polymer.
Fibrinolyse-analysen
Fibrinogen eller fibrinogen-IPA (1,8 mg/mL i 50 mM Hepes, 0.14 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) blev inkuberet med 1 enhed/mL bovint thrombin (Sigma) i 2 timer ved 22 °C i en samlet mængde på 0,5 mL i 24-brønds plader (15,6 mm diameter) for 2 timer ved 22 °C. En alikvot af plasminspaltning (5 µL 0.,59 µM) blev sat til midten af brøndene og pladerne inkuberet i 18 timer ved 37.C i et fugtigt miljø. Lysis områder blev bestemt ud fra gennemsnittet af to diametre målt vinkelret.
kvantificering af redo .tilstandene for α2-makroglobulindisulfidbindinger
de 10 sunde donorplasmaer beskrevet ovenfor til analyse af fibrinogen blev anvendt til analyse af α2-makroglobulin ved hjælp af de samme procedurer. Plasma (0.,7 mL) blev inkuberet med polyklonale anti-α2-macroglobulin antistof (Dako, Kat Q0102, Masse 20068567)-belagt Dynabeads (Life Technologies) på et roterende hjul i 1 time ved 22 °C. De perler, der blev indsamlet, overskydende plasma-indsugning, og inkuberes i 0,3 mL 5 mM 12C-IPA i phosphatbufferet saltopløsning, der indeholder 10% DMSO for 1 timer ved 22 °C i mørke til at alkylat uparrede Cys thioler i proteiner. Supernatanterne blev aspireret, og perlerne inkuberes med NuPAGE LDS-prøvebuffer (Life Technologies) indeholdende yderligere 5 mM 12C-IPA i 30 minutter ved 60.C. supernatanterne blev løst på SDS-side., De SDS-side geler blev farvet med kolloid coomassie (Sigma), og α2-makroglobulinbåndet udskæres, tørres, inkuberes med 40 mM dithiothreitol og vaskes14. Gelen skiver blev inkuberet med 5 mM 13C-IPA (Cambridge Isotoper) for 1 timer ved 22 °C i mørke til at alkylat disulfid obligationer Cys, vasket og tørret, før fordøjelsen af proteiner med på 12,5 ng/µl af trypsin (Promega) i 25 mM NH4CO2 natten 25 °C. Peptider var elueres fra skiver med en 5% myresyre, 50% acetonitril., Væskekromatografi, massespektrometri og dataanalyse blev udført som beskrevet for fibrinogen34. 17 Cys-holdige peptider blev analyseret (supplerende tabeller 2 og 4). De forskellige redo .former af Cys-resterne blev kvantificeret ud fra den relative ionforekomst af peptider mærket med 12C-IPA og/eller 13C-IPA.
Rapporteringsoversigt
yderligere oplysninger om forskningsdesign er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.