Oprettelse af en contour plot fra direkte eksperimentelle data kræver brug af en mulig high-throughput screening metode og en lang række prøver. Analysen skal derfor være egnet til anvendelse i en 96-brønds pladedesign., De generelle fordele ved denne miniaturisering fra enkeltreaktionsrør til 96-brøndsplader er allerede vist for DNSA og andre kolorimetriske assays . Alle analyser, der blev brugt i denne undersøgelse, var egnede til 96-brønds pladeformat. For at fremstille et konturplot blev en .ymet og substratblandingerne inkuberet ved otte forskellige pH-niveauer. Disse otte pH-niveauer blev inkuberet ved 12 forskellige temperaturer under anvendelse af en gradient-PCR-cykler, hvilket resulterede i 96 unikke reaktionsbetingelser. En pladelæser blev brugt til at hente dataene., Resultaterne blev omdannet til relative aktiviteter, hvor den højeste aktivitet på hver plade blev sat til 100%. Målingen blev udført i tre eksemplarer, og de gennemsnitlige værdier blev efterfølgende omdannet til et konturplot ved hjælp af SigmaPlot, som beskrevet i afsnittet materialer og metoder. Aktiviteten (axis-akse) er repræsenteret som farve fra lilla til rød i stedet for en normal akse for at forbedre visningen af konturplottet.,
Buffer system
En forudsætning for pålidelig bestemmelse af pH og temperatur optima er en stabil buffer system, der er egnet vedrørende enzym aktivitet og næsten resistente over for en pH-værdi på skift med stigende temperatur. Alternativt kan denne effekt overvejes i konturplottet. Indflydelsen af temperaturen på PKA af bufferne og dermed pH er en kendsgerning, der bør overvejes, især for alkaliske buffere som Tris ., Som et krav til analysen blev alle ph–variationer i vores citrat-phosphatbuffersystem testet for ændring i pH mellem 35 C C og 80.C (se yderligere fil 4). Alle buffere viser et mindre fald i pH med stigende temperatur, hvor bufferne ved højere pH-værdier viser højere afvigelser. Temperaturafhængigheden stiger med mængden af fosfat, som korrelerer med temperaturkoefficienterne for fosfat (- 0,0028) og citrat (0)., Da de temperaturafhængige pH-variationer for alle buffere kun var mindre, kunne de forsømmes ved udarbejdelsen af konturplotene inden for det her anvendte værdiområde. Ikke desto mindre, hvis der skal anvendes et andet buffersystem med en højere temperaturkoefficient, er det let muligt at tilpasse konturplottet for ændringen i pH ved at tildele hver buffer en individuel pH ved hver temperatur., Disse værdier bestemmes enten eksperimentelt som beskrevet i det respektive materiale – og metodeafsnit eller afledt af temperaturkoefficienterne og kan derefter følgelig anvendes til at tilpasse pH-aksen (pH) for den medfølgende Sigmaplot-fil.
Aktivitet spænder bestemmelse for Cel8A
En oversigt over de forskellige enzymer, substrater, og analyser, der anvendes i denne undersøgelse for oprettelsen af de respektive contour plot er givet i Tabel 1.,
Cel8A er en cellulase, mere specifikt en endo-glucanase, fra C. thermocellum og var den første enzym af glycosid hydrolase familie 8 med et løst krystal struktur . I denne undersøgelse blev en .ymet inkuberet med BBG for at validere vores foreslåede metode ved hjælp af DNSA-assayet. Cel8A er rapporteret at have sin temperatur optimal ved 75 and C og ph optimal mellem 5,5 og 6,5 ., Disse værdier er i overensstemmelse med resultaterne af vores konturplan, da de er inden for området > 90% aktivitet (fig. 1). Vores konturplot viser imidlertid, at en .ymet er meget aktivt under en lang række forskellige forhold. Enzymet ikke udstille acceptable aktiviteter ved lavere pH-værdier, når de er mellem 60 °C og 65 °C, og udfører også med mere end 60% af sin maksimale aktivitet, når de ved pH-værdier under 4.5. Vores metode giver mulighed for at visualisere sådanne effekter og evaluere et en .yms ydeevne på ethvert tidspunkt inden for de testede parametre med et øjeblik.,
Contour plot af Cel8A hjælp DNSA analysen med byg-β-glucan som substrat
for At teste, om vores metode er velegnet til forskellige hydrolase analyse metoder, vi produceret en contour plot ved hjælp af Cel8A med Azo-CM-cellulose som substrat, og den pågældende analyse (Fig. 2). Handlingen viser lignende optima ved 75 and C og pH 5,5. Anvendelsen af A .o-CM-cellulose som substrat resulterede imidlertid i et lidt mindre aktivitetsområde., De mindre forskelle mellem de to assays kunne skyldes de forskellige strukturer og bindingstyper af begge substrater, hvorved de adskiller sig i deres bindingsegenskaber til en .ymet. A .o-CM-cellulose er et ikke-naturligt substrat med tilsatte farvestofgrupper, hvilket kan tilføje yderligere til denne effekt. Ved hjælp af Cel8A kunne vi vise, at vores metode giver gyldige data og er egnet til brug i to forskellige etablerede assays for hydrolaser: DNSA og A .o-CM-cellulose.
Contour plot af Cel8A brug af Azo-CM-cellulose
Aktivitet spænder bestemmelse for Celluclast®
ud over at et enkelt enzym, et enzym blanding blev undersøgt. Celluclast is er et almindeligt anvendt kommercielt cellulaseprodukt afledt af Trichoderma reesei. Den består hovedsagelig af cellobiohydrolaser og endo-1,4-Gluc-glucanaser, men indeholder også xylanaser og mindst en β-.ylosidase . Produktmanualen angiver, at de optimale aktiviteter er mellem 50 and C og 60.C og pH 4.,5 og 6,0 . I dette arbejde producerede vi først et konturplot til Celluclast with Med BBG som substrat ved hjælp af dnsa-metoden (Fig. 3). BBG-konturplottet blev verificeret ved hjælp af en standard temperaturkurve (Fig. 4). Resultaterne af temperaturkurven ved pH 5.5 er i overensstemmelse med resultaterne af konturplottet, der viser det samme aktivitetsområde. Måling af separate kurver er imidlertid utilstrækkelig til at beskrive aktiviteten af Celluclast on på BBG. PH-området, hvor en .ymblandingen viser høj aktivitet, er stærkt temperaturafhængig., Jo højere temperaturen er, desto lavere skal pH være for at opnå en høj aktivitet. Omkring 45 °C, Celluclast® er meget aktiv (> 60%) op til en pH-værdi på 6,5, der henviser til, at ved 65 °C, er det meget aktiv kun op til en pH-værdi på 5,0. Beskrivelsen af aktiviteten med to separate kurver er derfor strengt afhængig af den værdi, der er valgt som den statiske parameter. Temperaturgrafer, for eksempel dem, der tages ved de to ekstremer i det angivne pH-interval (4, 5 og 6, 0), bør give markant forskellige resultater. Det samme gælder for pH-grafer taget ved forskellige temperaturer., For at gøre denne effekt tydelig producerede vi standard ph-grafer ved 45, C, 55.C og 65. C (Fig. 5). Disse tre pH-kurver viser, at med stigende temperatur skifter pH-grænsen for høj aktivitet til mere sure pH-værdier. De tre kurver verificerer derved de resultater, der ses i konturplottet. Desuden viser de begrænsningerne ved den konventionelle separate aktivitetsbestemmelse, som i det mindste for Celluclast.for pH-kurverne er afhængig af den valgte temperatur., Brugen af vores konturplotmetode omgår dette problem fuldstændigt ved at måle effekten af temperatur og pH i et trin.
Contour plot af Celluclast® ved hjælp af det DNSA analysen med byg-β-glucan som substrat
Konventionelle temperatur optimal bestemmelse af Celluclast® ved pH 5.0., Temperaturoptimumet for Celluclast on på byg-β-glucan blev bestemt ved pH 5,0. Den konventionelle tilgang viser den maksimale aktivitet omkring 55 °C og er i overensstemmelse med de resultater, der ses i den tilhørende contour plot
Konventionel pH-optimal bestemmelse af Celluclast® på tre temperaturer. Ph-optimumet for Celluclast on på byg-Gluc-glucan blev bestemt ved 45, C, 55, C og 65 C. C., Ved lavere temperaturer kan en .ymet tolerere højere pH-værdier. Dette er i overensstemmelse med den tilhørende contour plot og viser stærk indflydelse af den valgte faste parameter, når bestemmelse af pH og temperatur optimal separat
aktiviteten vifte af Celluclast® på arabinoxylan (AX) (Fig. 6) adskiller sig fra det med BBG som substrat. Aktiviteten forskydes især mod lavere temperaturer, uden høje aktiviteter observeret over 60 C. C., Da Celluclast is er en blanding af flere en .ymer, er det højst sandsynligt, at disse forskellige en .ymer har forskellige egenskaber. Men den aktivitet mønster svarer til, at BBG; for eksempel ved pH 4.5, det enzym blanding er meget aktiv op til næsten 60 °C, der henviser til, at ved pH 6.5, det er kun meget aktiv op til 50 °C. I litteraturen, er den optimale for Celluclast® på hvede opløselige AX var bestemt af en reaktion overflade model (RSM) og er fundet til at være omkring pH 4.4 og 39 °C ., Vores konturplan viser den højeste aktivitet i det samme temperaturområde og ved en lidt højere pH, som stadig er inden for det optimale bestemt af RSM. Mens det optimale er næsten den samme for de to metoder, vores contour plot påfaldende viser den nøjagtige aktivitet Celluclast® på AX inden for hele spektret af de testede betingelser og udviser en mere detaljeret disposition end RSM. Med vores konturplot af Celluclast on på BBG og A.kunne vi vise, at komplekse en .ymblandinger kan analyseres med den foreslåede metode.
Contour plot af Celluclast® ved hjælp af det DNSA analysen med arabinoxylan som substrat
for At vise yderligere alsidigheden af vores aktivitet spænder beslutsomhed, at vi evaluerer dets anvendelse med ekstra underlag og analyser. Aktiviteten af Celluclast on på p-NP-β-d-glucopyranosid blev testet, og konturplottet er vist i fig. 7. Høj aktivitet på dette substrat er begrænset til et ret snævert område mellem pH 4,0 til 5,5 og 55 C. C til 70 C. C., Dette antyder, at kun et eller få en .ymer i Celluclast en-en .ymblandingen sandsynligvis viser aktivitet mod p-NP-β-d-glucopyranosid. P-NP glycosider kan anvendes som substrater til fremstilling af konturplotter. Imidlertid er ikke alle P-NP-glycosider egnede substrater i assayet, da flere af dem viser høj baggrund på grund af ustabilitet (se yderligere fil 5), især når høje temperaturer kombineres med høje pH-værdier.
Contour plot af Celluclast® ved hjælp af p-NP-β-d-glucopyranoside
for At teste anvendelsen af vores metode, der på en naturlig biomasse prøve, vi valgte at bruge et sugerør-baseret substrat. Frigørelse af glucose ved Celluclast was blev påvist ved anvendelse af det kommercielle D-glucose HK-assay (Mega .yme). Hovedkomponenten i halmens cellevæg er cellulose, som er den vigtigste kilde til en .ymatisk frigjort glucose. Konturplottet (Fig., 8) viser derfor overvejende aktiviteten af Celluclast on på krystallinsk cellulose, som er recalcitrant mod en .ymatisk nedbrydning . Den højeste frigivelse af glucose blev observeret på ca pH 4,0 til 5,5 og 40 °C til 60 °C. området med høj aktivitet er derfor mindre bred end fastsat for BBG, der bør tages hensyn til i en proces, der hovedsageligt har til formål at nedbryde cellulose., Ved brug af d-glucose hk og p-NP-β-d-glucopyranosid som alternative assays kunne vi demonstrere tilpasningsevnen af vores metode til i alt fire forskellige og almindeligt anvendte glycosidhydrolaseassays. Brugen af halm viste, at vores metode også er egnet til naturlige substrater af industriel relevans og kan anvendes til vurdering af komplekse processer og substrater. Celluclast shows viser forskellige aktivitetsprofiler på forskellige substrater., Samlet for alle metoder er det derfor afgørende at bestemme pH-og temperaturområdedata for et en .ym med substratet af interesse.
Contour plot af Celluclast® ved hjælp af d-glucose HK-analysen med en halm-baserede naturlige substrat
Overvejelser, når du bruger den metode
Når en contour plot er produceret med den foreslåede metode, der er flere overvejelser, der bør tages i betragtning., Underlaget skal være stabilt, og den målte baggrund reproducerbar over hele området af betingelser i 96-brøndspladen. Dette er en forudsætning, fordi substratkontrollen skal trækkes fra alle værdier forud for omdannelsen til relative aktiviteter, men kan ikke måles direkte på pladen for hver af de 96 betingelser. Flere P-NP glycosidsubstrater kan for eksempel ikke bruges, da de viser en meget temperatur – og pH-afhængig baggrund. Meget præcis pipettering er nødvendig for at give acceptable niveauer af standardafvigelse fra tre eksemplarer., Brug af 96-hoved og 8-kanals pipetter anbefales kraftigt, da de forbedrer nøjagtigheden betydeligt og fremskynder proceduren. Desuden er pladelæser og gradient PCR cycler tekniske krav til at udføre metoden korrekt. Det temperaturområde, hvor metoden kan udføres, kan tilpasses i overensstemmelse med de tekniske egenskaber af den gradient PCR-cykler, som er normalt begrænset til 30 °C eller 40 °C og ofte ikke omfatte værdier under 20 °C., Vi konverterede direkte absorbansen til relativ aktivitet af et en .ym, fordi værdierne alle er på en lineær kalibreringskurve (data ikke vist). Hvis dette ikke er tilfældet, skal aktiviteten først beregnes, for eksempel i U/mg, og disse værdier kan derefter bruges til at fremstille konturplottet. Når man ønsker at fremstille et konturplot for et en .ym, der er stærkt afhængigt af divalente metalioner, skal der anvendes et andet buffersystem, da citratphosphatbaserede buffere komplekse disse ioner.,
Mens RSM tilgange er et uomtvisteligt kraftfuldt værktøj til at vurdere komplekse relationer, for eksempel, forskellige variabler, der påvirker flere faktorer, der bestemmer effekten af kun pH og temperatur på aktivitet ikke er for kompleks til at kunne opnås ved direkte måling. Bestemmelse af de korrekte grænseværdier af modellen kan tage flere tilgange og kan påvirke den resulterende model. RSM-modellen er afledt af kun et lille antal målinger omkring det centrale punkt i en .ymets aktivitet, og nøjagtigheden over for de faktiske eksperimentelle værdier skal testes bagefter., Den samlede opløsning af RSM er derfor lavere end opnået med vores metode, hvilket gør det vanskeligt at se aktivitetseffekter som vist for Celluclast.ved højere temperaturer og/eller pH-værdier. Vores metode kræver ikke evnen til at designe komplekse statistiske modeller og kan udføres med minimale og relativt standard tekniske krav. En ulempe både vores metode og RSM-andel er, at direkte visualisering af standardafvigelsen inden for det tredimensionelle plot ikke er muligt., Vores metode tillader dog beregning af standardafvigelsen for hvert enkelt datapunkt. De fleste RSM-modeller bestemmer standardafvigelsen for hele modellen kun ud fra data fra modelens centrale datapunkt, mens de andre datapunkter kun måles .n gang . Standardafvigelserne er naturligt højere ved grænserne af et en .yms aktivitet og illustrerer en stærk indvirkning på aktiviteten inden for en lille ændring af forholdene. Omkring det optimale og inden for områder med ingen eller lav aktivitet er afvigelser markant lavere., Da den foreslåede metode resulterer i et komplet faktordatasæt, vil det være muligt at beregne en statistisk model, hvis det er nødvendigt til yderligere analyse. Den afledte statistiske model ville basere sig direkte på eksperimentelle data, men er et yderligere trin, som ikke bør være nødvendigt for standardanvendelser af metoden.
Sammenfattende er let vurdering af et en .yms eller en en .ymblandings egnethed til en kombination af procesparametre af afgørende betydning, når man designer bioteknologiske processer i enten laboratorie-eller industriel skala., Temperatur og pH er to af de vigtigste procesfaktorer, der påvirker en .ymaktiviteten. Konventionelle metoder til at teste effekten af disse faktorer på enzymer er baseret på den antagelse, at der er en to-dimensionelle sammenhæng mellem temperatur og aktivitet samt pH og aktivitet. I modsætning hertil bestemmer nye tilgange forholdet i tredimensionelt stof, men er statistikbaserede, komplekse at designe, og deres nøjagtighed til de faktiske data kan variere., Metoden introduceret her tillader derimod hurtig og nem bestemmelse af den effekt, som temperaturen og pH har på en .ymets aktivitet samtidig ved hjælp af 96-brønds plader, multikanal pipetter og en gradient PCR cycler. Med dette grundlæggende tekniske udstyr er det muligt at fremstille konturplot af pH, temperatur og aktivitet, der er baseret direkte på eksperimentelle data. Metoden blev testet for flere udbredte glycosidhydrolaseassays samt model-og komplekse substrater.